郝雅蕎 邢 巖 徐煜東 錢玙呈 沈 琦 遲天舒 王升厚* 趙洪新*

（1沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽110034；2西豐縣房木鎮(zhèn)政府，遼寧鐵嶺112000；3浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院/浙江省植物與次生代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310018）

雞腿菇（Coprinus comatus），學(xué)名毛頭鬼傘，隸屬于擔(dān)子菌亞門，傘菌綱，傘菌目，傘菌科，鬼傘屬，因其形如雞腿，肉質(zhì)似雞絲而得名，是一種珍稀的食用藥用真菌[1]。雞腿菇味道鮮美、營養(yǎng)豐富，特別是近年來研究表明其對(duì)糖尿病具有輔助治療功效[2]，使其備受消費(fèi)者的青睞，市場需求越來越大。然而在實(shí)際生產(chǎn)中，始終保持優(yōu)良性狀的雞腿菇種源較少，菌種容易出現(xiàn)退化現(xiàn)象，而且雞腿菇較脆、易自溶，導(dǎo)致耐貯性較差。商品菇如果采摘時(shí)候稍有偏差或市售拖延，都會(huì)造成品質(zhì)急劇下降，從而滯銷。因此，選育不易退化，韌性好、耐儲(chǔ)藏的優(yōu)質(zhì)雞腿菇新菌株是雞腿菇生產(chǎn)中亟待解決的問題。

野生菌株是優(yōu)良品種選育和馴化的重要來源之一。筆者以來源不同的5株野生雞腿菇和2株生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，從菌株間親緣關(guān)系入手，采用拮抗反應(yīng)和分子鑒定手段，對(duì)7株菌株進(jìn)行親緣關(guān)系比較；并通過出菇試驗(yàn)比較不同來源菌株的菌絲活力與子實(shí)體差異，以期獲得優(yōu)良的野生雞腿菇新菌株，為選育優(yōu)良雞腿菇菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試雞腿菇菌株與培養(yǎng)基

5株野生菌株（西豐縣房木鄉(xiāng)1株，沈北新區(qū)2株，渾南新區(qū)2株）和2株生產(chǎn)菌株（康平）的信息見表1。

表1 供試菌株來源

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然）；栽培料：玉米芯78%，麩皮20%，石灰1%，石膏1%，料含水量65%左右，發(fā)酵滅菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株分離與培養(yǎng)

采用組織分離法獲得野生雞腿菇母種：對(duì)來自不同采集地點(diǎn)、生長良好的野生雞腿菇子實(shí)體編號(hào)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精表面消毒，用無菌解剖刀從菌柄處切取小塊組織，接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，置于25℃下避光培養(yǎng)10～15 d。每隔2天檢查污染情況，再次挑取目標(biāo)菌株菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接、純化、入庫保存。

菌株活化培養(yǎng)：將供試菌株轉(zhuǎn)接至PDA平板中，置于25℃恒溫箱中避光活化培養(yǎng)7 d左右，待菌絲布滿平板時(shí)取出置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 供試菌株間拮抗試驗(yàn)

采用平板對(duì)峙方法：取供試菌株母種在平板中活化7～10 d，待其全部長滿后分別用6 mm打孔器打取菌餅，定量接種在同一PDA平板中央等距離的兩點(diǎn)，7個(gè)菌株之間分別進(jìn)行兩兩拮抗試驗(yàn)。接種后平板置于25℃恒溫培養(yǎng)7～10 d，觀察供試菌株之間拮抗情況。

1.2.3 基因組DNA提取

供試雞腿菇菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，125 r/min、25℃搖床培養(yǎng)7 d，取約1 g菌絲加入液氮研磨，轉(zhuǎn)入離心管中，利用真菌DNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取菌絲體DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ITS擴(kuò)增及序列分析

提取的雞腿菇DNA樣品送上海生工生物工程股份有限公司測序，采用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，測序結(jié)果提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫中，并進(jìn)行blast比對(duì)，通過MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 菌絲生長和子實(shí)體差異比較分析

菌絲生長比較：用直徑為6 mm的打孔器在發(fā)好菌的雞腿菇平板菌種上打取菌餅，分別接種至PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)5 d，測定菌落直徑，計(jì)算菌絲平均生長速度。

出菇試驗(yàn)：制備栽培料裝袋，121℃滅菌1.5 h，冷卻后接種，置于25℃恒溫發(fā)菌，菌絲長滿袋后進(jìn)行覆土及出菇管理。記錄供試菌株出菇情況，并比較子實(shí)體性狀及品質(zhì)差異。

可溶性多糖含量比較：采用蒽酮硫酸法測定雞腿菇子實(shí)體中可溶性糖含量，并通過統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試雞腿菇菌株的采集與初步鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)初步判定采集到的5株菌均為雞腿菇。經(jīng)組織分離及純化培養(yǎng)后獲得野生雞腿菇母種，保存于沈陽師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

2.2 拮抗試驗(yàn)

圖1為供試菌株兩兩拮抗的結(jié)果，共21組。由圖1可見，供試菌株間出現(xiàn)了不同程度的拮抗反應(yīng)。其中b組（野23-1與野23-2）無拮抗線，表明二者系同一菌株或親緣關(guān)系非常近；除l組（野23-2與康平1）拮抗反應(yīng)較弱外，其余各組均出現(xiàn)較強(qiáng)拮抗反應(yīng)。

圖1 雞腿菇的拮抗反應(yīng)

2.3 ITS序列分析

由圖2可知，供試菌株均屬毛頭鬼傘，供試的7個(gè)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。野23-1與野23-2處于同一分支，其親緣關(guān)系較近，與拮抗試驗(yàn)結(jié)果相符。

2.4 供試菌株菌絲活力與子實(shí)體差異分析

2.4.1 供試雞腿菇菌株菌絲活力

如圖3、圖4可見，培養(yǎng)5 d的雞腿菇菌絲生長狀態(tài)存在明顯的差異：菌絲形態(tài)（圖3），野19、校園01、康平01和康平02基本上已經(jīng)布滿平板，但菌絲密度較??；野23-1、野23-2和野11中三個(gè)菌株菌絲濃密、潔白，但生長速度慢。由圖4可見，經(jīng)Duncan檢驗(yàn)表明，在P＜0.05水平上菌絲生長速度：野19、校園01、康平01與康平02間無顯著性差異，并且顯著快于野23-1、野23-2和野11中，其中野23-1、野23-2與野11中菌株間菌絲體生長速度具有顯著性差異。野23-1菌絲生長速度較快，其次是野11中，野23-2最慢。

2.4.2 供試菌株雞腿菇出菇情況與子實(shí)體品質(zhì)比較

圖2 供試7個(gè)雞腿菇菌株ITS聚類分析

圖3 供試雞腿菇菌株菌絲生長狀態(tài)（培養(yǎng)5 d）

圖4 雞腿菇菌絲生長速度

所栽培7個(gè)雞腿菇菌株中只有三個(gè)菌株出菇，為野23-1、野11中、康平01，其余均不出菇；并且康平01子實(shí)體質(zhì)地松軟，易自溶（4℃保存24 h即開始發(fā)生自溶現(xiàn)象），表明該菌株已經(jīng)出現(xiàn)較嚴(yán)重的退化，且遺傳穩(wěn)定性不佳。相比而言野生菌株野23-1和野11中的子實(shí)體質(zhì)地堅(jiān)硬，并且4℃保存時(shí)間更長，可達(dá)7 d。

2.4.3 子實(shí)體多糖含量差異

出菇的3個(gè)雞腿菇菌株（野23-1、野11中和康平01）子實(shí)體多糖含量上存在顯著差異。由Ducan和LSD檢驗(yàn)表明在P＜0.05水平，野23-1子實(shí)體多糖含量最高，為[2.35±0.10（a）]%，顯著高于野 11中[1.68±0.04（b）%]及康平01[1.08±0.06（c）%]。多糖含量是評(píng)價(jià)雞腿菇品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。由此可以看出供試野生雞腿菇營養(yǎng)成分優(yōu)于栽培種，同時(shí)也表明生產(chǎn)菌種可能存在較嚴(yán)重的退化。若能保證野生雞腿菇高品質(zhì)，適當(dāng)采取某些手段，如培養(yǎng)條件優(yōu)化或遺傳育種等方式對(duì)其進(jìn)行馴化，進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，極有可能獲得較理想的效果，即獲得優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的野生雞腿菇新品種。

圖5 出菇與保存狀態(tài)

3 小結(jié)與討論

采用了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩種方法相結(jié)合對(duì)來源不同的五株野生菌進(jìn)行鑒定，通過形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，確定五株野生菌均為毛頭鬼傘（Coprinus comatus），即雞腿菇。經(jīng)拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生菌株野23-1與野23-2基本沒有拮抗線，其余各組均出現(xiàn)不同程度的拮抗反應(yīng)，表明野23-1與野23-2處于同一分支，親緣關(guān)系非常近，同時(shí)與其他菌株距離較遠(yuǎn)，ITS系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果類似。

菌絲生長長勢中，校園01和康平02長勢相近且同其他菌株相比長勢最好，菌苔直徑較大，表明菌絲體分裂旺盛；野19和康平01次之；野23-1、野23-2和野11中長勢最差，但其菌絲更為潔白、厚實(shí)。

野23-1和野11中子實(shí)體潔白、質(zhì)地厚實(shí)，尤其是野11中子實(shí)體在耐貯性方面表現(xiàn)優(yōu)良，在4℃條件下保存時(shí)間可達(dá)7 d，因其采集時(shí)間為11月，可見該菌株具有較強(qiáng)的抗寒能力。野23-1雖然在七個(gè)菌株中長勢最差，但其菌絲濃密潔白，可能具有較強(qiáng)的抗自溶性，同時(shí)因其與其他菌株間遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，因此有可能作為遺傳育種的親本。此外，在出菇試驗(yàn)中部分菌株不出菇，其中包括生產(chǎn)菌種康平02，而康平01盡管可出菇，但子實(shí)體質(zhì)地松軟、在4℃保存24 h即開始發(fā)生自溶現(xiàn)象，表明兩菌株已經(jīng)出現(xiàn)較嚴(yán)重的退化，因此對(duì)菌株的提純復(fù)壯工作不能間斷。

野23-1和野11中子實(shí)體可溶性多糖含量均顯著高于生產(chǎn)菌株康平01，由此可以看出野生雞腿菇營養(yǎng)成分還是占有優(yōu)勢，如果能提高其產(chǎn)量，則可獲得更大的效益。

通過形態(tài)觀察、菌株間拮抗試驗(yàn)、ITS序列分析等對(duì)7株來源不同（包括5個(gè)野生雞腿菇菌株及2個(gè)生產(chǎn)菌株）的雞腿菇菌株進(jìn)行鑒定及親緣關(guān)系比對(duì)，結(jié)果表明，除野23-1與野23-2親緣關(guān)系較近以外其他各菌株之間遺傳距離較遠(yuǎn)，分別屬于不同的菌株，生長狀態(tài)差異顯著；出菇試驗(yàn)與子實(shí)體差異對(duì)比表明野23-1和野11中，具有子實(shí)體潔白、質(zhì)地堅(jiān)硬、可溶性多糖含量高、耐貯藏的優(yōu)點(diǎn)，但兩菌株產(chǎn)量低、生長速度較慢，相比野23-1優(yōu)勢明顯，可作為選育高產(chǎn)的野生雞腿菇新品種親本。