(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

中國是酒類生產(chǎn)和消費(fèi)大國,長期飲酒可導(dǎo)致全身多系統(tǒng)多器官損傷,除了最常見的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷,酒精的免疫毒性也越來越受到人們的關(guān)注。慢性酒精中毒對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有抑制作用,一方面,酒精可直接抑制脾臟和胸腺T淋巴細(xì)胞的生成量及其功能,降低免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[1];另一方面,酒精可引起肝損傷,使得患者普遍出現(xiàn)體液免疫和細(xì)胞免疫異常,造成機(jī)體免疫力低下[2]。此外,長期過量飲酒還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、能量及維生素?cái)z入不足而產(chǎn)生營養(yǎng)不良,出現(xiàn)營養(yǎng)性免疫抑制[3]。因此研究開發(fā)拮抗酒精免疫毒性的天然、無毒、營養(yǎng)的保健食品是目前醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的熱點(diǎn)。

玉米肽是玉米蛋白的酶解產(chǎn)物,具有醒酒、保肝、抗疲勞、抗氧化等多種活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)玉米肽還具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。馬子淇等[4-5]以玉米黃粉為原料,制備并純化出免疫活性肽,發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的能力,且有劑量依賴性。吳曉萌[6]發(fā)現(xiàn)玉米黃漿多肽能顯著增加正常小鼠免疫器官指數(shù)、足跖腫脹程度、血清抗體水平及碳廓清能力。此外,張智等[7]將玉米肽與益生菌進(jìn)行復(fù)合,發(fā)現(xiàn)該復(fù)合益生菌-玉米肽具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能作用,并且能促進(jìn)免疫球蛋白A的產(chǎn)生。玉米肽作為天然的保健食品,可減少藥物治療的副作用,保證消費(fèi)者健康,必然受到消費(fèi)者的歡迎。本文以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的玉米肽為研究對(duì)象,探討其對(duì)慢性酒精中毒小鼠免疫功能的影響,以期為進(jìn)一步研究玉米源免疫活性肽的免疫增強(qiáng)作用及其機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

表1 玉米肽對(duì)慢性酒精中毒小鼠體重、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 1 Effect of corn peptide on body weight,spleen and thymus index of chronic alcoholism mice

注:不同小寫字母表示同列數(shù)據(jù)間差異顯著,P<0.05;表2同。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級(jí)昆明小鼠(18±2) g 60只 遼寧長生生物技術(shù)有限公司[質(zhì)量合格證號(hào) 211002300019054,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為 SCXK(遼)2015-0001];玉米肽粉 齊齊哈爾易翔食品有限公司[蛋白含量49.5%,肽分子量<1 kDa,其余為淀粉];小鼠干擾素γ酶聯(lián)免疫試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫試劑盒、小鼠白介素6酶聯(lián)免疫試劑盒 上海江萊生物科技有限公司;GSH、MDA和SOD試劑盒 南京建成生物生物科技有限公司;其它試劑均為常規(guī)試劑。

T-114分析天平 美國丹佛儀器;EnSpire全波長多功能酶標(biāo)儀 美國珀金埃爾默公司;CF15RXII型高速離心機(jī) 日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組 昆明小鼠60只,雌雄各半,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,隨機(jī)分為5組,每組12只,分別為正常對(duì)照組、慢性酒精中毒模型組、玉米肽高、中、低劑量組。

加肽鼠糧的制作:按肽的蛋白含量(g)和基礎(chǔ)鼠糧重量(g)的比例1∶500、3∶500和5∶500制備加肽鼠糧,分別為低、中、高玉米肽劑量組。

模型建立:自由飲用含酒精水建立小鼠慢性酒精中毒模型,水中酒精體積分?jǐn)?shù)由6%、9%、12%,各飼喂5 d后調(diào)整到20%,以20%的酒精濃度維持飼養(yǎng)5個(gè)月,正常對(duì)照組小鼠飲用不含酒精的水;正常對(duì)照組和酒精模型組飼喂正常鼠糧,玉米肽組飼喂加肽鼠糧,自由攝食。

1.2.2 脾臟指數(shù)/胸腺指數(shù)的測定 試驗(yàn)結(jié)束后,禁食、不禁水12 h,稱重后處死小鼠,剝離脾臟和胸腺并稱重,計(jì)算脾臟/體重和胸腺/體重比值(mg/g)。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察 試驗(yàn)結(jié)束后,小鼠脾臟和胸腺組織制成HE染色切片并做病理學(xué)觀察。

1.2.4 血清中細(xì)胞因子的測定 試驗(yàn)結(jié)束后,禁食、不禁水12 h,稱重后眼球取血,室溫靜置,析出血清后,于4 ℃、1000×g離心15 min,收集血清,按照各試劑盒說明書測定血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ含量。

1.2.5 血清及肝臟中GSH、MDA含量及SOD活性測定 試驗(yàn)結(jié)束后,禁食、不禁水12 h,稱重后眼球取血,解剖取肝臟組織,使用生理鹽水制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%組織研磨液,4 ℃、1000×g離心15 min,收集上清液,按照各試劑盒說明書測定GSH、MDA含量及SOD活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,差異顯著者再進(jìn)行LSD檢驗(yàn)。各組數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±SD表示,不同小寫字母角標(biāo)表示各組數(shù)值比較差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米肽對(duì)慢性酒精中毒小鼠免疫器官臟器指數(shù)的影響

由表1可知,與正常對(duì)照組相比,酒精模型組和玉米肽高中低三個(gè)劑量組的小鼠體重均顯著降低(P<0.05),表明長期慢性的酒精處理可引起小鼠體重減輕;酒精模型組小鼠脾臟系數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),表明酒精處理后,小鼠脾臟出現(xiàn)腫大,但是胸腺的臟器指數(shù)尚未出現(xiàn)顯著變化。玉米肽各劑量組對(duì)酒精引起的小鼠體重降低并未表現(xiàn)出顯著的改善作用,但玉米肽中劑量組顯著降低了小鼠脾臟系數(shù)(P<0.05),緩解了脾臟損傷,對(duì)酒后脾臟有一定的保護(hù)作用。

2.2 玉米肽對(duì)慢性酒精中毒小鼠脾臟和胸腺病理組織學(xué)的影響

脾臟是機(jī)體重要的外周免疫器官,擁有25%全身循環(huán)的T淋巴細(xì)胞,是免疫細(xì)胞增殖和接受抗原刺激產(chǎn)生相應(yīng)免疫應(yīng)答的場所。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,長期過量飲酒對(duì)脾臟的生長發(fā)育具有顯著的抑制作用,可引起脾細(xì)胞脂質(zhì)過氧化,細(xì)胞膜通透性增強(qiáng),膜表面受體受損,進(jìn)而影響機(jī)體的各項(xiàng)免疫功能[8]。

圖1 小鼠脾臟病理學(xué)觀察結(jié)果(100×)Fig.1 Pathological observation results of spleen in mice(100×)

小鼠脾臟病理切片見圖1。結(jié)果表明,與正常對(duì)照組相比,酒精模型組脾臟白髓比例增大,白髓內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多;而與酒精模型組比較,玉米肽低劑量組脾臟紅髓比例增多,可見較多含鐵血黃素,白髓內(nèi)細(xì)胞數(shù)量略減少,并可見細(xì)胞核溶解;玉米肽中劑量組中紅髓比例明顯增多,白髓內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少,并可見細(xì)胞核溶解;玉米肽高劑量組脾臟中白髓比例較中劑量組增多,但仍可見細(xì)胞溶解?？梢?玉米肽各劑量組脾臟白髓面積及細(xì)胞數(shù)量均得到不同程度的恢復(fù)。

圖2 小鼠胸腺病理學(xué)觀察結(jié)果(100×)Fig.2 Pathological observation results of thymus in mice(100×)

胸腺對(duì)機(jī)體T細(xì)胞分化、成熟起到重要作用,酒精可降低胸腺中淋巴細(xì)胞生成量及釋放率[8]。由圖2可見,酒精模型組小鼠胸腺已觀察不到胸腺小葉,且皮質(zhì)、髓質(zhì)不明顯;與正常對(duì)照組相比,玉米肽低劑量組的胸腺小葉及髓質(zhì)也不明顯。中劑量組可見血管充血,胸腺小葉內(nèi)細(xì)胞之間距離變大。高劑量組仍可見血管充血,但胸腺小葉內(nèi)細(xì)胞增多。玉米肽各劑量組胸腺病變均有不同程度的恢復(fù),但恢復(fù)較輕,僅比模型組略佳。

2.3 玉米肽對(duì)慢性酒精中毒小鼠血清細(xì)胞因子的影響

由表2可知,與正常對(duì)照組相比,慢性酒精中毒導(dǎo)致小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6含量顯著降低(P<0.05),這與報(bào)道相一致[9-10]。與酒精模型組相比,玉米肽中、高劑量組小鼠血清中TNF-α含量顯著提高(P<0.05);玉米肽低、中、高三個(gè)劑量組小鼠血清中IFN-γ含量都有顯著提高(P<0.05);并且高劑量玉米肽還顯著提高了小鼠血清中IL-6的含量(P<0.05)。這些結(jié)果表明,玉米肽可以明顯改善酒精模型組小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6水平。

表2 玉米肽對(duì)慢性酒精中毒小鼠血清細(xì)胞因子的影響Table 2 Effect of corn peptide on serum cytokine of chronic alcoholism mice

2.4 血清及肝臟組織中GSH、MDA含量及SOD活性

酒精代謝產(chǎn)生大量ROS,可消耗機(jī)體內(nèi)的抗氧化物質(zhì),GSH是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)之一。由圖3可知,酒精顯著降低了小鼠肝臟中抗氧化劑GSH的含量(P<0.05),但是對(duì)血清中GSH的含量沒有顯著影響(P>0.05)。與酒精模型組相比,低、中、高劑量組玉米肽皆可顯著降低酒精對(duì)肝臟中GSH的消耗(P<0.05),并且具有劑量依賴性,隨著玉米肽含量的增加,肝臟中GSH含量也隨之升高,恢復(fù)到正常水平。

圖3 小鼠血清及肝臟中GSH濃度Fig.3 The concentration of GSH in plasma and liver of mice 注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05;圖4～圖5同。

由圖4可見,與正常對(duì)照組相比,酒精可顯著增加小鼠肝臟及血清中MDA含量(P<0.05),MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,且具有細(xì)胞毒性。與酒精模型組相比,中、高玉米肽劑量組的小鼠血清和肝臟中MDA含量顯著降低(P<0.05);其中玉米肽高劑量組小鼠血清和肝臟中MDA水平與正常對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。這表明玉米肽可降低乙醇及其代謝產(chǎn)物引起的小鼠肝臟及血清中MDA水平的升高,保護(hù)免疫組織及細(xì)胞免受其毒性作用。

圖4 小鼠血清及肝臟中MDA水平Fig.4 The levels of MDA in plasma and liver of mice

由圖5可知,與正常對(duì)照組相比,酒精可顯著降低小鼠血清及肝臟中SOD活性(P<0.05)。與酒精模型組相比,中、高玉米肽劑量組小鼠血清及肝臟中SOD活性顯著升高(P<0.05)。其中玉米肽中劑量組小鼠血清和肝臟中SOD活性與正常對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。這表明玉米肽可恢復(fù)酒精中毒小鼠血清及肝臟中SOD活性。玉米肽本身就是一種抗氧化活性較強(qiáng)的活性寡肽,研究表明玉米肽可提高正常小鼠血清和肝臟中SOD活性,同時(shí)還可提高肝臟中GSH-PX活性[11]。

圖5 小鼠血清及肝臟中SOD活性Fig.5 The activity of SOD in plasma and live of mice

3 討論與結(jié)論

T細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的中心,可分泌多種細(xì)胞因子進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。其中細(xì)胞因子TNF-α具有強(qiáng)化中性粒細(xì)胞的吞噬能力,還可以增加過氧化物陰離子產(chǎn)生,刺激細(xì)胞脫顆粒和分泌髓過氧化物酶、抗感染。IFN-γ可通過激活單核吞噬細(xì)胞殺滅微生物及腫瘤細(xì)胞,激活中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞,強(qiáng)化NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能;IL-6是一種多效性細(xì)胞因子,在多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)方面具有重要的作用,包括細(xì)胞分化、免疫防御、增殖等;若IL-6水平降低,則會(huì)引起免疫系統(tǒng)中某個(gè)或多個(gè)節(jié)點(diǎn)發(fā)生障礙,從而導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降[12]。長期酗酒可抑制T淋巴細(xì)胞的功能,使T淋巴細(xì)胞減少有絲分裂和對(duì)抗原的增殖反應(yīng)下降,細(xì)胞因子IFN-γ的合成和NK細(xì)胞活性也會(huì)降低,并且單核細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1和IL-6也會(huì)下降[9];此外酒精引起營養(yǎng)不良,蛋白質(zhì)的缺乏也可降低機(jī)體免疫力,因?yàn)槊庖叻烙蕾囉诩?xì)胞復(fù)制和具有生物活性的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生,如抗體、細(xì)胞因子等[13]。玉米肽具有促進(jìn)乙醇代謝的醒酒作用,可明顯降低原發(fā)性高血壓大鼠血液中乙醇及其氧化產(chǎn)物乙醛濃度的作用,同樣的結(jié)果在健康人中也得到了印證[14-15]。在本研究中,與酒精模型組相比,高劑量玉米肽可以顯著改善慢性酒精中毒導(dǎo)致的小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6含量的降低(P<0.05);一方面可能是因?yàn)橛衩纂哪軌蚣涌炀凭x速度,從而降低酒精對(duì)機(jī)體的直接損害作用,另一方面可能是因?yàn)橛衩纂目赏ㄟ^為機(jī)體補(bǔ)充大量的氨基酸減輕機(jī)體蛋白質(zhì)缺乏狀態(tài),提高細(xì)胞因子的表達(dá)和活性,改善T淋巴細(xì)胞的功能,從而提高機(jī)體的免疫力。

酒精進(jìn)入機(jī)體后,在乙醇脫氫酶和微粒體乙醇氧化酶作用下,轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?并通過CYP2E1產(chǎn)生了多種活性氧,如乙氧基自由基、超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等,導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高,損傷包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的各組織細(xì)胞;同時(shí)還可損害機(jī)體內(nèi)保護(hù)性抗氧化劑,如降低機(jī)體中谷胱甘肽含量[16];乙醛還可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成加合物,如丙二醛和丙二醛乙醛加合物[1],進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能的下降。玉米肽的體內(nèi)外抗氧化活性已通過試驗(yàn)證實(shí)。馬瑞等[17]發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物可以通過直接降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量來保護(hù)細(xì)胞;Liu等[11]證明玉米蛋白水解物可提高小鼠血清中SOD活性,這些研究表明玉米蛋白水解物在細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)具有明顯的抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn),玉米肽可降低酒精對(duì)肝臟中GSH的消耗,并具有劑量依賴性;同時(shí)中、高劑量組玉米肽還可恢復(fù)酒精中毒小鼠血清及肝臟中SOD活性。所以玉米肽可能是通過減輕酒精及其代謝物引起的氧化應(yīng)激,減少活性氧對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損傷,改善慢性酒精中毒小鼠的脾臟和胸腺的損傷狀況;此外玉米肽可降低乙醇及其代謝產(chǎn)物引起的小鼠肝臟及血清中MDA水平的升高,保護(hù)免疫組織及細(xì)胞免受MDA的毒性作用,從而輔助增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

綜上所述,長期過量酒精攝入會(huì)導(dǎo)致小鼠免疫器官損傷,降低機(jī)體免疫功能;玉米肽可明顯提高小鼠血清因子水平,改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài),緩解慢性酒精中毒小鼠的脾臟和胸腺的損傷狀況,在一定程度上可以提高機(jī)體的免疫功能,具有保健功能。