張 禹，黃秋思，劉 定，楊沈秋

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001）

肝纖維化（Hepatic fibrosis,HF）是指肝臟遭到病毒性、代謝性、炎性和中毒性等諸多致病原侵襲，致使肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起肝臟組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度增生與異常沉積，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟正常生理結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變的病理過程，這種病理損害是多種慢性肝病向肝硬化進(jìn)展的共同反應(yīng)[1]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，肝纖維化早期是一種可逆性病變[2]，并且在臨床患者中，這一結(jié)論也得到證實(shí)[3-4]。因此，及時(shí)有效的抗肝纖維化治療對肝病預(yù)后具有重要意義[5]。

以病理性血管新生為特點(diǎn)的肝竇毛細(xì)血管化是肝纖維化進(jìn)程中的重要病理表現(xiàn)。研究證明，低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被認(rèn)為在血管生成和重構(gòu)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。本實(shí)驗(yàn)將通過觀察疏肝化瘀益氣法為指導(dǎo)的軟肝散對大鼠肝纖維化過程中HIF-1α、VEGF mRNA 表達(dá)的影響，并探究其防治肝纖維化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

健康的8～10 周齡清潔級雄性SD 大鼠46 只，體質(zhì)量（200±20）g，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，自由飲水飲食，且控制室內(nèi)溫度為（22±1）℃、相對濕度60%～80%，正常飼養(yǎng)適應(yīng)7 d 后開始實(shí)驗(yàn)。軟肝散組成：黃芪、柴胡、丹參、炙鱉甲、生牡蠣。德國萊卡2135 型切片機(jī)，美國moticam3000 顯微攝影成像系統(tǒng)，Nikon Eclipse TE2000-E 倒置顯微鏡，HITACHI H-7650 透射電子顯微鏡，F(xiàn)resco 低溫冷凍離心機(jī)，電泳儀，Centrifuge 5415D 離心機(jī)，NC 膜，0.45 μm 孔徑，ABI7500 熒光定量PCR 儀，無菌豬血清，BCA 蛋白定量試劑盒，麗春紅染色液，蛋白酶抑制劑，山羊抗兔IgG（H+L），HRP，TRNzol 總RNA 提取試劑。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立模型 雄性清潔級SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，給予腹腔注射未滅活的豬血清，每次0.5 mL/只，2 次/周，連續(xù)注射8 周。

2.2 動物分組 健康雄性清潔級SD 大鼠46 只，隨機(jī)分為空白組4 只，軟肝散干預(yù)組8 只，模型組34 只。

2.3 給藥方法 空白組、模型組，給予生理鹽水灌胃，1 次/d，至8 周末；軟肝散干預(yù)組自造模開始即給予軟肝散生藥水煎劑灌胃，1 次/d。并于第2、4、6、8 周，分別處死2 只大鼠取材，造模結(jié)束后全部處死。

2.4 標(biāo)本采集 取材前大鼠禁食不禁水12 h，然后用4%水合氯醛按10 mL/kg 劑量腹腔注射，麻醉后固定解剖。取出大鼠肝臟，觀察肝臟的顏色、質(zhì)地，切取約2 mm厚的肝組織放入10%中性福爾馬林液中固定，常規(guī)制備肝組織切片，切片厚度約4 μm；另取1 mm3肝臟組織放入2.5%的戊二醛固定液中固定，于4 ℃冰箱保存；再分別取肝臟組織100 g 于液氮中速凍，再保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

2.5 檢測指標(biāo)及方法 HE、Masson 染色病理組織學(xué)觀察，RT-PCR 方法、Western blot 法檢測HIF-1α、VEGF 蛋白定量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗(yàn)，等級資料比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 HE 染色病理組織學(xué)觀察 見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織的病理形態(tài)變化（HE 染色，×200）

經(jīng)HE 染色分析可見，空白組肝細(xì)胞板排列規(guī)整，胞質(zhì)胞核染色清晰，未見炎細(xì)胞浸潤和充血。模型組肝組織纖維化，并被增生纖維組織分割包繞成不同的區(qū)域，胞質(zhì)胞核界限不清，胞質(zhì)染色不均勻，肝細(xì)胞腫脹，局部深染或呈現(xiàn)脂肪樣變性或液化性壞死灶；細(xì)胞核固縮或呈現(xiàn)分裂；散見炎細(xì)胞浸潤或局部充血。軟肝散干預(yù)組隨著給藥時(shí)間的增加，各時(shí)間點(diǎn)肝組織病理表現(xiàn)均有不同程度的減輕，2 周時(shí)病理變化主要以肝細(xì)胞脂肪樣變性為主，有輕度的纖維化，4 周、6 周、8周時(shí)肝板排列逐漸規(guī)整，胞質(zhì)胞核染色清晰，水腫明顯減輕，有少量的炎細(xì)胞存在，未見明顯的纖維組織增生。

3.2 Masson 染色病理組織學(xué)觀察 見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織的病理形態(tài)變化（Masson 染色，×200）

經(jīng)Masson 染色分析可見，空白組肝細(xì)胞間可見少許的淺藍(lán)色，面積很少且著色淡，主要分布在大的血管周圍。模型組肝細(xì)胞間可見大量的深藍(lán)色，且肝細(xì)胞周邊也呈現(xiàn)藍(lán)色，分布廣泛且著色深，表明肝纖維化明顯。軟肝散干預(yù)組：給藥預(yù)防組隨著給藥時(shí)間延長，肝臟藍(lán)色的區(qū)域和深淺逐漸減少和減弱，表明肝纖維化程度逐漸減輕。尤以8 周組最為明顯。

3.3 RT-PCR 方法檢測HIF-1α、VEGF 結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，軟肝散干預(yù)組（2周）、軟肝散干預(yù)組（4 周）、軟肝散干預(yù)組（6 周）、軟肝散干預(yù)組（8 周）大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且隨著干預(yù)給藥時(shí)間的延長，HIF-1α、VEGF 蛋白的相對表達(dá)量逐漸降低，具體見表1。

表1 Real Time PCR 檢測結(jié)果（）

表1 Real Time PCR 檢測結(jié)果（）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.4 Western blot 法檢測HIF-1α、VEGF 蛋白定量 首先能檢測到特異的陽性條帶，內(nèi)參檢測的檢測結(jié)果為正常陽性結(jié)果。采用Total Lab Quant V11.5（Newcastle upon Tyne,UK）軟件掃描灰度值，統(tǒng)計(jì)分析蛋白的相對表達(dá)量。與空白組比較，模型組大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF 蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，軟肝散干預(yù)組（2周）、軟肝散干預(yù)組（4 周）、軟肝散干預(yù)組（6 周）、軟肝散干預(yù)組（8 周）大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且隨著干預(yù)給藥時(shí)間的延長，HIF-1α、VEGF 蛋白的相對表達(dá)量逐漸降低，具體見圖3，表2。

圖3 各組大鼠肝組織HIF-1α、VEGF 蛋白的表達(dá)（）

表2 Westem bolt 檢測HIF-1α、VEGF 蛋白相對表達(dá)量結(jié)果（）

表2 Westem bolt 檢測HIF-1α、VEGF 蛋白相對表達(dá)量結(jié)果（）

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01

4 討論

肝臟血管新生與肝纖維化的發(fā)生機(jī)制有一定的相關(guān)性，在肝纖維化的病人和實(shí)驗(yàn)動物模型的肝臟，都發(fā)現(xiàn)明顯的肝竇毛細(xì)血管化[7-8]。肝竇是肝血流和肝細(xì)胞間多種代謝物質(zhì)交換的主要場所，毛細(xì)血管增生可以使肝細(xì)胞與血漿成分的交換出現(xiàn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞缺血缺氧，加重細(xì)胞損傷及肝星狀細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積。

肝臟受到病原體侵襲后，肝臟會啟動創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，由于細(xì)胞迅速擴(kuò)增，需要大量的血流及營養(yǎng)供應(yīng)，遂導(dǎo)致肝組織局部缺氧。缺氧可引起肝內(nèi)血管重構(gòu)，已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)肝臟缺氧區(qū)域是肝臟血管新生發(fā)生的主要位置。低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）是一種在低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控低氧反應(yīng)基因的表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞對低氧的應(yīng)答，使組織細(xì)胞對缺血、缺氧作出適應(yīng)性反應(yīng)[9]。大量研究證明，在與缺氧相關(guān)疾病如腫瘤、感染、炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷等過程中，HIF-1α 作為參與機(jī)體應(yīng)對缺氧代謝的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在細(xì)胞代謝和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[10-11]。

在組織缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的參與下，組織缺氧刺激肝臟細(xì)胞上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)。研究證明，VEGF可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞成活和增殖，而作為VEGF 的上游調(diào)控因子，HIF 不僅能促進(jìn)其表達(dá)和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，還能增加VEGFmRNA 的穩(wěn)定性，促進(jìn)形成新血管，改善局部組織血供。HIF-1α 及其下游因子作為肝纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，有望成為緩解肝纖維化的有效途徑[12-13]。

肝纖維化屬于中醫(yī)“脅痛”范疇，從其病理特征來看，則屬于肝絡(luò)病范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝絡(luò)是指分布在肝臟區(qū)域中小血管、微血管、微循環(huán)，能夠濡養(yǎng)肝臟并調(diào)節(jié)肝臟代謝。這與肝竇的結(jié)構(gòu)與生理功能不謀而合。肝絡(luò)從經(jīng)脈別出，因與肝血、肝氣相通，故可分為血絡(luò)和氣絡(luò)。血絡(luò)如肝竇，承載和運(yùn)輸血液，氣絡(luò)如肝竇內(nèi)的細(xì)胞，具有維持血絡(luò)結(jié)構(gòu)和提供動力的功能。由于肝竇與肝絡(luò)密不可分的聯(lián)系，從“絡(luò)病”論治肝纖維化也成為一個(gè)重要的方向[14]。中醫(yī)藥抗肝纖維化具有明顯優(yōu)勢[15]，對單味藥及復(fù)方的研究頗多[16-18]。軟肝散是治療肝硬化腹水的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要由黃芪、柴胡、丹參、炙鱉甲、生牡蠣等組成，有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)、疏肝益氣之效。在臨床運(yùn)用多年，取得較好療效[19-20]。

以疏肝化瘀益氣法為指導(dǎo)的軟肝散可以緩解肝纖維化的病理改變，軟肝散可能通過下調(diào)HIF-1α、VEGF表達(dá)，抑制HIF-1α、VEGF 蛋白的過表達(dá)，調(diào)控HIF-1α/VEGF 信號通路抑制肝組織纖維化進(jìn)程，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。