劉亞琴綜述，曹濟民審校

0 引 言

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料已廣泛應用于各個領域中[1]。納米二氧化硅(silica nanoparticles, SiNPs)作為目前生產(chǎn)應用最多的納米材料，其本身具有熱穩(wěn)定性、化學惰性、高親水性和弱滲透性等獨特的理化性質(zhì)，被廣泛應用于抗微生物制劑的開發(fā)、食品安全檢查、寄生蟲診斷、分子探針、生物成像診斷和腫瘤治療等生物醫(yī)學領域中[2-10]。人工合成的SiNPs可通過皮膚直接接觸、呼吸道吸入、消化道攝入等途徑進入相關(guān)職業(yè)人群和接觸人群體內(nèi)，也可通過生物實驗或醫(yī)療途徑進入動物或人體體內(nèi)。由于納米材料(包括SiNPs)本身結(jié)構(gòu)功能的活躍性，納米材料的生物安全性及納米毒理學研究對納米科技的發(fā)展和應用顯得尤為重要。充分認識SiNPs具體的毒性作用和機制可為將來納米顆粒的安全性研發(fā)提供理論依據(jù)。本文從SiNPs在細胞水平和動物整體水平的毒性作用、影響毒性作用的因素和作用機制等方面作一綜述，籍以為SiNPs的臨床藥物的研發(fā)及其應用生物安全性提供參考。

1 SiNPs的毒性作用

細胞是機體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。SiNPs對多種細胞都有較明顯的毒性作用。在細胞結(jié)構(gòu)方面，SiNPs破壞大鼠心肌細胞系(H9C2細胞)的細胞間隙連接，并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，這種毒性作用呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性[11]。在細胞功能方面，Guerrero等[12]通過觀察SiNPs與急性分離的成年大鼠心肌細胞共培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，SiNPs能降低心肌細胞收縮頻率和肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶的活性，并抑制線粒體膜電位，從而使細胞ATP供應障礙。Kundu等[13]發(fā)現(xiàn)SiNPs可誘導HaCaT細胞中的COX-2表達。SiNPs通過作用于肺動脈平滑肌細胞的瞬時感受器電位通道使細胞內(nèi)游離鈣水平明顯增高[14]。

SiNPs可通過皮膚、呼吸道和消化道等多個途徑進入生物機體，并在多個器官中蓄積，引起相應的生物學效應。Nemmer等[15]通過小鼠腹腔內(nèi)注射粒徑50 nm 的SiNPs，發(fā)現(xiàn)可誘導心臟、肝、肺等多種器官內(nèi)超氧自由基(reactive oxygen species, ROS)升高、炎癥發(fā)生及DNA損傷，尤其是引起心臟中TNF-α的升高。Chen等[16]觀察了SiNPs對不同年齡段大鼠心血管的影響，發(fā)現(xiàn)SiNPs可致心肌缺血性損傷、房室傳導阻滯、纖維蛋白原濃度和血液黏度增加，且老齡鼠對SiNPs的敏感性比年輕和成年大鼠更高。Duan等[17-19]通過靜脈內(nèi)顯微注射，發(fā)現(xiàn)SiNPs對斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的多種器官均有毒性作用，并使斑馬魚器官發(fā)育異常，如出現(xiàn)心臟畸形。以上研究說明SiNPs在細胞和整體動物水平均有毒性作用，并且其毒性作用與SiNPs的粒徑大小、表面修飾方式及暴露劑量密切相關(guān)，也與作用的細胞或生物種類相關(guān)。因此明確SiNPs對不同細胞和生物的作用特點和機制，對深入了解SiNPs的生物安全性差異以及如何合理生物利用SiNPs至關(guān)重要。

2 SiNPs的毒性作用機制

2.1 氧化應激氧化應激是納米材料常見的毒性作用機制，也是較為關(guān)鍵的作用路徑。SiNPs本身具有高反應性和高生物活性，其通過內(nèi)吞作用進入細胞后可誘導細胞內(nèi)ROS升高，導致氧化應激反應和細胞損傷。細胞水平研究表明，SiNPs作用于HaCaT細胞系、神經(jīng)母細胞瘤細胞系和內(nèi)皮細胞等多種細胞，使細胞內(nèi)ROS升高，進一步導致DNA損傷，這種效應并與SiNPs粒徑和劑量相關(guān)[13, 20-22]；其中在HaCaT細胞中SiNPs作用于ROS介導的上游激酶，使Akt/Src和JAK2的磷酸化激活STAT3信號途徑，從而誘導HaCaT細胞中COX-2的表達，并呈現(xiàn)劑量-時間效應。Guo等[23]通過將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)系與SiNPs共孵育24 h后發(fā)現(xiàn)，SiNPs使丙二醛(malondialdehyde, MDA) 、超氧化物羥化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量明顯增加，使谷胱甘肽過氧化物酶含量下降；SiNPs可激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2 related factor 2, Nrf2)介導的抗氧化系統(tǒng)，使Nrf2及其關(guān)鍵下游基因的mRNA表達上調(diào)。SiNP在氧化型低密度脂蛋白刺激后可增強其本身的細胞毒性，促進RAW264.7巨噬細胞脂質(zhì)聚集，從而表現(xiàn)出更明顯的細胞毒性[24]。Hozayen等[25]報道，介孔納米二氧化硅(mesoporous silica nanoparticles, MSN)通過過量產(chǎn)生ROS，抑制抗氧化劑的作用，促進炎癥和組織損傷，從而誘導心臟毒性和肺毒性。

Yu等[26]報道，將徑粒65nm的SiNPs通過鼠尾靜脈注射于小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)SiNPs通過氧化應激途徑激活了TGF-β1/Smad3信號通路使肝臟纖維化，并使肝臟組織進一步出現(xiàn)凋亡壞死，這種效應呈現(xiàn)時間依賴性。Wu等[27]通過給大鼠氣管滴注徑粒15 nm的SiNPs，發(fā)現(xiàn)SiNPs可時間和劑量依賴性地致大腦紋狀體和海馬中ROS明顯蓄積，腦組織中H2O2、GSH、SOD和MDA的含量明顯增加并出現(xiàn)炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)，SiNPs通過不同途徑進入生物體均可引起多個臟器發(fā)生氧化應激反應。

2.2 炎性反應進入生物體的SiNPs可引起炎癥反應，炎癥可使部分細胞變性、壞死，從而引起生物機體機能發(fā)生改變。Guo等[28]通過將SiNPs與Caco-2細胞和HT29-MTX細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SiNPs可改變這些細胞的營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平，并引發(fā)炎癥反應，IL-8和TNFα表達上調(diào)；活性氧物質(zhì)的增加說明炎癥的發(fā)生與氧化應激有關(guān)。吸入性SiNPs使海馬神經(jīng)元炎性因子IL-1β、IL-6和COX-2明顯增加，并呈現(xiàn)出系統(tǒng)性炎癥[29]。SiNPs誘導斑馬魚產(chǎn)生中性粒細胞介導的心臟炎性改變，同時使心臟收縮標記蛋白肌鈣蛋白T表達明顯下調(diào)，說明SiNPs通過中性粒細胞介導的心臟炎癥和收縮蛋白下調(diào)，從而使心功能下降[19]。

Guo等[23]通過將HUVECs與SiNPs共孵育24 h后發(fā)現(xiàn)，SiNPs使細胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 和 MCP-1上調(diào)。Uemura等[30]將SiNPs與RAW264.7細胞系共孵育時，僅表現(xiàn)為TNF-α、IL-6和IL-1β表達增加，細胞內(nèi)ROS無明顯改變，說明SiNPs所引起的炎癥反應不僅僅是氧化應激所致，也與信號轉(zhuǎn)導通路的改變有關(guān)[31]。Yang等[19]將SiNPs與RAW264.7細胞共孵育后，顯示SiNPs通過激活NLRP3炎性小體使細胞分泌炎性因子；同時SiNPs被吞噬進入細胞后進一步促使炎癥的發(fā)生。以上研究均顯示SiNPs可使生物體炎癥反應發(fā)生的危險性增加，炎癥反應是其引發(fā)生物毒性的機制之一。

2.3 線粒體損傷線粒體是大多數(shù)細胞產(chǎn)生能量的主要場所，也是細胞中活性氧的主要來源，所以線粒體損傷可引起細胞或機體發(fā)生功能性障礙。SiNPs可使心肌細胞線粒體膜電位改變，使細胞ATP供應障礙，從而引起心肌細胞功能障礙。Zhang等[32]發(fā)現(xiàn)SiNPs與小鼠精母細胞系共孵育后發(fā)現(xiàn)，SiNPs使線粒體腫脹，線粒體結(jié)構(gòu)損傷，線粒體嵴出現(xiàn)斷裂并逐漸消失，從而使ATP生成障礙，這種效應呈現(xiàn)劑量依賴性。Du等[33]通過氣管灌注粒徑60 nm的SiNPs，發(fā)現(xiàn)心肌細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯異常，并通過線粒體途徑激活caspase-3蛋白，導致心肌細胞凋亡。

2.4 DNA損傷作為細胞遺傳信息的攜帶者，DNA損傷必然會引起細胞功能障礙，從而呈現(xiàn)相應的表型。SiNPs通過使細胞骨架紊亂，可直接破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，使組蛋白磷酸化，從而使DNA無法正常發(fā)揮功能。SiNPs可直接使細胞核結(jié)構(gòu)破壞，從而使細胞發(fā)生凋亡[34]。人腸Caco-2細胞系暴露于SiNPs后，雖在細胞核中無明顯SiNPs顆粒聚集，但細胞內(nèi)DNA明顯損傷，并呈現(xiàn)出濃度依賴性[35]。SiNPs可通過激活PKC信號通路使細胞停留在G0-G1期，出現(xiàn)異常有絲分裂，并最終發(fā)生細胞凋亡。

2.5 其他機制SiNPs可使多種細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而使細胞發(fā)生凋亡。Wu等[36]發(fā)現(xiàn)SiNPs能進入肺泡上皮細胞并在其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積，導致細胞形態(tài)異常和細胞器損傷；SiNPs暴露增加了兩種ER應激標記物BiP和CHOP的表達水平，并使細胞凋亡。SiNPs使LN229細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記物GRP78、GRP94和DDIT3的水平增加，以及IL1B和COX2基因表達顯著上調(diào)，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是SiNPs的毒性機制之一[37]，SiNPs也可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑引起細胞凋亡。Yang等[38]發(fā)現(xiàn)，SiNPs可通過影響鉀通道而抑制HUVECs活性，但SiNPs影響鉀通道的機制尚未完全明確。SiNPs還激活內(nèi)皮和周皮細胞的自噬活動，減弱細胞黏附分子的表達，干擾內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)，最終抑制血管生成。SiNPs導致年輕成年小鼠的情緒功能障礙和認知功能障礙，并通過ERK激活引起神經(jīng)退行性病變和突觸改變[29]。低劑量SiNPs能使肝出現(xiàn)肉芽腫，并逐漸出現(xiàn)纖維化，并在多個器官(肝、心臟、肺)均出現(xiàn)肥大細胞聚集[39]。

總之，SiNPs的毒性作用機制呈現(xiàn)多樣化形式，這在評價SiNPs的毒性作用時需特別注意，以免遺漏有關(guān)作用，造成判斷失誤。

3 影響SiNPs毒性作用的因素

3.1 粒徑納米顆粒粒徑是影響其毒性作用的重要因素。Zhou等[40]將4種粒徑(15、25、50、100 nm)的SiNPs與HUVECs共孵育后發(fā)現(xiàn)，SiNPs引起細胞內(nèi)ROS升高，粒徑越小，ROS升高越明顯。將SiNPs通過鼠尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，粒徑(10、30、50、70、100、300、1000 nm)大小與血小板減少、肝損傷和致死毒性之間呈負相關(guān)；但50 nm SiNPs誘導低體溫效應最為明顯[41]。Lee等[42]發(fā)現(xiàn)，20 nm和50 nm兩種粒徑的SiNPs誘導人內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡途徑截然不同，粒徑20 nm的SiNPs通過ER應激途徑導致細胞凋亡，而50 nm SiNPs通過P13K/AKT/eNOS信號軸誘導細胞自噬從而發(fā)生凋亡。此外，SiNPs的粒徑影響其是否被皮膚吸收，從而發(fā)揮其生物學效應[43]。

3.2 表面修飾SiNPs因為化學性質(zhì)穩(wěn)定使得表面易修飾，從而被廣泛應用于多個領域中。有研究發(fā)現(xiàn)，表面修飾無孔和有孔SiNPs作為載體進行靶向藥物轉(zhuǎn)運治療中具有重要作用[44]。Giovannini等[45]通過穩(wěn)定性更好的水凝膠SiNPs和普通SiNPs分別作用于人膠質(zhì)母細胞瘤和小雞體循環(huán)發(fā)現(xiàn)，水凝膠SiNPs具有更好的生物相容性，同時并無明顯血栓形成或致死情況的發(fā)生。非致死顆粒的表面修飾可以在暴露的生物體內(nèi)的多個器官中產(chǎn)生不同的毒性結(jié)果。甘氨酸功能化SiNPs以類似于可溶性甘氨酸的方式影響斑馬魚胚胎死亡率，發(fā)現(xiàn)兩種SiNPs均可使胚胎大腦、心臟和肝等器官損傷，使得斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷[46]。

3.3 其他因素SiNPs毒性作用受納米顆粒結(jié)構(gòu)形態(tài)、暴露方式、暴露劑量等多種因素影響。而SiNPs本身有晶體和不定形兩種結(jié)構(gòu)，可根據(jù)用途經(jīng)過不同的合成方法合成多種結(jié)構(gòu)。而暴露途徑的不同主要作用的器官也略有不同。呼吸道途徑主要作用于肺[47]，而通過消化道和靜脈注射進入機體主要的靶器官是心臟、肝和脾[26]。

SiNPs毒性作用影響因素繁多，合理設計SiNPs的粒徑及表面修飾是安全應用SiNPs的基礎，同時應提高生物利用率從而減少暴露劑量。

4 展 望

綜合以上毒性作用和作用機制分析發(fā)現(xiàn)，SiNPs雖因其結(jié)構(gòu)和效應的特殊性而被廣泛應用，MSN甚至被應用于藥物載體的研究，但對其生物安全性的評價目前仍不充分，因而不容被忽視。目前針對SiNPs的毒性作用研究，均證實SiNPs可以使生物體的多個系統(tǒng)，如免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等發(fā)生功能紊亂；部分作用機制及影響毒性效應的因素已得到較好的闡釋，如SiNPs的粒徑大小、所帶電荷以及修飾方式均可影響毒性作用。進一步探討SiNPs毒性作用的靶點，以便為后期更好地防治SiNPs毒性事件的發(fā)生提供理論依據(jù)。SiNPs通過內(nèi)吞作用進入細胞的復雜路徑及被溶酶體降解的過程還需進一步研究，這可為SiNPs作為納米藥物載體提供詳細的藥物轉(zhuǎn)運路徑，為后期臨床應用提供更為精準的方案，同時為是否通過改變納米顆粒的粒徑及修飾方式來找到一個低毒性甚至無毒性的納米顆粒提供參考，以便更好應用到醫(yī)療和日常生活中。