韓松濤，趙曉群，黃艷春

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆烏魯木齊 830011)

生物參考區(qū)間通常指參考值分布的95%置信區(qū)間[1]，是解釋檢驗(yàn)結(jié)果、分析檢驗(yàn)信息的基本依據(jù)和尺度，同時可靠的參考區(qū)間對指導(dǎo)臨床患者診治提供堅實(shí)依據(jù)。國際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟推薦的參考區(qū)間(RIs)建立方法對臨床實(shí)驗(yàn)室過于復(fù)雜，錯誤使用率高[2]。國際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟和美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會在2010年共同修訂了名為《臨床實(shí)驗(yàn)室中參考區(qū)間的定義、建立和驗(yàn)證》的指南第3版(EP28-A3c)。在指南中，建立參考區(qū)間的方法得到了補(bǔ)充，使用不少于120例參考個體的非參數(shù)法，并指出參考區(qū)間的建立是繁瑣、耗時且昂貴的，因此允許臨床實(shí)驗(yàn)室使用已建立的參考區(qū)間[3]。糖鏈抗原72-4(CA72-4)指標(biāo)廣泛用于胃腸道腫瘤和卵巢癌的診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測[4-8]。新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院和新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院CA72-4目前均采用試劑說明書中推薦的6.9 U/mL作為參考區(qū)間的上限，但在體檢中發(fā)現(xiàn)有些體檢者無明顯不適癥狀，卻表現(xiàn)出CA72-4異常高于試劑說明書中的參考區(qū)間的上限，初步猜測可能跟選擇的健康人群及地域有關(guān)。因此，本研究選取一家腫瘤專科醫(yī)院和一家綜合性醫(yī)院的體檢人群，初步建立CA72-4的參考區(qū)間，并評估其研究價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 數(shù)據(jù)來自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院及新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)，調(diào)取既往體檢健康者基本信息及CA72-4的檢測值，共39 957例。本研究僅對>18歲的成年人的指標(biāo)進(jìn)行分析，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)檢測信息完整準(zhǔn)確，既往體檢健康者；(2)無胃腸、婦科疾病、藥物治療(如非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等)等基礎(chǔ)疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有慢性疾病、代謝性疾病、營養(yǎng)性疾病的患者；(2)既往有相關(guān)治療病史。納入39 889例，其中男性17 484例，女性22 405例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器和試劑 全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自瑞士Roche公司，型號Cobase601；CA72-4檢測試劑盒和校準(zhǔn)品購自瑞士Roche公司。采用經(jīng)典的Westgard多規(guī)則質(zhì)控作為室內(nèi)質(zhì)量控制(12s作為警告規(guī)則，13s、22s、R4s、41s、10x作為失控規(guī)則)，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室累積的變異系數(shù)(CV)為5%，附屬第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室累積的CV為7%。

1.3方法 使用偏度-峰度值檢驗(yàn)(Skewness-Kurtosis)對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析，當(dāng)偏度值和峰度值分別小于對應(yīng)偏度和峰度標(biāo)準(zhǔn)差的1.96倍即可判定為呈正態(tài)分布。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)通過Box-Cox變換轉(zhuǎn)變?yōu)榻普龖B(tài)分布[9]，并對變換后數(shù)據(jù)使用偏度-峰度值檢驗(yàn)分析正態(tài)性，并繪制頻數(shù)分布直方圖。離群值剔除采用四分位間距法[10]，剔除均值±1.5倍四分位間距之外的數(shù)值。運(yùn)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性分析計算該項(xiàng)目不同性別、年齡之間是否有統(tǒng)計學(xué)差異。采用非參數(shù)法進(jìn)行RIs的建立。運(yùn)用非參數(shù)統(tǒng)計法計算97.5%的值作為上限。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 運(yùn)用Office Excel 2010及SPSS19.0軟件分析，通過非參數(shù)法，并依據(jù)參考變化值(RCV)=21/2×Z×[實(shí)驗(yàn)室累積變異系數(shù)(CVA)2+生物變異度(CVI)2]1/2計算本研究所得到的結(jié)果差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，比較CA72-4檢測項(xiàng)目的上限水平，建立符合本實(shí)驗(yàn)室的CA72-4的RIs，并與當(dāng)前所運(yùn)用的RIs進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1數(shù)據(jù)分布 經(jīng)分析整理，納入39 889例，剔除離群值后，最終納入的數(shù)據(jù)為34 937例，其中男性15 544例，18～<30歲1 626例，30～<50歲7 561例，50～<70歲5 247例，≥70歲1 110例；女性19 393例，18～<30歲682例，30～<50歲8 430例，50～<70歲8 956例，≥70歲1 325例，經(jīng)Box-Cox變換后，繪制頻數(shù)分布直方圖觀察數(shù)據(jù)的分布情況，見圖1、2。

注：橫坐標(biāo)表示CA72-4測量值(U/mL)；縱坐標(biāo)表示頻率(例)。

圖139889例CA72-4檢測數(shù)據(jù)分布直方圖

注：橫坐標(biāo)為CA72-4測量值(U/mL)，縱坐標(biāo)為頻率(例)。

圖2最終納入34937例CA72-4值Box-Cox變換后分布直方圖

2.2CA72-4檢測結(jié)果和參考區(qū)間建立 運(yùn)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，得出Z=-11.425，P<0.05，不同性別間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可依據(jù)性別建立RIs。運(yùn)用Spearman相關(guān)性分析，CA72-4檢測結(jié)果與年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，不能根據(jù)年齡建立RIs。采用非參數(shù)排序法，分別對已剔除過離群值的男、女?dāng)?shù)據(jù)進(jìn)行升序排列，取97.5%的數(shù)值作為參考區(qū)間的上限。見表1。

表1 不同性別之間CA72-4測量值比較和參考區(qū)間的建立

2.3運(yùn)用RCV公式比較 CA72-4的生物變異度為16.06%[11]，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室累積的CV為5%，附屬醫(yī)院第四實(shí)驗(yàn)室累積的CV為7%，平均CV為6%。Z為95%的置信區(qū)間，在本研究中取1.96數(shù)值，經(jīng)計算RCV=21/2×1.96×[0.160 62+0.062]1/2=47.52%；比較RCVmax及RCV的大小。得出男性RCVmax=25.36，女性RCVmax=27.10，不同性別所建立的RIs差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4運(yùn)用EP28-A3c文件驗(yàn)證參考區(qū)間 運(yùn)用本研究建立的RIs發(fā)現(xiàn)，在34 937例數(shù)據(jù)中，異常例數(shù)1 367(占比3.91%)，低于廠家提供的RIs刷選出的異常例數(shù)2 060(占比5.90%)；按照EP28-A3c文件根據(jù)不同性別檢測20例健康體檢者的CA72-4，并進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)過驗(yàn)證，本研究所建立的參考區(qū)間適用于本實(shí)驗(yàn)室，見表2。

表2 CA72-4參考區(qū)間驗(yàn)證和新RIs正常者、異常者的頻數(shù)變化

3 討 論

直接法建立參考區(qū)間需要篩選健康人群納入?yún)⒖紓€體，這一過程極為昂貴和耗時，并且在當(dāng)今的臨床工作中難以實(shí)現(xiàn)，尤其是當(dāng)參考區(qū)間需要根據(jù)年齡和性別差異分別建立或者需要針對一些特殊人群進(jìn)行研究時，入組參考個體的選取會變得異常困難。因此許多實(shí)驗(yàn)室改為引用試劑廠商或者其他實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間，但是直接套用他人建立的參考區(qū)間可能會存在服務(wù)人群和檢測系統(tǒng)的差異，會對臨床工作和患者造成困擾[2]。因此，迫切需要一種快捷及簡單方便的方法建立本地區(qū)或者適合本實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間。國內(nèi)外有許多研究基于大量樣本統(tǒng)計分析計算出檢測項(xiàng)目的RIs，如Robust法、Bhattacharya法、傳統(tǒng)的非參數(shù)法等[12]。隨著實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)的發(fā)展，調(diào)取大量實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)已并非難事，也為運(yùn)用間接法建立實(shí)驗(yàn)室RIs奠定了很好的基礎(chǔ)。同時制定嚴(yán)格的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)可為數(shù)據(jù)的可靠性提供重要的保證。在本研究中，回顧性分析了近5年體檢人群的CA72-4結(jié)果，在制定納入、排除標(biāo)準(zhǔn)時，由于使用相對較長時間范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，對于分析前的因素的控制并不是很明確，從而導(dǎo)致在建立參考區(qū)間受到影響，因此在制定納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的同時，觀察體檢人群其他相應(yīng)指標(biāo)(生化、免疫、血常規(guī)等)或者是翻閱既往病例和進(jìn)行電話隨訪并制定患者調(diào)查問卷，以排除潛在對該指標(biāo)檢測有影響的人群；其次加大數(shù)據(jù)量可以優(yōu)化所建立的參考區(qū)間，并盡可能將檢測結(jié)果不確定的人群控制在5%以下，以此來控制分析前因素對該指標(biāo)的影響。

建立生物參考區(qū)間過程中，數(shù)據(jù)的剔除是關(guān)鍵步驟。本研究采用剔除四分位間距法[10]，剔除均值±1.5倍四分位距之外的數(shù)值。運(yùn)用此剔除方法要求數(shù)據(jù)呈正態(tài)或?qū)ΨQ分布，如原數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，需將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)或?qū)ΨQ分布形式。本研究數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，故選擇“Box-Cox”轉(zhuǎn)換方式對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性轉(zhuǎn)換[9]。然而在間接法建立實(shí)驗(yàn)室生物參考區(qū)間的文獻(xiàn)當(dāng)中，數(shù)據(jù)剔除法各有不同[13-14],每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在選擇數(shù)據(jù)剔除時可根據(jù)數(shù)據(jù)量和數(shù)據(jù)分布情況，選用不同剔除方法以到達(dá)剔除效果。許多離群值剔除方法都是以數(shù)據(jù)正態(tài)分布為前提[15]，所剔除的離群值均按照剔除公式嚴(yán)格計算。本研究最終納入的數(shù)據(jù)為34 937例，共剔除4 952例，剔除比例為12.4%。出現(xiàn)這種情況，這與離群值剔除既按照剔除公式計算，又循環(huán)使用本研究中的方法直到剔除所有離群值為止有關(guān)；同時亦不排除本研究中數(shù)據(jù)基數(shù)大導(dǎo)致剔除比例較高。如果離群值剔除不正確會導(dǎo)致參考區(qū)間反?？s小或者擴(kuò)大，因此只有嚴(yán)格按照剔除公式進(jìn)行反復(fù)循環(huán)剔除離群值才能保證所建參考區(qū)間的正確性。

確定參考區(qū)間的上、下限是最重要的一環(huán)。通常確定參考區(qū)間的上、下限有參數(shù)法、非參數(shù)法及羅伯斯特法等[15]。參數(shù)法是建立參考區(qū)間的最經(jīng)典的方法，但是一般要求數(shù)據(jù)必須呈正態(tài)分布。而大多數(shù)的數(shù)據(jù)并非正態(tài)分布，這也是限制了參數(shù)法在確立參考區(qū)間的應(yīng)用。羅伯斯特法是一種介于參數(shù)法與非參數(shù)法之間的方法[16]，具有類似參數(shù)估計的過程并且對樣本量沒有太高的要求，對于數(shù)據(jù)分布形態(tài)的要求不如其他的方法嚴(yán)格。正是這種特性使其在非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)中同樣表現(xiàn)出色[3]。從嚴(yán)格意義上來說，羅伯斯特法是一種小樣本估計參考區(qū)間的方法，被廣泛應(yīng)用于樣本量少于120例的情況中[15]。EP28-A3c指南明確指出非參數(shù)法是建立生物參考區(qū)間的推薦方法之一。由于參數(shù)法的計量水準(zhǔn)明顯高于非參數(shù)法，因此非參數(shù)法對樣本數(shù)量的要求相對較高。根據(jù)相關(guān)研究者建議，使用非參數(shù)法進(jìn)行參考區(qū)間研究，最小的可靠觀測量為120例。無論獲得多大量的參考值，數(shù)據(jù)仍然應(yīng)該根據(jù)非參數(shù)方法分析并根據(jù)適當(dāng)?shù)陌俜治粩?shù)報告[3]。對大部分分析物而言，應(yīng)該選取數(shù)據(jù)分布的2.5%和97.5%百分位值作為上、下參考限的取值[3]。

現(xiàn)中國大多數(shù)醫(yī)院所使用的參考區(qū)間均是依據(jù)歐美健康人群所建立的，且根據(jù)衛(wèi)健委最新頒布的有關(guān)腫瘤標(biāo)志物的參考區(qū)間行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T645.2-2018)中并沒有涉及CA72-4。本研究通過采用非參數(shù)法建立參考區(qū)間，得出CA72-4參考區(qū)間男性<8.65 U/mL，女性<8.77 U/mL，與試劑廠商所提供的參考區(qū)間有一定的差別，這種差別有可能是因?yàn)榈貐^(qū)或者人群的選擇不同，也有可能是在本研究中僅采用了非參數(shù)法這一種方法進(jìn)行參考區(qū)間的建立，不排除此種方法存在局限性。因此在建立參考區(qū)間的過程中可進(jìn)行兩種以上方法的比較，以得出更加符合本實(shí)驗(yàn)室或者本地區(qū)健康人群的參考區(qū)間。

4 結(jié) 論

本研究通過非參數(shù)法初步得到新疆地區(qū)CA72-4的參考區(qū)間，具有一定參考價值。同時隨著醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)逐步完善，使用間接法建立實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的RIs比直接法更加簡單明了，相應(yīng)技術(shù)要求較低。對于各級醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室可依據(jù)不同地區(qū)、不同人群建立符合本地區(qū)或本實(shí)驗(yàn)室的RIs，為臨床或患者提供更好參考依據(jù)。