王東梅 張展英

摘要：目的? 分析小細(xì)胞肺癌相關(guān)的信號通路，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，探究小細(xì)胞肺癌相關(guān)的關(guān)鍵基因。方法? 從cBioPortal數(shù)據(jù)庫下載110例小細(xì)胞肺癌患者臨床和全基因組測序數(shù)據(jù)，采用R軟件分析數(shù)據(jù)的基本信息，KEGG信號通路富集分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果? 共收集110例小細(xì)胞肺癌患者，其中男性多于女性，大部分患者年齡在60歲及以上，且吸煙人數(shù)多于戒煙人數(shù)，吸煙患者的突變位點數(shù)（n=345.4）高于戒煙組（n=299.70），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;信號通路富集顯示，發(fā)生突變的基因主要與Wnt信號通路、鈣粘蛋白信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路有關(guān)。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示，與小細(xì)胞肺癌相關(guān)的基因有10個，其中PIK3CG和ERBB4的度最大。結(jié)論? 小細(xì)胞肺癌與吸煙有關(guān)，且吸煙可引起基因突變位點數(shù)增多。小細(xì)胞肺癌與Wnt信號通路、鈣粘蛋白信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路有關(guān)，與PIK3CG、ERBB4基因關(guān)系密切。

關(guān)鍵詞：小細(xì)胞肺癌;基因突變;信號通路;蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號：R734.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.025

文章編號：1006-1959（2020）01-0081-04

Analysis of Signal Pathways and Protein Interaction Networks in Small Cell Lung Cancer

WANG Dong-mei1，ZHANG Zhan-ying2

（1.Shanghai Qiming Information Technology Co.，Ltd.，Shanghai 200000，China;

2.MayerDiagnostic Products Co.，Ltd.，Shanghai 200000，China）

Abstract：Objective? To analyze the signaling pathways related to small cell lung cancer， construct a protein interaction network， and explore key genes related to small cell lung cancer. Methods? The clinical and whole-genome sequencing data of 110 small cell lung cancer patients were downloaded from the cBioPortal database. The basic information of the data was analyzed using R software， and the KEGG signal pathway enrichment analysis was performed to construct a protein interaction network. Results? A total of 110 small cell lung cancer patients were collected， including more men than women， most of whom were aged 60 years and over， and the number of smokers was more than the number of people who quit，the number of mutation sites （N=345.4） in smoking patients was higher than that in the smoking cessation group （N=299.70），the difference was statistically significant（P<0.05）. The enrichment of signaling pathways showed that the genes that mutated were mainly related to the Wnt signaling pathway and calcium adhesion Protein signaling pathway and nicotinic acetylcholine receptor signaling pathway are related. The protein interaction network showed that there were 10 genes related to small cell lung cancer， of which PIK3CG and ERBB4 had the highest degree.Conclusion? Small cell lung cancer is related to smoking， and smoking can increase the number of gene mutation sites. Small cell lung cancer is related to the Wnt signaling pathway， the cadherin signaling pathway， and the nicotinic acetylcholine receptor signaling pathway， and is closely related to the PIK3CG and ERBB4 genes.

Key words：Small cell lung cancer;Gene mutation;Signaling pathway;Protein interaction network

受生活環(huán)境、習(xí)慣和遺傳等因素的影響，肺癌的死亡人數(shù)不斷增加，目前已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一。Torre LA等[1]報道，2012年全球新增肺癌患者約180萬，占癌癥總?cè)藬?shù)的12.9%，肺癌死亡人數(shù)約159萬，占癌癥總死亡人數(shù)的19.4%。在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居于惡性腫瘤之首，因此預(yù)防、治療肺癌成為亟需解決的問題。目前肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，大量資料表明，長期大量吸煙是肺癌的一個重要致病因素，吸煙可增加肺癌的發(fā)生風(fēng)險。Dong J等[2]對肺癌新發(fā)易感位點與吸煙的交互作用研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者一些基因突變位點與吸煙量相關(guān)。García Campelo MR等[3]報道，Wnt信號通路作為細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究選擇cBioPortal數(shù)據(jù)庫中小細(xì)胞肺癌的臨床和全基因組測序數(shù)據(jù)，通過信號通路分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因，旨在為發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)理提供幫助，報道如下。

1材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源? 從cBioPortal數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbioportal.org/）中獲取110例小細(xì)胞肺癌患者的臨床和基因測序數(shù)據(jù)。檢索式為（“Lung Cancer”） AND （NOT “MIXED CANCER TYPES”） AND （NOT “Lung Squamous Cell Carcinoma”） AND （NOT “Lung Adenocarcinoma”）AND （NOT “Non-Small Cell Lung Cancer”），獲得Small Cell Lung Cancer（CLCGP， Nat Genet 2012）、Small Cell Lung Cancer（Johns Hopkins， Nat Genet 2012），Small Cell Lung Cancer（U Cologne， Nature 2015）3個數(shù)據(jù)集。選擇臨床資料豐富（包含性別、年齡、吸煙等信息）的數(shù)據(jù)集作為研究對象：Small Cell Lung Cancer （U Cologne，Nature 2015）。

1.2方法? 采用R軟件對收集到的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計，獲得數(shù)據(jù)的基本特征。根據(jù)過濾條件對分子數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理規(guī)則如下：①根據(jù)Variant_Type類型，挑選SNP、INS、DEL三種變異類型;②保留編碼區(qū)變異位點，排除非編碼區(qū)域的變異位點;③排除熱點突變位點;④排除胚系變異位點。對基因進(jìn)行Pathway的富集分析，由于Pathway的條目中包含很多條信號通路，且每個信號通路所包含基因的數(shù)目變化較大，采用Fisher精確檢驗計算P值（P<0.05），再通過多重比較檢驗，確定Pathway的FDR值。檢索KEGG數(shù)據(jù)庫獲得蛋白相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape v3.7.1軟件構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，采用NetworkAnalyzer工具計算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)基本情況? 共收集110例小細(xì)胞肺癌患者，其中男70例（63.64%），女40例（36.36%）?；颊咂骄挲g為64.59歲，其中60歲及以上的共80例（72.73%）。吸煙53例（48.18%），戒煙42例（38.18%），無吸煙經(jīng)歷2例（1.81%），吸煙狀態(tài)信息缺失13例（11.82%）。統(tǒng)計每個樣本的突變總數(shù)，去除離群值后，進(jìn)行單因素的方差分析，結(jié)果顯示吸煙患者的突變位點數(shù)（n=345.4）高于戒煙組（n=299.70），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 Pathway富集分析? 在吸煙（Current）和戒煙（Former）患者中，以超過10%的突變基因為研究對象，進(jìn)行Pathway富集分析，結(jié)果顯示，發(fā)生突變的基因主要與Wnt信號通路（吸煙：P=6.48E-6，F(xiàn)DR=3.54E-4;戒煙：P=8.27E-9，F(xiàn)DR=1.36E-6）、鈣粘蛋白信號通路（吸煙：P=1.40E-5，F(xiàn)DR=5.73E-4;戒煙：P=9.70E-7，F(xiàn)DR=5.30E-5）、煙堿乙酰膽堿受體信號通路（吸煙：P=3.09E-5，F(xiàn)DR=1.01E-3;戒煙：P=2.59E-3，F(xiàn)DR=3.85E-2）有關(guān)，見圖1。

2.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)? 以吸煙中超過10%的突變基因為研究對象，檢索KEGG數(shù)據(jù)庫中蛋白相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。用NetworkAnalyzer工具計算網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)，結(jié)果顯示度大于10的基因有PIK3CG、ERBB4、NOTCH3、NOTCH1、MYLK、EP300、CREBBP、TP53、ARAF、GRM5、GRM1、ADCY8、GNAL、ADRBK2、GLI3、ARRB2、RB1，其中PIK3CG基因在網(wǎng)絡(luò)中度最大為83，ERBB4基因次之為36，且PIK3CG和ERBB4是網(wǎng)絡(luò)中介數(shù)中心性和緊密中心性最大的2個基因，見表1。

3討論

3.1小細(xì)胞肺癌的基本特征? Chen W等[4]研究顯示，中國肺癌患者中男性的發(fā)病率為69.45%，女性發(fā)病率為30.55%。本研究統(tǒng)計了小細(xì)胞肺癌患者的性別比例，發(fā)現(xiàn)男性患小細(xì)胞肺癌的比例高于女性，表明小細(xì)胞肺癌可能與性別有關(guān)。本研究中小細(xì)胞肺癌患者的平均年齡為64.59歲，且大部分為60歲及以上的老年人，表明小細(xì)胞肺癌最常見于60歲以上的老年人。吸煙人數(shù)占總?cè)藬?shù)的48.18%，戒煙人數(shù)占38.18%，有吸煙經(jīng)歷的患者占86.36%，表明小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與吸煙有關(guān)。這與Tonini G等[5]的研究結(jié)論一致，說明吸煙是肺癌的一個最重要的危險因素，其中87%的肺癌患者死亡與吸煙有關(guān)。同時，吸煙患者的基因突變位點數(shù)高于戒煙患者[6]，表明吸煙容易引起與癌癥相關(guān)的基因突變。

3.2 Pathway富集分析? 目前已有研究顯示，Wnt信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。Wnt信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、運動及凋亡等過程，為細(xì)胞發(fā)育所需，調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為及細(xì)胞的相互作用，Vaughan AE等[7]發(fā)現(xiàn)激活Wnt信號通路可增加腫瘤發(fā)生的概率。尼古丁對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用主要通過尼古丁乙酰膽堿受體實現(xiàn)，除中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元，全身許多細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及腸道和肺的上皮細(xì)胞均表達(dá)尼古丁乙酰膽堿受體。Schuller HM[8]研究表明，尼古丁及尼古丁乙酰膽堿受體在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，包括調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、新生血管的形成等。本研究顯示，發(fā)生突變的基因主要與Wnt信號通路、鈣粘蛋白信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路有關(guān)。Wnt信號通路主要通過3種途徑進(jìn)行傳導(dǎo)：①經(jīng)典Wnt信號途徑（Wnt/β-catenin信號通路），該通路激活后將募集細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin，隨后β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活靶基因表達(dá)，而在沒有Wnt信號存在時，β-catenin則被APC-Axin-GSK3β-CK復(fù)合體泛素化降解，通路即關(guān)閉;②Wnt/PcR通路：主要作用可能是參與調(diào)控胚胎發(fā)育時期細(xì)胞骨架的重排;③Wnt/Ca2+ 途徑：該通路由Wnt-5a或Wnt-1l激活，活化后的CDK2和PKC使胞內(nèi)鈣離子濃度升高，導(dǎo)致NFAT在核內(nèi)蓄積誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。E-鈣粘蛋白是參與細(xì)胞間粘附連接的重要分子，發(fā)揮著維持細(xì)胞極性和組織結(jié)構(gòu)完整性的功能，其主要通過與β-連環(huán)蛋白形成復(fù)合體介紹同質(zhì)細(xì)胞之間的相互粘附抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲;同時E-鈣粘蛋白競爭性和β-連環(huán)蛋白結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)游離型β-連環(huán)蛋白水平，從而抑制其參與Wnt信號通路細(xì)胞增殖基因的表達(dá)。E-鈣粘蛋白復(fù)合體的異?？赡軙鸺?xì)胞之間的黏附能力減弱以及腫瘤細(xì)胞的運動能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞容易脫離、侵襲和轉(zhuǎn)移。小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系均存在尼古丁乙酰膽堿受體，目前發(fā)現(xiàn)尼古丁在肺癌細(xì)胞中的主要作用為促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞增殖和抑制藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

3.3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)? 本研究構(gòu)建的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，度大于10的基因有PIK3CG、ERBB4、NOTCH3、NOTCH1、MYLK、EP300、CREBBP、TP53、ARAF、GRM5、GRM1、ADCY8、GNAL、ADRBK2、GLI3、ARRB2、RB1，提示這些基因可能與小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)，其中PIK3CG，ERBB4是網(wǎng)絡(luò)中度最大的2個基因，表明PIK3CG和ERBB4基因在網(wǎng)絡(luò)中起重要的作用。這與很多研究的結(jié)論類似，如：PIK3CA基因編碼的蛋白是PI3Ks的催化亞單位，PI3Ks是一種脂激酶家族。PIK3CA基因的突變可以導(dǎo)致PI3Ks的催化活性異常增強(qiáng)，促使細(xì)胞發(fā)生癌變，其機(jī)制主要為PI3K/AKT通路是細(xì)胞信號傳導(dǎo)中一個重要通路，PI3Ks能特異性磷酸化磷脂酰肌醇的3位羥基，產(chǎn)生第二信使肌醇類物質(zhì)如PIP3，PIP3可促使AKT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上并被PDK1/PDK2活化，AKT則是PI3K/AKT信號通路中核心因子，異?；罨腁KT會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。Kurppa KJ等[10]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中存在ERBB4致癌突變，該基因編碼的蛋白屬于表皮生長因子受體家族，該家族包括HER1、HER2、HER3及HER4，也屬于受體酪氨酸激酶家族。ERBB4可被neuregulins等蛋白激活，從而磷酸化下游蛋白，參與細(xì)胞的有絲分裂和分化，其突變與多種癌癥有關(guān)。Westhoff B等[13]在原代NSCLC上皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)Notch1基因突變的細(xì)胞被ν-分泌酶抑制劑選擇性地殺死，提示腫瘤細(xì)胞增殖的優(yōu)勢依賴Notch信號。Notch基因編碼一類高度保守的細(xì)胞表面受體，這些受體調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的發(fā)育，從而Notch信號影響細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生的多個過程，包括多能祖細(xì)胞的分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及細(xì)胞邊界的形成。Fernandez-Cuesta L等[14]的研究表明，參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要抑癌基因TP53是小細(xì)胞肺癌的特征性基因變異。TP53基因又稱為P53，是一種抑癌基因，該基因的異常與超過半數(shù)的腫瘤相關(guān)。p53還是一個轉(zhuǎn)錄因子，與很多靶基因有關(guān)，影響細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期的調(diào)控過程，比如編碼細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制蛋白的p21基因和凋亡前體蛋白BAX的編碼基因等。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌與吸煙有關(guān)，且吸煙會引起基因突變位點數(shù)量的增加。小細(xì)胞肺癌與Wnt信號通路、鈣粘蛋白信號通路、煙堿乙酰膽堿受體信號通路有關(guān)，可能與PIK3CG、ERBB4基因密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[2]Dong J，Hu Z，Wu C，et al.Association analyses identify multiple new lung cancer susceptibility loci and their interactions with smoking in the Chinese population[J].Nat Genet，2012，44（8）：895-899.

[3]García Campelo MR，Alonso Curbera G，Aparicio Gallego G，et al.Stem cell and lung cancer development：blaming the Wnt，Hh and Notch signalling pathway[J].Clin Transl Oncol，2011，13（2）：77-83.

[4]Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[5]Tonini G，D'Onofrio L，Dell'Aquila E，et al.New molecular insights in tobacco-induced lung cancer[J].Future Oncol，2013（9）：649-655.

[6]Wallis CJD，Satkunasivam R，Butaney M，et al.Association Between Smoking and Survival Benefit of Immunotherapy in Advanced Malignancies：A Systematic Review and Meta-Analysis[J].Am J Clin Oncol，2019，42（9）：1.

[7]Vaughan AE，Halbert CL，Wootton SK，et al.Lung cancer in mice induced by the jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein is not maintained by rare cancer stem cells，but tumorigenicity does correlate with Wnt pathway activation[J].Mol Cancer Res，2012，10（1）：86-95.

[8]Schuller HM.Is cancer triggered by altered signalling of nicotinic acetylcholine receptors[J].Nat Rev Cancer，2009，9（3）：195-205.

[9]Kase S，Sugio K，Yamazaki K，et al.Expression of E-cadherin and beta-catenin in human non-small cell lung cancer and the clinical significance[J].Clin Cancer Res，2000，6（12）：4789-4796.

[10]Kurppa KJ，Denessiouk K，Johnson MS，et al.Activating ERBB4 mutations in non-small cell lung cancer[J].Oncogene，2016，35（10）：1283-1291.

[11]Tan X，Chen M.MYLK and MYL9 expression in non-small cell lung cancer identified by bioinformatics analysis of public expression data[J].Tumour Biol，2014，35（12）：12189-12200.

[12]Peifer M，F(xiàn)ernández-Cuesta L，Sos ML，et al.Integrative genome analyses identify key somatic driver mutations of small-cell lung cancer[J].Nat Genet，2012，44（10）：1104-1110.

[13]Westhoff B，Colaluca IN，D'Ario G，et al.Alterations of the Notch pathway in lung cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（52）：22293-22298.

[14]Fernandez-Cuesta L，Peifer M，Lu X，et al.Frequent mutations in chromatin-remodelling genes in pulmonary carcinoids[J].Nat Commun，2014（5）：3518.

收稿日期：2019-09-02;修回日期：2019-10-24

編輯/錢洪飛