廖世民，范晶，王子衛(wèi)，何苗

(1.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 重慶市腫瘤研究所 重慶市腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤中心，重慶 400030 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院a.急診科b.普通外科，重慶 400016)

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病，伴隨人口老齡化，其發(fā)病率和患病率呈上升趨勢[1]。當(dāng)前實(shí)體腫瘤的治療采用以手術(shù)為主，化療、放療、靶向治療、中醫(yī)藥治療為輔的綜合治療，但療效欠佳。免疫治療是近年腫瘤治療領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[2]。2018年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎也授予了研究腫瘤免疫治療的美國和日本科學(xué)家，人類治療腫瘤的觀念也發(fā)生改變。程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death-1，PD-1)、程序性細(xì)胞死亡配體-1(programmed cell death ligand-1，PD-L1)及其抑制劑是腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)。PD-1常存在于免疫細(xì)胞表面，與其配體PD-L1結(jié)合后產(chǎn)生負(fù)反饋信號，抑制免疫功能。此功能作為保護(hù)機(jī)制使宿主免受自身免疫系統(tǒng)的錯(cuò)誤攻擊，但部分腫瘤細(xì)胞也可能利用此機(jī)制(過表達(dá)PD-L1)逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)控。PD-1/PD-L1抑制劑的作用是阻止負(fù)向反饋信號，激活免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的監(jiān)控。結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是十分常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國部分地區(qū)僅次于肺癌，已成為第二大瘤種[3]，當(dāng)前其免疫治療尚處于探索階段?，F(xiàn)總結(jié)腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)理論，介紹PD-1/PD-L1在CRC中的研究進(jìn)展。

1 腫瘤免疫監(jiān)控與逃逸

人體免疫系統(tǒng)的一項(xiàng)重要功能是識別和清除腫瘤細(xì)胞，即腫瘤免疫監(jiān)控。此過程涉及3種免疫細(xì)胞：①抗原提呈細(xì)胞，以樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)為代表，其功能是識別和攝取腫瘤產(chǎn)生的腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)，然后提呈給T淋巴細(xì)胞；②T淋巴細(xì)胞，被DCs激活，識別并攻擊、清除產(chǎn)生TAA的腫瘤細(xì)胞；③B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生針對TAA的特異抗體。其他免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T調(diào)控細(xì)胞等。這些細(xì)胞與腫瘤周圍基質(zhì)細(xì)胞一起構(gòu)成腫瘤免疫微環(huán)境，共同參與腫瘤免疫監(jiān)控[4-5]。

雖然機(jī)體存在抗腫瘤免疫監(jiān)控，但腫瘤細(xì)胞也存在逃逸免疫識別的機(jī)制。此機(jī)制可概括為：①部分清除(腫瘤細(xì)胞清除不完全)；②維持平衡(腫瘤細(xì)胞處于休眠或靜息狀態(tài)，但積累著遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)變異)；③逃逸增殖(腫瘤細(xì)胞已耐受機(jī)體的免疫監(jiān)控，并逃逸免疫攻擊)。逃逸免疫識別的機(jī)制由抑制T細(xì)胞免疫的檢查點(diǎn)蛋白調(diào)控，包括細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4、PD-1、PD-L1、淋巴細(xì)胞激活蛋白3等[6]。由于免疫檢查點(diǎn)抑制T細(xì)胞免疫，腫瘤細(xì)胞可利用免疫檢查點(diǎn)抑制T細(xì)胞的免疫攻擊，當(dāng)前觀點(diǎn)認(rèn)為部分腫瘤組織PD-1/PD-L1的表達(dá)顯著增強(qiáng)。

2 PD-1/PD-L1與腫瘤免疫

PD-1是免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，主要在T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、DCs、巨噬細(xì)胞的胞膜表達(dá)，而其配體PD-L1通常在腫瘤細(xì)胞表達(dá),亦可在激活的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面表達(dá)。PD-L1與PD-1結(jié)合后可抑制T細(xì)胞增殖、分化以及分泌細(xì)胞因子。因抑制了T細(xì)胞的活性，T細(xì)胞的腫瘤免疫監(jiān)控作用受損，導(dǎo)致腫瘤免疫耐受和逃逸[7]。

目前認(rèn)為PD-1/PD-L1高表達(dá)可能與部分腫瘤預(yù)后不良相關(guān)，其高表達(dá)也是預(yù)測腫瘤抗PD-1/PD-L1免疫治療療效的標(biāo)志之一[4-7]。研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-1/PD-L1治療對部分實(shí)體腫瘤療效較好，這部分腫瘤的錯(cuò)配修復(fù)功能異常(mismatch repair deficiency，dMMR)導(dǎo)致了高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-high,MSI-H)，dMMR產(chǎn)生的大量變異腫瘤抗原誘導(dǎo)免疫細(xì)胞大量浸潤(腫瘤免疫治療的基礎(chǔ))[6-7]。腫瘤細(xì)胞激活免疫檢查點(diǎn)信號如PD-1/PD-L1等抑制了T細(xì)胞免疫攻擊，故針對免疫檢查點(diǎn)的抑制劑如PD-1/PD-L1抑制劑Pembrolizumab，可通過激活T細(xì)胞的免疫攻擊實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用[8]。故腫瘤MMR狀態(tài)以及PD-1/PD-L1的表達(dá)水平對判斷免疫治療效果至關(guān)重要。

不少抑制PD-1/PD-L1的單克隆抗體已經(jīng)上市，并用于不同惡性腫瘤的免疫治療，如轉(zhuǎn)移性黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等。相對于其他免疫治療，PD-1/PD-L1抑制劑的抗腫瘤療效(包括有效率和持續(xù)時(shí)間)更顯著，且毒副作用更小。

3 CRC的免疫微環(huán)境

在CRC中，相對于錯(cuò)配修復(fù)功能正常(mismatch repair-proficient,pMMR)/微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stable,MSS)的CRC，dMMR/MSI-H-CRC具有更積極的免疫微環(huán)境，CD8+和CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤腫瘤組織更明顯[8]。在dMMR/MSI-H-CRC中，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)的密度是pMMR/MSS-CRC的10～50倍[9]。但即使在如此積極的免疫微環(huán)境中，dMMR/MSI-H-CRC也未被免疫清除。一項(xiàng)研究分析了CRC細(xì)胞、TIL細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的PD-L1表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn)，dMMR/MSI-H-CRC組織高表達(dá)PD-L1，且主要在TIL等免疫細(xì)胞表達(dá)，并非是CRC癌細(xì)胞，這與黑色素瘤、腎癌、肺癌的PD-L1主要在癌細(xì)胞表達(dá)不同，而MSS-CRC幾乎不表達(dá)PD-L1[8]。提示MSI-H-CRC可能通過增強(qiáng)PD-1/PD-L1信號通路抑制免疫監(jiān)控，導(dǎo)致腫瘤的免疫耐受和逃逸?；诖耍琈SI-H-CRC可能是抗PD-1/PD-L1免疫治療的候選疾病。

Cantero-Cid等[10]發(fā)現(xiàn)，CRC組織中存在大量CD14+單核巨噬細(xì)胞和CD4+淋巴細(xì)胞浸潤，其中單核巨噬細(xì)胞表達(dá)PD-L1(腫瘤細(xì)胞并無PD-L1表達(dá))，淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1。提取CRC患者外周血中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與患者的癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)CD14+細(xì)胞表達(dá)PD-L1，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞衰竭，而使用PD-1抗體可恢復(fù)淋巴細(xì)胞增殖[10]，這也證實(shí)了CRC免疫微環(huán)境的特點(diǎn)。

4 CRC中PD-1/PD-L1的基礎(chǔ)研究

4.1PD-1/PD-L1與表觀遺傳 表觀遺傳是指不涉及DNA序列改變的，并可隨細(xì)胞分裂而遺傳的基因組修飾和調(diào)節(jié)，DNA甲基化和微RNA是其中的重點(diǎn)。在CRC中作為癌基因的PD-L1可能受DNA甲基化和微RNA的調(diào)節(jié)。Elashi等[11]發(fā)現(xiàn)，CRC患者外周血中PD-L1顯著升高，且PD-L1基因啟動子存在異常DNA低甲基化，低甲基化程度與PD-L1升高程度密切相關(guān)。提示CRC患者PD-L1的表達(dá)可因DNA的異常低甲基化而增強(qiáng)，并認(rèn)為抗PD-L1聯(lián)合去甲基化抑制劑治療CRC可能更有效。此外，Ashizawa等[12]研究發(fā)現(xiàn)，dMMR/MSI-H-CRC中的miR-148a-3p可直接與PD-L1的3′非編碼區(qū)結(jié)合，并抑制PD-L1的表達(dá)。但miR-148a-3p在dMMR/MSI-H-CRC中的表達(dá)降低(與PD-L1高表達(dá)負(fù)相關(guān))，若在T淋巴細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)模型中過表達(dá)miR-148a-3p，則可抑制癌細(xì)胞表達(dá)PD-L1，進(jìn)而減少T細(xì)胞凋亡[12]。提示miR-148a-3p負(fù)向調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞表達(dá)PD-L1，miR-148a-3p的減少將導(dǎo)致PD-L1表達(dá)的增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。

4.2PD-1/PD-L1與結(jié)腸癌干細(xì)胞 腫瘤干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制、自我更新和多向分化能力的腫瘤細(xì)胞，這類細(xì)胞具有成瘤能力，是腫瘤細(xì)胞增殖和形成轉(zhuǎn)移瘤的基礎(chǔ)。結(jié)腸癌干細(xì)胞的功能可能與PD-1/PD-L1的表達(dá)相關(guān)。Wei等[13]發(fā)現(xiàn)，CD133+CD44+的結(jié)腸癌干細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，PD-L1通過增強(qiáng)“干性”基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞自我更新；且體內(nèi)外耐化療藥的結(jié)腸癌干細(xì)胞PD-L1的表達(dá)均顯著增強(qiáng)；PD-L1還可增強(qiáng)結(jié)腸癌干細(xì)胞在裸鼠上的成瘤率。PD-L1可能是通過上調(diào)高遷移族蛋白A1(high mobility group AT hook 1,HMGA1)，激活HMGA1介導(dǎo)的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路，導(dǎo)致結(jié)腸癌干細(xì)胞擴(kuò)增；相反，下調(diào)HMGA1可抑制PD-L1導(dǎo)致的腫瘤干細(xì)胞擴(kuò)增，突顯了HMGA1在PD-L1介導(dǎo)的結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新中的重要作用[13]。此外，PD-L1的表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物以及HMGA1的表達(dá)呈正相關(guān)[13]，所以PD-L1可通過激活HMGA1介導(dǎo)的信號通路維持結(jié)腸癌干細(xì)胞的自我更新。

4.3PD-1/PD-L1與MMR基因 MMR基因是從遺傳性非息肉性大腸癌中分離出來的遺傳易感基因，該基因突變會導(dǎo)致細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷，表現(xiàn)為復(fù)制錯(cuò)誤或MSI，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。遺傳性非息肉性大腸癌是MMR基因發(fā)生胚系突變所致的單基因顯性遺傳病，又稱Lynch綜合征，在部分MSI的散發(fā)CRC中也存在MMR基因突變。CRC中MMR基因的功能狀態(tài)與PD-L1關(guān)系密切。Ahtiainen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1在癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的表達(dá)重合率很高，在dMMR-CRC中，不論是癌細(xì)胞還是免疫細(xì)胞，PD-L1和PD-1的表達(dá)均顯著強(qiáng)于pMMR-CRC。Liu等[15]比較pMMR-CRC與dMMR-CRC發(fā)現(xiàn)，dMMR-CRC組織中淋巴細(xì)胞浸潤和PD-L1的表達(dá)均較pMMR-CRC更顯著，并認(rèn)為dMMR-CRC對免疫治療敏感的原因是淋巴細(xì)胞浸潤和PD-L1陽性表達(dá)。

Droeser等[16]發(fā)現(xiàn)，在pMMR-CRC中PD-L1也有一定程度的表達(dá)，且PD-L1的表達(dá)與CD8+淋巴細(xì)胞浸潤、較早的T分期(腫瘤浸潤腸壁深度)、無淋巴結(jié)或血管轉(zhuǎn)移、更低的腫瘤分級、更好的預(yù)后等相關(guān)，因而pMMR-CRC中PD-L1的高表達(dá)可能是CRC預(yù)后較好的指標(biāo)之一。Smith等[17]認(rèn)為，對pMMR-CRC使用抗PD-1治療也能獲益，并認(rèn)為T細(xì)胞對致瘤性基因突變的反應(yīng)是普遍性。綜上，PD-1/PD-L1在dMMR/pMMR-CRC中均有表達(dá)，但在dMMR-CRC中可能更顯著。

5 CRC中PD-1/PD-L1的臨床研究

5.1PD-1/PD-L1與CRC預(yù)后 PD-1/PD-L1與CRC預(yù)后的關(guān)系尚有爭議。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)PD-L1與CRC患者總生存期縮短、無進(jìn)展生存期縮短、腫瘤分化更低等相關(guān)，但與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分級分期、淋巴轉(zhuǎn)移等無關(guān)。提示PD-L1高表達(dá)可能是CRC預(yù)后不良的分子標(biāo)志物，也是臨床采用抗PD-1/PD-L1治療的依據(jù)。Shen等[19]認(rèn)為，PD-L1高表達(dá)與CRC預(yù)后不良關(guān)系密切，且PD-L1高表達(dá)與CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤高分期相關(guān)。

但Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1的高表達(dá)與CRC相對較好的預(yù)后相關(guān)，特別是對于pMMR-CRC患者，這與Droeser等[16]的研究結(jié)果相近。Berntsson等[21]利用免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，若結(jié)腸癌(包括左半、右半結(jié)腸癌)組織中浸潤的免疫細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，或右半結(jié)腸癌(除外左半結(jié)腸癌、直腸癌)中浸潤的免疫細(xì)胞高表達(dá)PD-1，則患者的5年生存率更高，而癌細(xì)胞表達(dá)的PD-L1與CRC預(yù)后無關(guān)。Hamada等[22]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中浸潤的淋巴細(xì)胞若表達(dá)PD-L1則與腫瘤明顯的MSI、高程度CpG島甲基化、BRAF基因突變、腫瘤抗原升高等因素密切相關(guān)，但PD-1、PD-L1的表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后并無顯著關(guān)聯(lián)。綜上，PD-1/PD-L1與CRC預(yù)后的關(guān)系仍有待探索。

5.2放化療與PD-1/PD-L1 放化療是除手術(shù)外CRC最重要的治療方式。Tominaga等[23]采用酶聯(lián)免疫吸附法研究117例低位直腸癌患者放化療前后血漿游離PD-1/PD-L1的水平發(fā)現(xiàn)，PD-L1在放化療后明顯升高，但PD-1變化不明顯。Roxburgh等[24]研究了8例Ⅱ、Ⅲ期直腸癌患者發(fā)現(xiàn)，采用FOLFOX(奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣)方案新輔助化療4個(gè)療程后，直腸癌組織PD-1/PD-L1的表達(dá)均較化療前增強(qiáng)。Hecht等[25]也研究了放化療對直腸癌PD-L1表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放化療可增加癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)率。Jomrich等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大約17%的直腸癌組織在放化療后出現(xiàn)淋巴細(xì)胞PD-L1表達(dá)增強(qiáng)，但直腸癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)變化不明顯。以上研究提示，放化療可能改變腫瘤免疫微環(huán)境，放化療結(jié)合抗PD-L1治療可能是進(jìn)展期直腸癌更有效的治療方案。

5.3抗PD-1/PD-L1的療效 當(dāng)前對CRC的抗PD-1/PD-L1治療已取得進(jìn)展。Capasso等[27]在人源化小鼠模型上研究抗PD-1治療對人結(jié)腸癌細(xì)胞移植的影響發(fā)現(xiàn)，抗PD-1治療可增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，并抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。在MSI-H-CRC動物模型中這種反應(yīng)更顯著，且與腫瘤中更多的CD8+γ干擾素+T淋巴細(xì)胞相關(guān)[27]。

Ott等[28]研究發(fā)現(xiàn)，直腸肛管癌PD-L1的陽性表達(dá)率為74%(38/43)。采用PD-1抗體治療24例PD-L1陽性肛管鱗狀細(xì)胞癌患者，每2周給予10 mg/kg的Pembrolizumab，隨訪到治療結(jié)束后56周發(fā)現(xiàn)，4例(17%)緩解，10例(42%)穩(wěn)定，疾病控制率為58%，16例(67%)有藥物相關(guān)不良反應(yīng)，主要為腹瀉、惡心、乏力，并無藥物導(dǎo)致的死亡[28]，顯示了Pembrolizumab治療肛管癌的有效性和安全性。

Le等[8]采用Pembrolizumab治療11例dMMR/MSI-H-mCRC患者、21例pMMR/MSS-mCRC患者及9例dMMR的非CRC患者，方案為10 mg/kg，每2周1次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dMMR/MSI-H-mCRC組患者的客觀有效率為40%(4/10)，20周時(shí)疾病無進(jìn)展生存率為78%(7/9)；但pMMR/MSS-mCRC組客觀有效率為0%(0/18)，20周時(shí)疾病無進(jìn)展生存率僅為11%(2/18)。深入分析發(fā)現(xiàn)，Lynch綜合征相關(guān)腫瘤(胚系突變)的客觀有效率為27%(3/11)，而非Lynch綜合征的dMMR腫瘤(包括CRC與其他腫瘤)的客觀有效率為100%(6/6)[8]。提示Pembrolizumab治療dMMR/MSI-H-CRC的有效率明顯優(yōu)于pMMR/MSS-CRC，且在非Lynch綜合征的dMMR腫瘤(包括CRC與其他腫瘤)中可能療效更顯著。美國食品藥品管理局于2017年底批準(zhǔn)抗PD-1藥物Pembrolizumab用于轉(zhuǎn)移性MSI-H-CRC的臨床治療，后來Le等[29]研究一線化療方案失敗的MSI-H-mCRC患者，方案是每3周給予Pembrolizumab 200 mg，結(jié)果總體客觀有效率為33%(21/63)，有2例甚至實(shí)現(xiàn)完全緩解，中位無進(jìn)展生存期為4.1個(gè)月，1年無進(jìn)展生存率達(dá)41%，1年總生存率達(dá)76%。另有學(xué)者使用Pembrolizumab聯(lián)合mFOLFOX6(奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣)化療方案治療30例不可切除的CRC(包括dMMR和pMMR病例)，結(jié)果15例實(shí)現(xiàn)完全緩解或部分緩解，1例dMMR病例實(shí)現(xiàn)病理緩解，14例保持穩(wěn)定[30]。以上研究提示Pembrolizumab在CRC治療中的價(jià)值。

Overman等[31]采用Nivolumab(納武利尤單抗，一種PD-1抗體)治療74例dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性CRC患者，方案為每2周給予3 mg/kg，隨訪至少12周發(fā)現(xiàn)，客觀有效率為31%(23/74)，疾病控制率為69%(51/74)，其中8例的治療有效時(shí)間持續(xù)了至少1年。用藥1年的無進(jìn)展生存率為50%，總生存率為73%。2017年8月美國食品藥品管理局批準(zhǔn)了Nivolumab用于dMMR/MSI-H轉(zhuǎn)移性CRC患者的治療。

Yanik等[32]研究了23例合并人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的直腸肛管癌患者發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞PD-L1的表達(dá)與免疫細(xì)胞的浸潤密度和CD8+T細(xì)胞密度相關(guān)，但有無HIV感染卻與肛管癌組織PD-L1表達(dá)、免疫細(xì)胞浸潤程度以及構(gòu)成無顯著相關(guān)性。因而對于HIV感染的肛管癌患者也可以嘗試抗PD-1/PD-L1免疫治療。

6 展 望

近年來腫瘤的免疫治療取得了重大進(jìn)展，抗PD-1藥物如Pembrolizumab已正式用于黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌等腫瘤的治療。CRC的相關(guān)研究也正在積極進(jìn)行中。當(dāng)前觀點(diǎn)認(rèn)為，抗PD-1治療的效果在dMMR/MSI-H-CRC中可能更好，美國食品藥品管理局也批準(zhǔn)Pembrolizumab、Nivolumab等抗PD-1藥物用于轉(zhuǎn)移性MSI-H-CRC的治療。相信隨著臨床數(shù)據(jù)的積累，免疫治療可能成為CRC除手術(shù)、化療、放療、靶向治療之外的又一選擇。當(dāng)然，CRC的免疫治療尚有很多疑問，如免疫治療的時(shí)機(jī)，免疫治療與手術(shù)、化療、放療、靶向治療的關(guān)系以及聯(lián)合運(yùn)用方案，免疫治療的療效與毒副作用等，這些需要未來進(jìn)一步探索研究。