,*

(1.上海海洋大學食品學院,國家淡水水產品加工技術研發(fā)分中心(上海),上海 201306;2.上海海洋大學水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室,上海 201306;3.寧波大學 東海海水養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江寧波 315211)

脊尾白蝦通常被稱為小白蝦,是中國近海地區(qū)重要的經濟蝦。脊尾白蝦對環(huán)境具有較強的適應能力,2～35 ℃均能存活,其繁殖能力很強,生長周期短,適合養(yǎng)殖。并且隨著養(yǎng)殖技術的發(fā)展,也發(fā)展出了與其他水產品混養(yǎng)的養(yǎng)殖技術。脊尾白蝦富含蛋白質和礦物質,其肉質鮮美,營養(yǎng)豐富[1]。

目前池塘養(yǎng)殖是脊尾白蝦的主要養(yǎng)殖方式,通常和三疣梭子蟹和梭魚等品種混養(yǎng)[2]。目前脊尾白蝦池塘養(yǎng)殖過程中,主要依靠投喂冰鮮雜魚和小麥粉等餌料,但是這些餌料通常存在來源不穩(wěn)定、營養(yǎng)不平衡、不利于保存、敗壞水質等缺點;人工配合飼料具有質量穩(wěn)定、便于投喂、易保存和污染小等優(yōu)點,所以,近年來一些養(yǎng)殖區(qū)開始研究利用人工配合飼料養(yǎng)殖脊尾白蝦[1,3]。

分析樣品揮發(fā)性成分的儀器主要有電子鼻和GC-MS兩種。電子鼻是一種分析儀器,包括氣體傳感器陣列,信號處理系統(tǒng)和模式識別系統(tǒng)。它可以模仿人類的鼻子聞到被測樣品的總體氣味,并且可以對樣品的氣味進行分析、區(qū)別、檢測[4]。相對于感官評定員對于被測樣品氣味的評定,電子鼻具有客觀性好、重復性高、且不損傷樣品的優(yōu)勢,同時,利用電子鼻檢測樣品方便快捷,操作簡單,所以電子鼻被廣泛應用于水產品揮發(fā)性物質的檢測。GC-MS(氣相色譜-質譜聯(lián)用儀,gas chromatography-mass spectrometry)是將樣品經過氣相色譜將復雜成分分離,再順序進入質譜檢測器進行檢測的一套儀器,可以定性和定量分析樣品中的揮發(fā)性成分。電子鼻可以根據(jù)不同的傳感器區(qū)分不同樣品之間的揮發(fā)性成分的差異,卻不能給樣品揮發(fā)性成分定性定量。而GC-MS可以相對準確地識別樣品中的特定揮發(fā)性物質。電子鼻與GC-MS結合使用可以較全面的檢測待測樣品的揮發(fā)性成分,也是目前研究食品中揮發(fā)性成分的主要手段[5-6]。Miyasaki[7]等運用GC-MS與電子鼻技術研究了不同種類的魚肉在冷藏技術下?lián)]發(fā)性成分的變化,發(fā)現(xiàn)一些可以表征魚肉新鮮度的醛和酮;施文正等[8]采用GC-MS研究了草魚肉在不同溫度下的揮發(fā)性成分。結果表明,草魚肉中揮發(fā)性成分的含量隨溫度的升高而增加;鄭平安等[9]運用HS-SPME結合GC-MS法分析鮐魚肉經過加熱后揮發(fā)性成分的變化,發(fā)現(xiàn)影響鮐魚肉揮發(fā)性氣味的主要物質有己醛、2-己烯醛、2,4-庚二烯醛、2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇等。

近年來,一些養(yǎng)殖區(qū)開始使用人工配合飼料喂養(yǎng)養(yǎng)殖脊尾白蝦,但人工飼料對于傳統(tǒng)餌料的可替代性研究較少,為了研究人工飼料飼喂對脊尾白蝦品質的影響,本研究通過頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜法和電子鼻比較兩種飼喂方法的脊尾白蝦揮發(fā)性成分的差異,從而為脊尾白蝦養(yǎng)殖和加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脊尾白蝦 取自江蘇大豐區(qū)竹川墾區(qū)的海水養(yǎng)殖池塘;NaCl 國藥集團化學試劑有限公司;脊尾白蝦1#(蛋白含量33.2%,脂肪含量7.3%)和2#飼料(蛋白含量38.7%,脂肪含量8.5%) 均為硬顆粒飼料,飼料粒徑分別為1.2 mm和1.6 mm,浙江澳華飼料有限公司;飼料配方 由上海海洋大學甲殼動物營養(yǎng)繁殖實驗室提供,飼料配方組成見表1。

固相微萃取(SPME)手動進樣手柄 美國Supelco公司生產,65 μm PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯)萃取頭;FOX-4000氣味指紋分析儀 法國AlphaM.O.S公司;6890 GC-5975 MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

表1 脊尾白蝦的飼料配方(%)Table 1 Feed formula of Palaemon carinicauda(%)

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗投喂方法 實驗的投喂方式為兩種:整個過程使用復合飼料喂養(yǎng),浙江澳華飼料有限公司生產的脊尾白蝦1#(蛋白含量33.2%,脂肪含量7.3%)和2#飼料(蛋白含量38.7%,脂肪含量8.5%),其中1#飼料投喂時間為6～8月份,2#飼料投喂時間為9～11月份;全程投喂傳統(tǒng)冰鮮餌料,傳統(tǒng)餌料由粉碎的冷凍雜魚和小麥粉組成,兩者比例為1∶1。養(yǎng)殖期間根據(jù)水溫和溶氧情況,每日投喂1～2次,配合飼料的投喂量占蝦體重的2%～5%,傳統(tǒng)冰鮮餌料的投喂量通常占體重的4%～8%;每日記錄各個池塘的投餌和攝食情況,根據(jù)實際情況進行水質調控,盡量保證水質良好,氨氮<1 mg/L,亞硝酸鹽<0.15 mg/L,pH7.0～9.0。兩種餌料各重復3個養(yǎng)殖池塘,池塘面積為2公頃。12月初停止投喂,每個池塘隨機取樣脊尾白蝦1公斤(雄蝦體重為(1.76±0.11) g,雌蝦體重為(2.13±0.06) g)用于后續(xù)分析。

1.2.2 樣品前處理 將捕獲的兩種飼喂模式脊尾白蝦,人工分離出雌雄[10](脊尾白蝦雄蝦在第五對步足之間有雄性凸起,可以方便的進行雌雄辨認)。將取到的蝦去頭,去殼取肉。GC-MS樣品:稱取絞碎的蝦肉5 g,加入5 mL NaCl溶液(0.18 g/mL),均質后,取適量勻漿液放入15 mL頂空瓶中,加蓋并用塑料膜覆蓋待測,每組平行測定3次。電子鼻樣品:在相同的處理方法后,稱取絞碎的蝦肉2 g加入2 mL NaCl溶液(0.18 g/mL),均質后,取適量勻漿液放入10 mL進樣瓶中。

圖1 脊尾白蝦雄性附肢(A)及雄性突起(B)Fig.1 Male appendage(A)and male protrusion(B)

1.2.3 電子鼻條件 載氣:干燥潔凈的空氣,流速:150 mL/min;樣品溫度4 ℃,清洗時間120 s,測樣時間600 s;頂空產生參數(shù):產生時間為600 s,攪動速率500 r/min;頂空注射參數(shù):注射體積2500 μL;注射速率2500 μL/s。

1.2.4 GC-MS分析條件 SPME條件:在GC進樣口于250 ℃老化30 min后取出萃取頭,并將萃取頭插入樣品瓶中,提取溫度為45 ℃(注:萃取頭不與瓶中樣品接觸,調節(jié)萃取頭位置距離瓶口約4～5 mm),萃取40 min后,取出萃取頭并快速將其插入GC進樣口中。在250 ℃下解析5 min后,將萃取頭取出。

GC條件:HP-5MS彈性毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流模式進樣;升溫程序參考施文正的方法[11]:柱初溫40 ℃,保持2 min,以4 ℃/min升至160 ℃,而后以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min;載氣(He)流量1.0 mL/min。

MS條件:傳輸線溫度為280 ℃,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃;電子能量70 eV;質量掃描范圍m/z 35～350。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 電子鼻數(shù)據(jù)分析 電子鼻中自帶的Alphasoft V11統(tǒng)計分析軟件對樣品進行主成分分析(Principal component analysis,PCA)。

1.3.2 GC-MS數(shù)據(jù)處理 GC-MS數(shù)據(jù)使用Xcalibur軟件處理分析。通過查詢NIST和Wily質譜數(shù)據(jù)庫確認定性,并且為了保證被檢測組分可靠性,并根據(jù)現(xiàn)有文獻,當物質正反匹配度均大于800時(最大值1000)才予以確認[11-13]。通過Excel數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),以面積歸一化法確定不同樣品中揮發(fā)性成分中各化合物成分的相對百分比。

1.3.3 相對氣味活度值法評價(ROAV) 人類的鼻子對不同化合物的嗅覺敏感性區(qū)別很大,“感覺閾值”定義為某種物質能被人的鼻子感受到的最低濃度[13]。當化合物的濃度恒定時,閾值越低,人們越容易察覺。當化合物的閾值不變時,濃度越高,人們越容易察覺,兩者的組合才可以進行有效地客觀評價[14]。即“氣味活度值(odor activity value,OAV)”其定義為嗅感物質的絕對濃度(C)與其感覺閾值(T)之比,即

其中,采用化合物的相對百分含量代替其絕對含量進行分析,使對樣品總體氣味貢獻最大的化合物:ROAVstan=100,對于其他組分(X)則有

將上式代入,則有:

通過這樣的計算,所有組分ROAV值≤100,ROAV值越大則說明該成分對樣品的總體氣味貢獻越大,一般來說,ROAV值≥1的化合物是分析樣品中的關鍵氣味化合物,0.1≤ROAV≤1的化合物被認為對樣品的總體氣味具有重要的修飾性改變作用[14]。

2 結果與分析

2.1 不同飼喂方法脊尾白蝦電子鼻分析結果

圖2為不同飼喂方法脊尾白蝦揮發(fā)性氣味對傳感器響應雷達圖,電子鼻測試樣品要求待測樣品對傳感器的最大響應大于0.5,本次實驗所有飼喂模式下的脊尾白蝦樣品均達到了檢測要求。從雷達圖中可以看到電子鼻傳感器對樣品的揮發(fā)性成分有明顯響應,對各樣品的響應強度大致相同。

圖2 不同飼喂方法脊尾白蝦揮發(fā)性氣味雷達圖Fig.2 Radar chart of sensor response of Palaemon carinicauda with different feeding methods

圖3是四種脊尾白蝦的揮發(fā)性成分PCA圖,PCA轉換并減小傳感器響應的特征向量矩陣的維數(shù),并執(zhí)行線性分類。在失去少量信息的前提下,多個指標轉化為一些重要的綜合指標。最終結果顯示在二維散點圖中[15]。圖3中,PC1的貢獻率為94.832%,PC2的貢獻率為4.49%,總貢獻率為99.322%,超過了85%,一般認為其總貢獻率高于85%即可,并且貢獻率越大說明PCA圖反映的指標越完整,所以可以認為PCA圖較完整的反映樣品的原始信息。在PCA圖中,其中配合飼料喂養(yǎng)脊尾白蝦所在范圍較大,但四種脊尾白蝦所在區(qū)域均有較大重疊,并且四組脊尾白蝦均有重疊區(qū)域,說明電子鼻并不能區(qū)別四種脊尾白蝦的氣味。電子鼻結果表明配合飼料喂養(yǎng)與傳統(tǒng)餌料喂養(yǎng)的脊尾白蝦氣味相近。

圖3 不同飼喂方法脊尾白蝦PCA圖Fig.3 PCA analysis of volatile flavor compounds of Palaemon carinicauda with different feeding methods

表2 不同脊尾白蝦揮發(fā)性成分相對含量(%)Table 2 Volatile compounds of Palaemon carinicauda with different feeding methods(%)

2.2 四種脊尾白蝦揮發(fā)性成分分析

對樣品每個色譜峰對應的質譜進行NIST庫檢索和參考確認,確定不同飼喂方法及性別條件下的脊尾白蝦肉揮發(fā)性成分,然后采用面積歸一化法計算出每一種成分所在樣品中的相對含量。如表2所示,在配合飼料喂養(yǎng)脊尾白蝦雄蝦、雌蝦及傳統(tǒng)餌料喂養(yǎng)脊尾白蝦雄蝦、雌蝦中鑒定出30、30、29、31種揮發(fā)性成分,它主要含有醛和酮、醇類及烴類。

2.2.1 醛類物質 醛類在所有的蝦的樣品的揮發(fā)性成分中有著較大的相對含量占比,且小分子醛類物質的閾值大都較低,因此,醛類物質是脊尾白蝦揮發(fā)性成分貢獻的主要物質。醛類物質閾值低并且有報道醛類物質可以與許多其他氣味成分加和形成氣味效應[11]。壬醛、己醛、庚醛、辛醛都是飽和的直鏈醛,飽和的直鏈醛通常會產生一些令人不愉快的、刺鼻的、辛辣的刺激性氣味[17]。并且,取決于碳鏈的長度,C5～C9醛發(fā)出蠟質和脂肪味,C10～C12醛類會發(fā)出花香和柑橘香味[18]。戊醛、己醛、庚醛、壬醛、癸醛被認為是淡水魚特有的泥土腥味的主要成分[12]。段秀霞等[19]發(fā)現(xiàn)癸醛、壬醛是凡納濱對蝦蝦肉的氣味成分主要貢獻物質。己醛為大多數(shù)鮮魚的香氣貢獻了一種獨特的粗糙的、綠色植物般的醛香氣味[20]。四種脊尾白蝦中檢測到的醛是己醛、庚醛、壬醛、癸醛、十二醛。肉豆蔻醛只在配合飼料喂養(yǎng)脊尾白蝦樣品中檢測到,傳統(tǒng)餌料喂養(yǎng)脊尾白蝦雄蝦和雌蝦均未檢測出該物質。其中壬醛在所有揮發(fā)性成分的相對含量最大,在一定濃度時,壬醛會散發(fā)出清香味,濃度過高則會表現(xiàn)出明顯的動物油脂味[21]。且壬醛在所有檢測出的物質中其閾值最低,僅為1 μg/kg,因此壬醛對脊尾白蝦的氣味貢獻最大。

2.2.2 酮類物質 酮類物質一般是由多不飽和脂肪酸的受熱氧化或是氨基酸分解產生的[22],并且它們的閾值通常高于醛的閾值。酮類物質一般表現(xiàn)為花香和果香,其香氣特征隨著碳鏈的增加而增強[18]。此外,據(jù)報道,酮類對腥味物質的味道有增強的作用,可以增強或改變腥味物質[23]。脊尾白蝦中的酮類物質主要有苯乙酮與甲基庚烯酮,且酮類物質的種類與相對含量都較少。有文獻報道,甲基庚烯酮也在蟹類動物中存在。脊尾白蝦中所檢測出的酮類物質不多,在所有的脊尾白蝦樣品中都檢測出了苯乙酮、2-莰酮、甲基庚烯酮。

續(xù)表

注:ND:表示未檢出;-:未查到其閾值的相關文獻報道;同行上標字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 醇類物質 醇類物質主要來源于糖、氨基酸和醛類物質的還原[24],也有可能是多不飽和脂肪酸受熱氧化和降解的產物[25]。醇類物質大多會產生一些柔和的味道。醇類物質一般閾值較高。四種脊尾白蝦樣品中都檢測出了1-辛烯-3-醇、1-壬醇、柏木醇、桉樹醇。所有檢測到的醇中,桉樹醇的相對含量最高。其中1-辛烯-3-醇是一種低閾值醇,其閾值只有1 μg/kg,它擁有著類似蘑菇的香味所以也被稱為蘑菇醇。不僅在蝦肉中,1-辛烯-3-醇也在一些其他水產品如魚類和蟹類的揮發(fā)性成分中被檢測到[26],可以說它是一種廣泛存在于水產品中的揮發(fā)性化合物,在四種脊尾白蝦中,它的相對含量不多,只有0.6%左右。

2.2.4 其他物質 除了醛酮醇類物質,四種脊尾白蝦中也檢測出來對氣味有貢獻的物質如萘、1-甲基萘、2-甲基萘、D-檸檬烯和含硫化合物苯并噻唑等物質。萘是一種含苯環(huán)的物質,它們會散發(fā)出一種令人難以接受的刺激性氣味,對脊尾白蝦的氣味影響來說,它們的存在是一種負面作用,對于它們的存在,較普遍的解釋是它們來自水產品所處的環(huán)境的污染。D-檸檬烯是烯烴類物質,能散發(fā)出一種類似柑橘的氣味。苯并噻唑是一種含硫化合物,它們的閾值較低。在一些海蝦的蝦肉中或其他水產品如牡蠣等,會檢測出一些其他的含硫化合物如二甲基硫醚和二甲基三硫醚[14,27-28]。同時,二甲基硫醚也是烹調牡蠣香氣中公認的香氣化合物[19],雖然它們在水產品中的相對含量很低,但是它們的閾值很低,例如二甲基三硫醚的閾值僅為0.005 μg/kg,所以其對蝦肉的氣味影響較大,有的文獻也以此物質為對氣味貢獻最大的物質并將此物質定位相對氣味活度值最高的組分,而在脊尾白蝦蝦肉中并未檢測到該物質,其原因可能是蝦體所處的生長環(huán)境不同,或者用于提取揮發(fā)性組分的萃取頭之間的差異。

2.3 氣味貢獻評價

在四種脊尾白蝦中,壬醛的氣味活度值最高,因此壬醛的相對氣味活度值(ROAV)定義為100,以此計算其他氣味物質的ROAV。

從表3中可以看出,對脊尾白蝦氣味成分起決定貢獻作用的物質是:壬醛、癸醛、1-甲基萘、1-辛烯-3-醇、2-甲基萘、十二醛、桉樹醇、D-檸檬烯、庚醛、己醛。對脊尾白蝦氣味起修飾作用的有:萘、苯并噻唑、甲基庚烯酮、壬醇、苯乙酮等。

表3 不同脊尾白蝦揮發(fā)性氣味成分的 相對氣味活度值(ROAV)Table 3 Relative odor activity values of volatile components from Palaemon carinicauda with different feeding methods(ROAV)

結合表2,四種脊尾白蝦主要氣味成分和氣味貢獻相似。對脊尾白蝦氣味成分起決定貢獻的物質主要是醛類和醇類物質,醛類物質中,壬醛、癸醛、十二醛對氣味貢獻相對最高,庚醛、己醛的氣味貢獻相比于其他物質會少一些,但是醛類物質有氣味疊加效應,所以可以認定醛類物質是四種脊尾白蝦氣味構成的主要物質。而除了醛類物質,醇類物質如1-辛烯-3-醇、桉樹醇也對四種脊尾白蝦氣味起到了相對較高的貢獻,在一些文獻中,蘑菇醇與一些醛類物質如壬醛、癸醛等也被認為是水產品魚蝦蟹的特征氣味[12,14,29-31]。桉樹醇是類似樟腦氣息的物質,在醇類物質中,它的相對含量最高,且它的閾值低,所以其對樣品的氣味貢獻相對較大。D-檸檬烯會散發(fā)出一種類柑橘味的甜香,雖然它的相對含量不高,然而,它的閾值較低,因此它對脊尾白蝦的整體氣味也有較大貢獻。而除了以上物質,所有的脊尾白蝦中也檢測出了含苯環(huán)的1-甲基萘、2-甲基萘這兩種物質,這兩種物質會產生一些刺激性氣味,對蝦肉的整體氣味起到負面作用,并且這兩種物質的相對含量較高其閾值也低,所以在脊尾白蝦氣味貢獻中他們甚至會高于一些醇類和醛類物質[14]。

此部分物質對脊尾白蝦氣味的構成起到修飾作用,這些物質對氣味的貢獻比ROAV大于1的物質小。四種脊尾白蝦中,都檢測出了有壬醇、甲基庚烯酮、萘、苯并噻唑,其中苯并噻唑是一種含硫化合物,它會產生一陣類似肉香和堅果香。在配合飼料喂養(yǎng)的脊尾白蝦蝦肉中均檢測出了肉豆蔻醛,傳統(tǒng)餌料喂養(yǎng)脊尾白蝦則未檢測到該物質,肉豆蔻醛(即十四醛)會散發(fā)出類似脂肪和牛奶的香味,但其在配合飼料喂養(yǎng)脊尾白蝦中的含量很少,所以其對脊尾白蝦總體氣味影響不大。而剩余的物質如苯乙酮、2-莰酮等因為這些物質的相對含量較少或是閾值較大,導致它們的相對氣味活度值低于0.1,這類物質對總體氣味的形成影響并不大,所以不做考慮。

3 結論

本研究對兩種飼喂方法的脊尾白蝦揮發(fā)性成分進行了分析,利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(HS-SPME-GC-MS)在配合飼料喂養(yǎng)脊尾白蝦雌蝦與雄蝦和傳統(tǒng)餌料喂養(yǎng)脊尾白蝦雌蝦與雄蝦中共檢測出了30、30、29、31種揮發(fā)性成分。醛類6種,酮類4種,醇類5種。結合ROAV得出脊尾白蝦關鍵氣味的物質是:壬醛、癸醛、1-甲基萘、1-辛烯-3-醇、2-甲基萘、十二醛、桉樹醇、D-檸檬烯、庚醛、己醛。且四種脊尾白蝦關鍵氣味基本相似,這與電子鼻分析結果一致,電子鼻并不能較好的區(qū)分四種脊尾白蝦總體氣味。研究結果說明兩種飼喂方法的脊尾白蝦揮發(fā)性氣味成分非常接近,配合飼料喂養(yǎng)模式可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)餌料喂養(yǎng)模式。