,2,3,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院,天津 300457;2.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院,食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津 300457;3.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心,天津 300457)

隨著我國居民生活水平的不斷提升,傳統(tǒng)的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,高脂、高糖和缺乏運動等不健康的生活模式導致高脂血癥及其并發(fā)癥的發(fā)病率越來越高且日益低齡化。就高膽固醇血癥而言,從2002～2012年間,我國居民的患病率就增加了4倍[1-2]。目前市場上主要用于降脂的藥物為他汀類藥物,部分高脂血癥的患者由于其副作用而無法使用他汀類藥物進行治療[3-4],另外隨著我國居民對健康意識的提高,效果好、使用更安全的可用于預防降血脂的藥食同源的天然產(chǎn)物更受大家的關(guān)注和青睞[5-6]。

匙羹藤(Gymnemasylvestre),蘿藦科匙羹藤屬,是一種傳統(tǒng)民間草藥,在印度以‘gurmar’(糖分殺手)而聞名,原產(chǎn)于印度中西部,也分布于非洲、澳大利亞和中國的熱帶森林中,具有降糖降脂[7-9]、控制體重[10]、抗齲齒[11]、抑菌[12-13]、免疫調(diào)節(jié)[14]等作用,被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品等行業(yè)[15-16]。匙羹藤酸是從匙羹藤中分離出來的三萜皂苷類物質(zhì)混合物[17-18],具有抑制小腸對油酸的吸收[19]、抑制三磷酸甘油醛脫氫酶活性[20]、抑制蛋白質(zhì)合成[21]、抑制α葡萄糖苷酶[22]、抑制鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1活性[23]等多種生物活性,被廣泛用于治療由代謝紊亂引起的疾病,是匙羹藤降糖降脂的主要活性成分[24]。目前已經(jīng)有很多的研究證明匙羹藤酸具有調(diào)節(jié)血脂功效,Renga等[17]通過體外實驗,發(fā)現(xiàn)匙羹藤酸I可以抑制高脂細胞內(nèi)脂類的積累,但是對匙羹藤酸調(diào)節(jié)血脂活性及機理的研究鮮有報導。因此本實驗就匙羹藤酸調(diào)節(jié)高脂倉鼠血脂水平及其機制進行了研究,為匙羹藤酸調(diào)節(jié)血脂的保健品的開發(fā)提供提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

匙羹藤酸(純度75%)、倉鼠(Hamster)羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)ELISA檢測試劑盒、膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)ELISA檢測試劑盒、?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)ELISA檢測試劑盒 上海源葉生物科技有限公司;總膽固醇(T-CHO)測試盒、甘油三酯(TG)測試盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測試盒 南京建成生物工程研究所;SPF級雄性倉鼠 40只,體重(100±10) g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,實驗動物質(zhì)量合格證明編號:11401500033320,許可證號為SCXK(京)2014-0006;玉米淀粉 北京科澳協(xié)力飼料有限公司;基礎(chǔ)飼料和高脂飼料 均由本實驗室自制,基礎(chǔ)飼料配方配方為玉米淀粉(50.80%)、酪蛋白(24.20%)、白砂糖(11.90%)、豬油(5.00%)、礦物質(zhì)混合物(4.00%)、維生素混合物(2.00%)、明膠(2.00%)、DL-蛋氨酸(0.10%)；高脂飼料配方為玉米淀粉(40.70%)、酪蛋白(24.20%)、白砂糖(11.90%)、豬油(15.00%)、膽固醇(0.10%)、礦物質(zhì)混合物(4.00%)、維生素混合物(2.00%)、明膠(2.00%)、DL-蛋氨酸(0.10%)[25]。

Multiskan FC酶標儀 美國Thermo Fisher公司;MICRO 17R臺式冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;ML204電子天平 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;CKX41倒置相差熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 飼養(yǎng)條件及實驗倉鼠分組 實驗倉鼠飼養(yǎng)于天津科技大學清潔級動物飼養(yǎng)房中,室內(nèi)溫度為(22±2) ℃,濕度為50%～60%,12 h光照、明暗交替,并讓其自由飲食和飲水。

選用健康雄性倉鼠40只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周之后根據(jù)體重進行隨機分組,分為5組,每組8只,分別為正常對照組(NC)、模型對照組(MC)、匙羹藤酸低劑量組(L)、匙羹藤酸中劑量組(M)、匙羹藤酸高劑量組(H)。

1.2.2 各個組別的灌胃方式 匙羹藤酸的灌胃方式如表1所示。

表1 各組倉鼠的灌胃方式Table 1 Gastric administration of hamsters in each group

1.2.3 樣品采集 在0、4、8周周末對各組倉鼠進行眼眶靜脈叢取血,采血前禁食不禁水12 h,在實驗周的第8周周末禁食不禁水12 h后處死,處死前稱其體重,股動脈取血,頸椎脫臼致死,快速分離肝臟、腎周脂肪、睪丸脂肪,后用生理鹽水清洗,濾紙吸干,并稱其質(zhì)量。

1.2.4 指標的測定

1.2.4.1 倉鼠體重的測定 實驗周期內(nèi)每天觀察倉鼠生長狀況(倉鼠的毛色、進食、排便及活動等情況),每兩周稱量1次體重。

1.2.4.2 倉鼠肝臟臟器指數(shù)和脂肪系數(shù)的測定 分離出倉鼠的肝臟、雙腎周脂肪組織和睪丸周脂肪組織,用生理鹽水清洗,濾紙吸干后,稱重量,肝臟臟器指數(shù)按式(1)計算,脂肪系數(shù)按式(2)計算。

式(1)

式(2)

1.2.4.3 倉鼠血清中血脂水平的測定 將第0、4、8周周末采集的血液樣本,25 ℃放置2 h后,3000 r/min,4 ℃離心10 min,分離血清,測定各組倉鼠血清中TG、TC和HDL-C水平,并計算出non-HDL-C水平。具體檢測方法按照南京建成生物研究所的總膽固醇(T-CHO)測試盒、甘油三酯(TG)測試盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒說明書進行。non-HDL-C按式(3)計算。

Cnon-HDL-C=CTC-CHDL-C

式(3)

式中，CTC、CHDL-C、Cnon-HDL-C分別表示TC、HDL-C、non-HDL-C的含量，mmol/L。

1.2.4.4 倉鼠血清中肝損傷指標的測定及肝臟切片染色觀察 將第8周周末采集的血液樣本,25 ℃放置2 h后,3000 r/min,4 ℃離心10 min,分離血清,按南京建成生物研究所的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測試劑盒測定各組倉鼠血清中AST、ALT水平;采用HE染色法,取1 mm3肝小葉立方塊[25],用4%的甲醛固定液固定、脫水、石蠟包埋、切片脫蠟、蘇木精染色、伊紅染色、切片脫水,染色切片在光學顯微鏡下進行觀察和圖像分析,觀察肝臟的病理組織學變化。

1.2.4.5 倉鼠血清中膽固醇調(diào)控相關(guān)酶活的測定 將第8周股動脈采取的血樣樣本,25 ℃放置2 h后,3000 r/min離心10 min,離心后迅速分離血清,測定各組倉鼠血清中膽固醇調(diào)控相關(guān)酶HMGCR、CYP7A1、ACAT水平。具體檢測方法按照上海源葉生物科技有限公司倉鼠(Hamster)羥甲基式二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)ELISA檢測試劑盒、倉鼠(Hamster)膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)ELISA檢測試劑盒、倉鼠(Hamster)?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)ELISA檢測試劑盒進行檢測。

1.2.4.6 倉鼠肝臟HMGCR酶活的測定 實驗倉鼠處死后迅速分離肝臟、小腸,取0.1 g肝臟組織(小腸),用冰冷的生理鹽水漂洗,除去血液,濾紙擦拭后稱取0.1 g加入勻漿器中,再加入0.9 mL冷的無菌生理鹽水于冰水浴條件下充分研磨,使組織勻漿化,隨后轉(zhuǎn)移勻漿液至1.5 mL離心管中,2000 r/min、4 ℃離心10～15 min,取適量上清液,按上海源葉生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫試劑盒測定各組倉鼠肝臟中膽固醇調(diào)控相關(guān)酶HMGCR酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2017作圖,SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)以Mean±SD表示,多組間采用單因素方差分析,若方差齊時采用LSD檢驗,方差不齊性時采用Tamhane’s T2檢驗,P<0.05表示兩組之間具有顯著性差異,P<0.01表示兩組之間具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 匙羹藤酸對倉鼠體重的影響

在實驗周期,每兩周對實驗倉鼠的體重進行稱量一次,其體重變化見圖1。如圖1所示,灌胃前,各組倉鼠之間的體重無顯著性差異(P>0.05),隨著倉鼠鼠齡的增長,各組倉鼠體重都有所增長,但是在整個實驗期間,模型對照組與正常對照組倉鼠體重無顯著性差異(P>0.05),說明高脂飲食對倉鼠的體重均無顯著性影響(P>0.05),這與王軼菲的玉米油甾醇對高脂高膽固醇膳食倉鼠膽固醇代謝調(diào)控及腸道菌群的影響中的結(jié)果一致[26],匙羹藤酸劑量組與模型對照組倉鼠體重無顯著性差異(P>0.05),說明匙羹藤酸對倉鼠體重無顯著性影響(P>0.05)。

圖1 匙羹藤酸對倉鼠體重的影響Fig.1 Effect of gymnemic acid on the body weight of hamster

2.2 匙羹藤酸對倉鼠臟器指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響

如表2所示,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠的肝臟的臟器指數(shù)有極顯著差異(P<0.01),說明高脂膳食會導致倉鼠肝臟腫大;正常組、模型組和劑量組的附睪脂肪系數(shù)無明顯差異，說明匙羹藤酸以及高脂飲食對附睪脂肪系數(shù)無顯著性影響，與模型對照組相比,匙羹藤酸劑量組倉鼠的肝臟的臟器指數(shù)有顯著的下降(P<0.05),下降率分別為6.12%、12.24%、17.69%,表明匙羹藤酸對高脂膳食倉鼠引起的肝臟腫大有一定的緩解作用。

表2 匙羹藤酸對倉鼠臟器指數(shù)和脂肪系數(shù)的影響Table 2 Effects of gymnemic acid on the organ index and fat index of hamster

注:#模型對照組與正常對照組比較有顯著差異,P<0.05;##模型對照組與正常對照組比較有極顯著差異,P<0.01;*匙羹藤酸劑量組與模型對照組比較有顯著差異,P<0.05;**匙羹藤酸劑量組與模型對照組比較有極顯著差異,P<0.01;圖2～圖6、圖8～圖11同。

與正常對照組相比,模型對照組倉鼠的腎周脂肪系數(shù)極顯著上升(P<0.01),表明高脂飲食易引起倉鼠腎周脂肪的積累;與模型對照組相比,匙羹藤酸劑量組倉鼠的腎周脂肪系數(shù)均極顯著下降(P<0.01),且匙羹藤酸低、中、高劑量組下降率分別為23.08%、23.08%和28.72%,說明匙羹藤酸可以抑制高脂膳食倉鼠體內(nèi)脂肪的積累。

2.3 匙羹藤酸對倉鼠血清中血脂水平的影響

2.3.1 匙羹藤酸對倉鼠血清中TG水平的影響 由圖2可知,灌胃前,各組倉鼠之間的血清中的TG水平無顯著性差異(P>0.05),從第4周開始,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的TG水平極顯著上升(P<0.01),表明高脂飼料喂養(yǎng)能夠極顯著性提高倉鼠血清中TG的水平(P<0.01);與模型對照組相比,匙羹藤酸各劑量組倉鼠血清中的TG極顯著下降(P<0.01),下降率分別為39.67%、45.99%、53.15%,說明匙羹藤酸可以有效抑制高脂膳食倉鼠血清中TG水平升高。

圖2 匙羹藤酸對倉鼠血清中TG水平的影響Fig.2 Effects of gymnemic acid on the levels of TG in serum of hamster

2.3.2 匙羹藤酸對倉鼠血清中TC水平的影響 如圖3所示,灌胃前,各組倉鼠血清中TC水平無顯著性差異(P>0.05);從第4周開始,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的TC水平呈極顯著上升(P<0.01);與模型對照組相比,匙羹藤酸各劑量組倉鼠血清中的TC開始下降,下降程度不同,第4周下降率分別為11.28%、23.44%、30.27%,說明匙羹藤酸可以抑制高脂膳食倉鼠血清中TC的升高。

圖3 匙羹藤酸對倉鼠血清中TC水平的影響Fig.3 Effects of gymnemic acid on the levels of TC in serum of hamster

2.3.3 匙羹藤酸對倉鼠血清中HDL-C水平的影響 如圖4所示,灌胃前,各組倉鼠之間的血清中的HDL-C水平無顯著性差異(P>0.05),從第4周開始,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的HDL-C水平極顯著性提高(P<0.01),這可能是由于高血脂倉鼠體內(nèi)血脂水平過高而引起自身體內(nèi)出現(xiàn)了一定程度上的調(diào)節(jié)作用。與模型對照組相比,匙羹藤酸各劑量組倉鼠血清中的HDL-C均無顯著性差異(P>0.05),表明匙羹藤酸并不能提高倉鼠體內(nèi)HDL-C水平。

圖4 匙羹藤酸對倉鼠血清中HDL-C水平的影響Fig.4 Effects of gymnemic acid on the levels of HDL-C in serum of hamster

2.3.4 匙羹藤酸對倉鼠血清中non-HDL-C水平的影響 由圖5可知,灌胃前,各組倉鼠之間的血清中的non-HDL-C水平無顯著性差異(P>0.05),從第4周開始,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的non-HDL-C水平極顯著性升高(P<0.01)。表明高脂飼料喂養(yǎng)能夠明顯提高倉鼠血清中non-HDL-C的水平;與模型對照組比,匙羹藤酸中、高劑量組倉鼠血清中的non-HDL-C水平極顯著性下降(P<0.01)。表明匙羹藤酸可以抑制non-HDL-C水平的升高,對高脂血癥有緩解作用。

圖5 匙羹藤酸對倉鼠血清中non-HDL-C Fig.5 Effects of gymnemic acid on the levels of non-HDL-C in serum of hamster

2.4 匙羹藤酸對倉鼠肝臟的保護作用

脂肪肝是最常見的肝功能異常的一種疾病,高血脂會導致肝脂肪性病變,檢測血清中ALT、AST的含量是檢驗肝損傷程度的一種常用方法,并且在反映其損傷程度時AST 最為敏感[27]。

2.4.1 匙羹藤酸對倉鼠血清中ALT、AST的影響 由圖6可知,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中ALT和AST活力均極顯著性升高(P<0.01),說明高脂飲食會導致倉鼠肝臟細胞損傷;與模型對照組相比,匙羹藤酸劑量組倉鼠血清中ALT、AST活力極顯著降低(P<0.01),說明匙羹藤酸可以減緩高脂膳食造成的倉鼠肝損傷。

圖6 匙羹藤酸對倉鼠血清中的ALT和 AST水平的影響Fig.6 Effect of gymnemic acid on serum ALT and AST levels in serum of hamster

2.4.2 肝組織形態(tài)學分析 如圖7所示,正常對照組倉鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝竇清晰可見,細胞排列緊密,整齊有序,邊緣界限明顯,核仁明顯,細胞質(zhì)均勻且豐富;模型對照組倉鼠肝細胞排列松散無序,細胞質(zhì)中出現(xiàn)了大量的脂肪滴空泡,大小不一,將細胞核擠壓至細胞邊緣,肝細胞損傷嚴重,出現(xiàn)了嚴重的脂肪肝;與模型對照組相比,匙羹藤酸低、中、高劑量組的倉鼠肝臟中肝小葉結(jié)構(gòu)相對完整,細胞排列相對緊密整齊,細胞質(zhì)中的脂肪滴空泡明顯減少,細胞質(zhì)相對豐富,倉鼠的脂肪肝變性程度有所緩解,并且呈劑量依賴關(guān)系。這一結(jié)果與肝臟的臟器指數(shù)和血清中的ALT、AST水平的結(jié)果一致,表明匙羹藤酸可以在一定程度上減緩肝臟細胞脂肪變性,具有預防脂肪肝形成作用。

圖7 匙羹藤酸對倉鼠肝臟組織切片的影響(100×)Fig.7 Effects of gymnemic acid on liver slices in hamsters(100×)

2.5 匙羹藤酸對倉鼠血清中膽固醇調(diào)控關(guān)鍵酶活的影響

肝臟是調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇代謝的重要器官。膽固醇在肝臟中的三條主要的代謝途徑為內(nèi)源性膽固醇合成、膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化以及LDL-R對LDL的接受途徑[28]。因此機體可以通過調(diào)節(jié)與膽固醇代謝相關(guān)酶3-羧基-3甲基-戊二酰CoA還原酶(HMGCR)、膽固醇-7α-羥化酶(CYP7A1)、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)等的水平來調(diào)節(jié)膽固醇在體內(nèi)的代謝。

2.5.1 匙羹藤酸對倉鼠血清中HMGCR酶活的影響 HMGCR是機體中膽固醇合成的主要限速酶[27]。由圖8可知,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中HMGCR水平顯著升高(P<0.05),表明高脂飲食會促進機體內(nèi)HMGCR活力的升高,促進膽固醇的合成。與模型對照組相比,中、高劑量組倉鼠血清中HMGCR水平極顯著下降(P<0.01),說明匙羹藤酸可以降低HMGCR水平,通過抑制HMGCR的合成來降低膽固醇的合成。

圖8 匙羹藤酸對倉鼠血清中的HMGCR活力的影響Fig.8 Effect of gymnemic acid on serum HMGCR activity on serum of hamster

2.5.2 匙羹藤酸對倉鼠血清中CYP7A1酶活的影響 膽固醇7-羥化酶(CYP7A1)是膽汁酸合成代謝經(jīng)典途徑中肝臟合成并促使膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁限速酶,是機體把膽固醇排除體外的重要途徑,對機體維持膽固醇代謝平衡起著重要的作用[27]。由圖9可知,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中的CYP7A1水平極顯著下降(P<0.01),與模型對照組相比,中、高劑量組倉鼠血清中的CYP7A1水平極顯著升高(P<0.01)。說明匙羹藤酸可以提高倉鼠血清中CYP7A1水平,增加膽汁的合成,從而將膽固醇的排出體外,降低血液中膽固醇。

圖9 匙羹藤酸對倉鼠血清中的CYP7A1活力的影響Fig.9 Effect of gymnemic acid on serum CYP7A1 activity in serum of hamster

2.5.3 匙羹藤酸對倉鼠血清中ACAT酶活的影響 ACAT是細胞內(nèi)唯一催化游離膽固醇和長鏈脂肪酸合成膽固醇酯的酶,抑制體內(nèi)的ACAT活性可減少食物中的膽固醇及隨膽汁排泄的膽固醇在小腸的吸收,減少肝臟中膽固醇酯的生成及極低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein,VLDL)的分泌。由圖10可知,正常對照組、模型對照組及匙羹藤酸各劑量組的倉鼠血清中ACAT水平?jīng)]有顯著性差異(P>0.05)。因此匙羹藤酸和高脂膳食對ACAT的活力沒有影響。

圖10 匙羹藤酸對倉鼠血清中的ACAT活力的影響Fig.10 Effect of gymnemic acid on serum ACAT activity in serum of hamster

2.6 匙羹藤酸對倉鼠肝臟中HMGCR酶活的影響

HMGCR主要存在于肝臟中。由圖11可知,與正常對照組相比,模型對照組倉鼠血清中HMGCR水平極顯著升高(P<0.01),表明高脂飲食會促進肝臟內(nèi)HMGCR活力的升高,促進膽固醇的合成。與模型對照組相比,匙羹藤酸中、高劑量組倉鼠血清中HMGCR水平極顯著下降(P<0.01),低劑量組HMGCR水平顯著下降(P<0.05),說明匙羹藤酸可以降低HMGCR水平,通過抑制HMGCR的合成來降低膽固醇的合成,這一結(jié)果與血清中的一致。

圖11 匙羹藤酸對倉鼠肝臟中的HMGCR活力的影響Fig.11 Effect of gymnemic acid on serum HMGCR activity in liver of hamster

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明低、中、高劑量的匙羹藤酸均能不同程度地抑制高脂飲食倉鼠的血脂水平,減少腎周脂肪的積累,抑制肝臟發(fā)生脂肪性病變。匙羹藤酸可以抑制HMGCR、提高CYP7A1的水平,對ACAT沒有影響,表明匙羹藤酸可以通過抑制HMGCR的水平來抑制體內(nèi)膽固醇的合成,通過提高CYP7A1的水平來促進膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化,從而促進膽固醇的排泄,來控制機體內(nèi)血脂水平的升高。本文研究結(jié)果為匙羹藤酸降血脂提供了科學依據(jù),將來可以通過Western Blot和qPCR的方法對膽固醇調(diào)節(jié)相關(guān)酶的基因和蛋白表達水平進行研究。