潘小平，洪曉綠，孟 萍，裴德翠，程延東，姚明媚，王 蓉

(花都區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.感染科；3.中心實驗室；4.輸血科；5.乳腺外科，廣東廣州 510800)

在課題組以前的研究中證實：內(nèi)皮素-3基因在乳腺癌患者中表達顯著減少[1]，原因是該基因DNA啟動子發(fā)生了甲基化[2]，而DNA甲基化過程是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化完成。目前研究發(fā)現(xiàn)的DNMT家族(DNMTs)成員至少包括DNMT l、DNMT 2、DNMT 3A、DNMT 3B和DNMT 3L，本文就DNMT 2在乳腺癌患者中的表達及意義進行研究，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4-11月在本院接受手術(shù)的乳腺癌患者60例作為實驗組，年齡36～85歲，平均(54.3±12.0)歲，其中>50歲患者36例，≤50歲患者24例，另選同期體檢健康女性50例作為對照組，年齡23～74歲，平均(43.8±14.0)歲，兩組年齡間差異無統(tǒng)計學意義(t=1.542，P=0.726)。病理TNM分期按照世界衛(wèi)生組織2005乳腺癌分類標準[3]，腫瘤大?。篢1 15例，T2 17例，T3 17例，T4 11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0 19例，N1 18例，N2 15例，N3 8例；遠處轉(zhuǎn)移：無遠處轉(zhuǎn)移(M0)47例，遠處轉(zhuǎn)移(M1)13例。其他臨床病理特征，ER受體：陰性28例，陽性32例；PR受體：陰性28例，陽性32例；組織學等級：G1 10例，G2 25例，G3 25例。采集標本前均經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書，所有測試者清晨空腹采集外周血2 mL貯存于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，臨床資料完善且術(shù)前均未經(jīng)任何治療。

1.2儀器及試劑 熒光定量PCR儀、Mini型蛋白電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；DNase Ⅰ購自美國Promega公司，實時熒光定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本Takara公司。

1.3方法

1.3.1外周血單個核細胞提取 取外周血1.5 mL置于離心管中，加入等體積平衡鹽溶液，混合均勻。取1.5 mL淋巴細胞分離液置于另一離心管中，將稀釋的血液沿管壁緩慢加入離心管中，2 000 r/min離心20 min，吸取上、中層乳白色渾濁液體置于小型離心管中，2 000 r/min離心5 min去血漿，加1 mL 平衡鹽溶液，2 000 r/min離心5 min，棄上清，提純單個核細胞。

1.3.2實時熒光定量PCR 實驗組和對照組已分離提純的單個核細胞，采Trizol試劑盒分別提取其總RNA，使用DNase Ⅰ試劑提純；紫外分光光度儀測定A260/A280值；瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA條帶；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆茫籇NMT 2上游引物：5′-CCC ACT TGT AGA AGG TCC GTG-3′，下游引物：5′-TTC TCA ACC TGC ACA TCC TCT G-3′，以GAPDH作為對照，上游引物：5′-GAT TCC ACC CAT GGC AAA TT-3′，下游引物：5′-GAT TCC ACC CAT GGC AAA TT-3′，反應條件：95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40循環(huán)。設(shè)定溶解曲線程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，反應結(jié)束儀器自動生成溶解曲線圖。以倍比稀釋的cDNA作為模板，檢測循環(huán)閾值(Ct)可采用2-△△Ct法計算其相對表達量，其中△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct-△Ct對照組最大值，每個樣品重復3次，取平均Ct值。

1.3.3蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 隨機選取實驗組和對照組外周血標本各4份，1 500 r/min離心15 min，分離血漿，按照蛋白提取試劑盒說明書提取血漿總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白進行定量分析，取10～100 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠：60～100 V，30 min，分離膠：100～200 V，60 min)，切下含有目的蛋白的膠條轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(300 mA，60 min)，室溫封閉1～2 h，TBST洗膜后加DNMT 2 IgG抗體(1∶2 000)；內(nèi)參加入GAPDH抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜后，分別加入二抗(1∶4 000)室溫孵育2 h，顯色1～5 min后洗片，顯影。為驗證實驗過程的完整性以及抗體的有效性，本實驗選取兔肌肉組織，搗碎后加入裂解液，充分裂解后，12 000 r/min離心3～5 min，取上清，按照上述相同的步驟，在相同的條件下檢測DNMT 2和GAPGH。

2 結(jié) 果

2.1RNA純度及抽提質(zhì)量檢測 提純的RNAA260/A280的比值均在1.8～2.0，證明提取的RNA無污染，純度較高。3份隨機抽的樣本，凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5 s rRNA,18 s rRNA和28 s rRNA條帶清晰可見，證明總RNA抽提比較完整，見圖1。

注：1表示17號標本；2表示24號標本；3表示57號標本。

圖13份標本總RNA的5srRNA,18srRNA和28srRNA電泳圖

2.2DNMT 2 mRNA在兩組間的表達比較 實驗組DNMT 2 mRNA相對表達量(5.785±3.956)和對照組(4.739±2.359)比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.642，P=0.103)。

2.3DNMT 2蛋白在兩組間的比較 從檢測結(jié)果看，實驗過程完整，無污染，抗體有效，DNMT 2蛋白在實驗組和對照組中均無表達，見圖2。

注：A表示兔肌肉組織中DNMT 2和GAPDH蛋白的表達；B表示兩組隨機挑選的標本DNMT 2和GAPDH蛋白的表達；1～4號位置為實驗組隨機挑選標本，5～8號位置為對照組隨機挑選標本。

圖2免疫印跡試驗驗證DNMT2蛋白

3 討 論

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年遞增[4]，嚴重危害女性身心健康。乳腺癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，某些基因的DNA甲基化改變，可能是乳腺癌易感因素之一，包括NR3C1、PITX2、RB1基因等[5-8]，在本課題組以前的研究中也證實了內(nèi)皮素-3基因DNA的甲基化與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。

DNA甲基化在細胞增殖、分化、腫瘤基因及抑癌基因表達調(diào)控等方面起重要作用，與腫瘤的進展密切相關(guān)，如肺癌、腸癌、膀胱癌、乳腺癌等[9-12]。DNA甲基化過程是由DNMT催化S-腺苷蛋氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶含氮雜環(huán)5′位上的修飾反應，是負責將甲基基團添加至CpG二核苷酸的酶[13]，該酶與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[14]。

DNMT 2存在于胞質(zhì)和核內(nèi)，其結(jié)合于核基質(zhì)處，在有絲分裂前期進入細胞核內(nèi)，呈現(xiàn)類紡錘體式定位，并在細胞分裂過程中與DNA結(jié)合[15]，它在發(fā)育中的胚胎內(nèi)臟、肌肉組織、卵巢囊腫以及增殖中的睪丸細胞等組織中廣泛表達[16]。

DNMT 2在乳腺癌中的研究國內(nèi)外少見報道，而課題組研究了60例乳腺癌患者外周血中DNMT 2 mRNA的表達情況，結(jié)果表明，實驗組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(t=1.642，P=0.103)，Western blot在兩組間均未檢測到DNMT 2蛋白的表達，這些結(jié)果表明DNMT 2基因和蛋白在乳腺癌患者外周血中的的表達差異無統(tǒng)計學意義，原因可能是DNMT 2僅具有微弱的酶活性，被認為是一種RNA甲基轉(zhuǎn)移酶[17]，其功能主要與轉(zhuǎn)運RNA、非編碼RNA以及miRNA等相關(guān)[18-20]。因此，它在乳腺癌患者外周血中表達不明顯，然而它是否具有DNA甲基化功能，有待更加深入的研究。另外，DNMT 2基因和蛋白在乳腺癌組織中的表達是否有差異，亟待本課題組下一步研究。

4 結(jié) 論

DNMT 2在乳腺癌中的研究報道較少，本研究明確了DNMT 2基因和蛋白在乳腺癌患者外周血中表達不明顯，因此，DNMT 2基因和蛋白對乳腺癌的診斷、病情監(jiān)測等臨床指導意義不大。