張春婷,邱智東,李博文,鄒 睿,劉欣蔚,董雪蓮
(長春中醫(yī)藥大學(xué),長春 130117)
滋益顆粒為長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方,該方由生地黃[1-3]、牡丹皮、浙貝母、北沙參、金蕎麥、丹參、佛手、黃芪等8 味中藥經(jīng)現(xiàn)代工藝提取制成的一種復(fù)方制劑,具有增強免疫力的功效。本研究通過正交實驗對提取工藝進行優(yōu)化,對輔料及粘合劑進行單因素考察,參考2015 版《中華人民共和國藥典》方法對處方中的部分中藥進行定性鑒別,為今后的進一步研究提供參考。
1.1 試藥 滋益顆粒(批號:20192001、20192002、20192003、20192004、20192005、20192006、20192007、20192008、20192009、20192010);黃芪甲苷對照品(批號:110781-201616)、黃芪對照藥材(批號:Y19D8H51060)、佛手對照藥材(批號:Y12A9H58681)、丹參酮Ⅱa 對照品(批號:110766-201721)、丹酚酸B 對照品(批號:111562-201716)、丹參對照藥材(批號:120923-201615)、地黃對照藥材(批號:121180-201506)、牡丹皮對照藥材(批號:121490-201603)、毛蕊花糖苷對照品(批號:111530-201713)。實驗中用到的固體試劑為化學(xué)純,所用到的液體試劑除色譜甲醇及乙腈外均為分析純。
1.2 儀器設(shè)備 AgiLent1260 高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器);ZF-2 型紫外儀,上海安亭;MS105DU型十萬分之一天平;TG328A 型分析天平;HHS 型恒溫水浴鍋,江蘇常熟;DZF-6090 型真空干燥箱,上海一恒。
2.1 提取工藝的優(yōu)化
2.1.1 正交實驗設(shè)計 選定煎煮時間、煎煮次數(shù)和加水量3 因素,每個因素取3 個水平。按L9(34)正交試驗表進行正交試驗[4-5],確定最優(yōu)提取工藝,水煎煮因素水平表見表1,水煎煮法提取工藝正交試驗結(jié)果見表2,方差分析見表3。
表1 水煎煮因素水平表
表2 水煎煮法提取工藝正交試驗結(jié)果
表3 方差分析
2.1.2 優(yōu)選提取工藝 根據(jù)直觀分析和方差分析結(jié)果,A 因素水平變化對試驗結(jié)果影響較小,B 和C 因素水平變化對試驗結(jié)果有顯著影響,確定水煎煮法提取最佳工藝是A1B2C2,即水煎藥材加即8 倍量水,提取2次,每次1 h。
2.1.3 優(yōu)選提取工藝的驗證試驗 按處方2 倍量比例稱取藥材,按優(yōu)選的最佳水煎煮工藝條件提取,重復(fù)驗證3 次,測定驗證樣品中平均總毛蕊花糖苷含量為45.38 mg,RSD=1.13 %,說明重現(xiàn)性良好,確定優(yōu)選出的工藝條件為最佳工藝,見表4。
2.2 成型工藝優(yōu)選
2.2.1 輔料的選擇 單因素考察淀粉、糊精、乳糖3種輔料[6-9]。糊精成型性好、價格低廉,選擇糊精作為輔料,見表5。
2.2.2 潤濕劑的選擇 對乙醇進行考察,乙醇濃度為75%時,顆粒軟材的軟硬度適宜,選擇75 %乙醇作為潤濕劑,見表6。
2.3 滋益顆粒的定性鑒別
2.3.1 黃芪 TLC 鑒別 參考2015 版《中國藥典》一部黃芪顆粒項下的薄層色譜鑒別方法[10-11],取10 g 滋益顆粒精細研磨并放入錐形瓶中,加入25 mL 蒸餾水,超聲0.5 h,過濾,濾液用飽和正丁醇提取2 次,每次25 mL。合并提取液,濃氨水洗滌2 次,每次30 mL,蒸發(fā)正丁醇。殘渣加正丁醇1 mL,得供試品溶液。取黃芪對照藥材1 g,煮0.5 h,冷卻、過濾,同法制備對照藥材溶液。取黃芪甲苷對照品適量,加甲醇得2 mg·mL-1對照品溶液。相同工藝制備缺黃芪的滋益顆粒,取10 g同法制成陰性對照溶液。以上溶液分別點10 μL 于同一硅膠G 薄層板。用氯仿—甲醇—水(13:7:2)的下層溶液為展開劑,展開、取出吹干,噴10%硫酸乙醇溶液,加熱至斑點清晰。供試品色譜中,相同顏色斑點與對照藥材色譜、對照品色譜相同位置顯出;無陰性干擾,見圖1。
表4 工藝驗證實驗結(jié)果
表5 輔料的考察結(jié)果
表6 潤濕劑的考察結(jié)果
2.3.2 佛手 TLC 鑒別 參考2015 版《中國藥典》一部佛手項下的薄層色譜鑒別方法[10]。取出5 g 滋益顆粒并精細研磨,加無水乙醇10 mL,超聲20 min,過濾,濾液蒸干。殘渣加0.5 mL 無水乙醇,為供試品溶液。取佛手對照藥材1g,同法制備對照藥材溶液。相同工藝制備缺佛手滋益顆粒,取5 g 同法得陰性對照溶液。以上溶液分別點10 μL 于同一硅膠G 薄層板。用展開劑環(huán)己烷—乙酸乙酯(3:1)展開,取出干燥,置365 nm 紫外光下檢視。供試品色譜中,相同顏色的熒光斑點與對照藥材色譜對應(yīng)位置上顯示;無陰性干擾,見圖2。
圖1 黃芪薄層色譜鑒別圖
圖2 佛手薄層色譜鑒別圖
2.3.3 丹參TLC 鑒別 參照2015 版《中國藥典》一部丹參項下的薄層色譜鑒別方法[10]。取滋益顆粒1 g,研磨成粉末,加乙醇5 mL,超聲15 min,離心,取上清液作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1 g,同法制成對照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA 對照品、丹酚酸B對照品,加乙醇制成0.5 mg·mL-1和1.5 mg·mL-1的混合溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述三種溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G 薄層板上,使成條狀,以三氯甲烷—甲苯—乙酸乙酯—甲醇—甲酸(6:4:8:1:4)為展開劑,展開,展至約4 cm,取出,晾干,再以石油醚(60~90℃)—乙酸乙酯(4:1)為展開劑,展開,展至約8 cm,取出,晾干,分別在日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點或熒光斑點,見圖3。
圖3 丹參薄層色譜鑒別圖
2.3.4 地黃TLC 鑒別 取滋益顆粒21 g 研磨成細粉,加入25 mL 環(huán)己烷,將混合物在室溫(25 ℃)超聲2 h,放置12 h。過濾,棄去濾液,濾渣風(fēng)干。加25 mL 乙酸乙酯,并在室溫(25 ℃)條件下超聲1 h 提取充分。取出后過濾,置于蒸發(fā)皿中濃縮濾液,并蒸發(fā)至干,用1 mL 氯仿溶解后,得到對照藥材溶液。取1 g 生地黃對照藥材,并使用以上方法制備供試品溶液。相同工藝制備缺生地黃的滋益顆粒,取21 g 同法得陰性對照溶液。以上溶液分別點10 μL 于同一硅膠G薄層板,用展開劑正己烷—丙酮—乙酸乙酯(10:2:1)展開。取出干燥,噴5%硫酸香草醛乙醇溶液,105 ℃烘至斑點清晰[12-13]。供試品色譜中,相同顏色斑點在與對照藥材色譜相應(yīng)位置顯出,陰性無干擾,見圖4。
2.3.5 牡丹皮TLC 鑒別 取滋益顆粒25 g,加乙醚25 mL,超聲0.3 h,過濾,蒸干濾液。加1 mL 丙酮,得供試品溶液。取牡丹皮對照藥材1 g,同法制備對照藥材溶液。相同工藝制備缺牡丹皮滋益顆粒,稱取10 g 同法得陰性對照溶液。以上溶液分別點10 μL于同一硅膠G 薄層板,用展開劑環(huán)己烷—乙酸乙酯(3:1)展開,取出吹干,噴鹽酸酸性5%三氯化鐵乙醇溶液,加熱至斑點清晰。供試品色譜中相同顏色的斑點在與對照藥材色譜相應(yīng)位置顯示[14-15],無陰性。見圖5。
圖4 地黃薄層色譜鑒別圖
圖5 牡丹皮薄層色譜鑒別圖
滋益顆粒是具有免疫調(diào)節(jié)功能[22-23],解決癌癥患者免疫力低下問題,對免疫力低下患者的康復(fù)具有重大意義。本實驗通過正交實驗,優(yōu)化滋益顆粒提取工藝,通過TLC 法對黃芪、佛手、丹參、地黃、牡丹皮5 味中藥進行定性鑒別,專屬性強,重新性較好,初步建立該顆粒劑的質(zhì)量標準,為后續(xù)試驗研究提供參考。