勵(lì)志英

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院針灸部，天津市 300000

Micro RNA(miRNA)是一類小型非編碼RNA，長度為18～25bp，與其靶mRNA結(jié)合后，能夠在轉(zhuǎn)錄水平直接調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在許多細(xì)胞生物學(xué)和分子通路中起著核心調(diào)控作用。大量證據(jù)表明，miRNA參與增殖、造血、代謝、免疫功能和卒中后抑郁等多種疾病的生理和病理過程的調(diào)控[1]。近年來臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，卒中后miRNAs表達(dá)譜異常，miRNAs是促進(jìn)缺血性卒中發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵介質(zhì)。目前，已有研究者提出將miRNAs列為卒中的新型生物標(biāo)志物，用于卒中的診斷、治療、預(yù)后評(píng)價(jià)。最新研究表明，使用間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體來表達(dá)miRNAs，用于治療卒中等各種疾病，并取得了較好的效果[2]。

1 腦缺血后腦內(nèi)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)

腦缺血/再灌注損傷引起腦內(nèi)一系列復(fù)雜的病理生理學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括多種細(xì)胞生物學(xué)過程出現(xiàn)異常。在缺血階段，由于血液供應(yīng)迅速減少導(dǎo)致細(xì)胞正常離子梯度破壞、細(xì)胞興奮性毒性和神經(jīng)元死亡；而在再灌注階段，氧的恢復(fù)導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷；血流的恢復(fù)導(dǎo)致炎癥和水腫，也進(jìn)一步增加了缺血組織神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死的風(fēng)險(xiǎn)。

近年來，腦缺血后的炎癥反應(yīng)逐漸受到重視。缺血后，腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞首先被激活，釋放TNFα等致炎因子，并形成持續(xù)放大的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]。缺血還使血管內(nèi)皮活化，表達(dá)趨化因子及黏附分子加重炎癥反應(yīng)；并釋放MMP9等破壞血腦屏障[4]。在趨化因子等的作用下，循環(huán)中的白細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)等通過損傷的血腦屏障侵入腦實(shí)質(zhì)，促使膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步活化并協(xié)同產(chǎn)生更多的炎癥因子，加重神經(jīng)損害。如中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞能生成活性氧和TNFα等致炎因子，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌致炎因子，使神經(jīng)損傷加劇。中性粒細(xì)胞還表達(dá)MMPs破壞血腦屏障，進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤；中性粒細(xì)胞本身還發(fā)生粘附聚集，阻塞微血管，引起繼發(fā)血栓[5]。

從時(shí)間上來看，缺血后幾分鐘炎癥反應(yīng)就已經(jīng)啟動(dòng)，缺血后3h內(nèi)缺血區(qū)就可見中性粒細(xì)胞浸潤，并一直持續(xù)至再灌注后的24h。大量前炎癥介質(zhì)，如化學(xué)因子和細(xì)胞因子等的爆發(fā)性表達(dá)也有著同樣的時(shí)間規(guī)律。對(duì)卒中動(dòng)物的研究表明，抑制中性粒細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)可減少腦缺血后神經(jīng)變性，并改善神經(jīng)功能。但同樣的抗炎治療在卒中患者上卻未得到類似的療效。

2 miRNAs表達(dá)水平在腦缺血后出現(xiàn)變化

多種miRNAs的表達(dá)水平在腦缺血后很快就出現(xiàn)顯著變化，甚至缺血后30min內(nèi)就出現(xiàn)改變。大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠模型，其缺血皮層中的許多miRNAs(如miR-155、miR-297a、miR-466f、miR-466h和miR-1224)在MCAO后24h內(nèi)顯著上調(diào)。Liu等[6]以MCAO大鼠為模型，于缺血后0～168h的不同時(shí)間點(diǎn)分析腦組織miRNAs表達(dá)譜。共發(fā)現(xiàn)346個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中miR-21、miR-142-3p、miR-142-5p和miR-146a在缺血后48～168h較急性期(0～24h)顯著上調(diào)；而miR-196a/b/c、miR-224和miR-324-3p的表達(dá)趨勢(shì)則相反。此外，miR-206、miR-290、miR-291a-5p和miR-30c-1*從0～24h增加，隨后從48～168h逐漸減少，且表達(dá)量與梗死面積呈正相關(guān)。

3 miRNAs調(diào)節(jié)腦缺血后的炎癥反應(yīng)

許多miRNAs被證實(shí)可調(diào)節(jié)腦缺血后的炎癥反應(yīng)，其調(diào)節(jié)炎癥的主要機(jī)制是調(diào)控靶細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)。

3.1 miRNAs對(duì)缺血后神經(jīng)元的影響 Yu等[7]在糖氧剝奪的條件下培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元，轉(zhuǎn)染腺病毒使其過表達(dá)miR-22，可降低神經(jīng)元表達(dá)促炎因子TNF-α、IL-6、COX2和iNOS的水平，提高抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平。此外，miR-22還可降低短暫局灶性腦缺血引起的炎癥、梗死灶體積、神經(jīng)功能損傷。miR-22對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)是通過降低NF-κB協(xié)同激活因子(NCOA1)的表達(dá)，進(jìn)而顯著抑制NF-κB活性實(shí)現(xiàn)的。此外，miR-22通過抑制Caspase 3活性，增加抗凋亡基因bcl-2表達(dá)而降低凋亡基因bax表達(dá)，進(jìn)而降低皮層神經(jīng)元的凋亡。

抑制NF-κB表達(dá)已經(jīng)被證實(shí)具有誘導(dǎo)腦缺血后神經(jīng)保護(hù)的作用。其他miRNAs對(duì)炎癥的調(diào)控作用也與NF-κB通路關(guān)系密切，但受其調(diào)節(jié)的靶mRNA仍不清楚。缺血性腦損傷可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein 78, GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白，也是NF-κB的激活因子，其在應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)提高，以維護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能及維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡。miR-181a過表達(dá)可誘導(dǎo)GRP78表達(dá)增加，從而加劇缺血損傷。Xu等[8]以MCAO大鼠為模型，通過側(cè)腦室和靜脈給藥途徑觀察miR-181a拮抗劑的作用。發(fā)現(xiàn)miR-181a拮抗劑治療后，腦梗死面積明顯縮小，神經(jīng)功能缺損改善；抑制miR-181a表達(dá)還可降低NF-κB活化和白細(xì)胞中樞浸潤，且治療效果至少能維持1個(gè)月。miR-181a拮抗劑的靶點(diǎn)包括bcl2和x連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)。

miRNAs是調(diào)控Toll樣受體信號(hào)通路的重要因子。骨髓分化因子88(MyD88)是Toll樣受體、IL-1受體等的關(guān)鍵下游配體，能介導(dǎo)NF-κB的核易位。miR-203過表達(dá)可通過降低MyD88水平，進(jìn)而抑制下游NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)；miR-203能抑制炎癥因子IL-8和TNFα的分泌，從而減弱缺血后的炎癥反應(yīng)，減少糖氧剝奪導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡[9]。

具有系統(tǒng)性高炎癥因子水平的卒中患者，其神經(jīng)功能恢復(fù)較差。對(duì)31例急性缺血性卒中患者的血清miRNAs分析結(jié)果顯示，卒中后miR-124和miR-9水平下降與較大的梗死體積、增加的炎癥因子水平呈負(fù)相關(guān)，這些炎癥因子包括基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和高靈敏度C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)[10]。MMP-9可致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接和基底膜破壞，BBB 通透性增加。hs-CRP則與卒中及神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度相關(guān)。

提取急性缺血性卒中患者(n=50)血樣中的外顯子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患者外顯子中miR-223的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，并與NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)。預(yù)后差的腦卒中患者外顯子miR-223水平高于預(yù)后好的患者。提示外顯子miR-223增多與急性缺血性卒中的發(fā)生、卒中的嚴(yán)重程度和短期預(yù)后有關(guān)[11]。

3.2 miRNAs對(duì)缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的影響 體外研究進(jìn)一步表明，miR-124過表達(dá)減少了實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎模型體內(nèi)TNFα等炎癥因子的水平，并抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)固有的免疫細(xì)胞，其對(duì)缺血損傷后的炎癥信號(hào)高度敏感。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，會(huì)釋放ROS、前炎癥因子、細(xì)胞因子以及蛋白水解酶以介導(dǎo)腦損傷[3]。雖然小膠質(zhì)細(xì)胞適度激活是神經(jīng)可塑性和清除壞死神經(jīng)元所必需，但其過度活化則導(dǎo)致腦缺血后的神經(jīng)毒性和腦損傷。很多miRNAs可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并對(duì)缺血后腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用。在永久性MCAO的嚙齒動(dòng)物模型中，miR-424過表達(dá)可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并減少梗死灶體積[12]。體外實(shí)驗(yàn)中，miR-424通過在翻譯水平抑制細(xì)胞周期因子(如cyclin D1、細(xì)胞分裂周期25A和細(xì)胞分裂蛋白激酶6等)來抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活[12]。糖氧剝奪誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化需要MyD88的介導(dǎo)，采用miR-203過表達(dá)來抑制MyD88，防止了糖氧剝奪后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和神經(jīng)元損傷；而腦內(nèi)給予miR-203模擬劑，能下調(diào)MCAO大鼠腦內(nèi)MyD88水平，并減輕了炎癥反應(yīng)及繼發(fā)性腦損傷[9]。

除了調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，miR-181a還參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。采用miR-181a拮抗劑治療，可減少缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Iba1的水平，并減少M(fèi)CAO后的神經(jīng)變性損傷[8]。

3.3 miRNAs對(duì)缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響 有證據(jù)表明，miR-181影響腦缺血后炎癥反應(yīng)的作用與星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。在培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外炎癥模型中，抑制miR-181導(dǎo)致前炎癥因子水平增加(如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8和高流動(dòng)性組盒-1蛋白)，而miR-181過表達(dá)則增加了抗炎因子IL-10的水平[13]。

采用骨髓相關(guān)蛋白-8(MRP8)在體外誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)miR-132、miR-146a和miR-155水平變化；同時(shí)可見TLR4和下游炎癥因子水平明顯上調(diào)。miR-132通過調(diào)控靶向IL-1受體相關(guān)激酶4(IRAK4)水平，進(jìn)而負(fù)反饋調(diào)節(jié)IL-1β和IL-6的水平，而不是傳統(tǒng)認(rèn)為的TNF-α。該結(jié)果也提示miR-132在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中內(nèi)源性配體誘導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中的重要性[14]。

3.4 miRNAs對(duì)缺血后少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響 新生少突膠質(zhì)細(xì)胞參與缺血性腦損傷的修復(fù)。采用成年MCAO模型大鼠，發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)腦室胼胝體和室下區(qū)miR-146a的密度顯著增加。在體外，神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCS)過表達(dá)miR-146a，可促進(jìn)其少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。在原代少突膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)miR-146a則增加了髓鞘蛋白的表達(dá)，而內(nèi)源性miR-146a的減少則抑制了髓鞘蛋白的生成。miR-146a也負(fù)調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞中靶基因IRAK1的表達(dá)。IRAK1的減少能顯著增加髓鞘蛋白的生成，并減少少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。提示miR-146a可能介導(dǎo)了卒中誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞的生成[15]。

在體外，miR-17-92基因簇能促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞形成、神經(jīng)發(fā)生和軸突生長。Xin等[16]采用MCAO大鼠，靜脈注射富含miR-17-92基因簇的多能間充質(zhì)干細(xì)胞外顯子，并以普通多能間充質(zhì)干細(xì)胞外顯子做對(duì)照，于28d后觀察樹突、軸突、突觸和髓鞘重塑的變化，發(fā)現(xiàn)富含miR-17-92基因簇的外顯子治療能改善神經(jīng)功能，并促進(jìn)缺血半暗帶區(qū)域的少突膠質(zhì)細(xì)胞形成、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)樹突重塑。

總之，miRNAs參與了腦缺血后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)控。由于miRNAs可以靶向細(xì)胞內(nèi)多個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的數(shù)百種蛋白質(zhì)，并對(duì)各類神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生影響，因此通過特異性藥物和非藥物治療抑制參與多種致病機(jī)制的miRNAs表達(dá)，可能有利于腦卒中后的康復(fù)。