韓劉君，孫堯，于曉龍

1華北理工大學(xué)，河北唐山 063000；2華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，河北唐山 063200

隨著老齡化人口的增加，心血管疾病逐漸成為老年人死亡的首要原因[1]。心血管疾病包括心臟疾病和血管疾病[2]。據(jù)預(yù)測(cè)，到2030年，每年約有2330萬(wàn)人死于心血管疾病，盡管心血管疾病在治療上已取得了重大進(jìn)展，但仍是全球發(fā)病率和死亡率增高的主要原因[3]。因此，制定更好的策略來(lái)防治心血管疾病非常重要，應(yīng)該被醫(yī)療從業(yè)者重視。

組織工程技術(shù)指在傳統(tǒng)醫(yī)療方法上將細(xì)胞種植到具有生物可降解性的支架材料中，從而代替細(xì)胞外基質(zhì)的作用，這種方法已被證實(shí)可以將細(xì)胞移植到各種動(dòng)物模型中用來(lái)恢復(fù)或增強(qiáng)原有組織的功 能[4]。組織工程技術(shù)需要3個(gè)主要組成部分：細(xì)胞資源、基質(zhì)(支架)及應(yīng)用線索(生化或生物物理線索)[5]。組織工程學(xué)在心血管疾病治療中多應(yīng)用于心肌、心臟瓣膜及血管中，本文將從組織工程的不同組成部分及來(lái)源分別介紹組織工程技術(shù)在心血管疾病中的應(yīng)用。

1 細(xì)胞資源(種子細(xì)胞)

理想的種子細(xì)胞是組織工程構(gòu)建成功的關(guān)鍵。目前，細(xì)胞主要來(lái)源于自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞及異種細(xì)胞，而每種細(xì)胞又可以被細(xì)分為其他類型的干細(xì)胞[6]。干細(xì)胞是未完全分化的未成熟細(xì)胞，有自我更新和多向分化的特點(diǎn)，作為組織工程中的種子細(xì)胞，已被廣泛應(yīng)用于組織和器官的再生研究 中[7]。根據(jù)細(xì)胞的發(fā)育潛力，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)及成體干細(xì)胞3類[8]。

1.1ESCs ESCs來(lái)源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)[9]，是一種多潛能干細(xì)胞，可被分化為任何類型的細(xì)胞，已成為組織工程種子細(xì)胞的可靠來(lái)源[10]。Prabhakaran等[11]通過(guò)從小鼠的囊胚中分離多能胚胎干細(xì)胞，將其種植到納米支架材料上并定向分化為心肌細(xì)胞，結(jié)果可觀察到誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表達(dá)心肌細(xì)胞表型，由此證明ESCs具有分化為心肌細(xì)胞的能力，可作為組織工程心肌的種子細(xì)胞。Pucéat等[12]從人類胚胎干細(xì)胞(HUESC)中獲得了一個(gè)Mesp1+細(xì)胞群體，利用細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的某些特定因子，可獲得瓣膜心內(nèi)膜細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)早期瓣膜的形成。ESCs雖然在組織工程心肌和組織工程心臟瓣膜研究領(lǐng)域取得了一定成果，但在作為組織工程血管的種子細(xì)胞研究尚少，考慮可能有以下兩個(gè)因素[13]：①ESCs分化不完全，在移植后可能會(huì)有腫瘤的發(fā)生；②ESCs涉及人類胚胎倫理學(xué)問(wèn)題。因此，在廣泛應(yīng)用于臨床治療心血管疾病之前，必須努力尋找最有前途的細(xì)胞類型或其衍生物。

1.2iPSCs iPSCs具有無(wú)限的自我更新和分化為特殊類型細(xì)胞的能力，已經(jīng)被應(yīng)用到許多醫(yī)療領(lǐng)域 中[14]。Sugiura等[15]將多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞(iPS-CMs)接種至可生物降解的心臟貼片上，并植入大鼠心肌梗死模型體內(nèi)，16周后，觀察到iPSCMs可促進(jìn)宿主心肌細(xì)胞的再生及增殖。已有研究表明，細(xì)胞療法可治療受損的心肌細(xì)胞[16]，但在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，有研究者進(jìn)行了成體干細(xì)胞的移植研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植后的成體干細(xì)胞既不能長(zhǎng)期存活，也不能在宿主組織中分化為心肌細(xì)胞，而iPSCs因具有無(wú)限的自我更新能力和明確的心肌生成潛力而成為很有前途的細(xì)胞來(lái)源[17]。近年來(lái)，從iPSCs中獲得各種用途的心肌細(xì)胞雖然取得了顯著進(jìn)展，但仍面臨著一些重大挑戰(zhàn)，如現(xiàn)有方法培養(yǎng)的iPSCs來(lái)源的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出高度未解決的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，缺乏成人細(xì)胞樣表型所需的成熟細(xì)胞[18]。另外，iPSCs也可在組織工程心臟瓣膜領(lǐng)域發(fā)揮作用，患者來(lái)源的iPSCs可被誘導(dǎo)為瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(VICs)，具有維持瓣膜的ECM功能，進(jìn)而發(fā)揮iPSCs在構(gòu)建組織工程心臟瓣膜中的作用[19]。雖然已有研究指出iPSCs可以作為組織工程心臟瓣膜的種子細(xì)胞[20]，但應(yīng)用到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究卻極少。

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，組織工程血管已經(jīng)可以從原代細(xì)胞中培養(yǎng)出來(lái)，但因原代細(xì)胞的可擴(kuò)充性和供體-受體之間的變異限制了其發(fā)展。目前，有研究證實(shí)從iPSCs中獲得血管組織工程的種子細(xì)胞可以解決上述問(wèn)題[21]，雖然iPSCs的組織工程血管技術(shù)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但將組織工程血管應(yīng)用到臨床上仍面臨著許多困難，比如，血管移植物與血管組織之間是否會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)、移植后結(jié)構(gòu)是否完整及移植后在體內(nèi)的存活率等，這些都將限制iPSCs作為種子細(xì)胞在組織工程技術(shù)上的應(yīng)用。

1.3成體干細(xì)胞 是一種非造血多能基質(zhì)細(xì)胞，在特定生長(zhǎng)因子的調(diào)控下，有向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞分化的潛 能[22]。神經(jīng)干細(xì)胞[23]、造血干細(xì)胞[24]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)[25]、表皮干細(xì)胞[26]等均屬于成體干細(xì)胞。其中BMSCs已被用于組織工程的心肌[27]、心臟瓣膜[28]及血管[29]研究中。Li等[30]采用含有誘導(dǎo)劑5-氮胞苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs，15 d后經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法可檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)心肌表面標(biāo)志物α-肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白T，采用透射電鏡可觀察到BMSCs的胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)肌管樣結(jié)構(gòu)。Huang等[31]通過(guò)使用成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)因子14(Fn14)基因轉(zhuǎn)染BMSCs可成功獲得瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，表明BMSCs可為心臟瓣膜疾病提供一種新的治療策略。此外，已有研究證明，BMSCs在制備自體組織工程血管移植物及用于急診血管手術(shù)的現(xiàn)成組織工程血管移植物方面具有較好的優(yōu)勢(shì)[32]。

綜上所述，干細(xì)胞因具有多向分化的潛能，在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，其中，BMSCs在動(dòng)物及臨床研究中已經(jīng)取得了一些成果，與ESCs及iPSCs相比，BMSCs具有較少的倫理學(xué)問(wèn)題、較低的免疫原性及較少發(fā)生腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)[33]。因此，在組織工程治療心血管疾病方面，BMSCs可作為最佳的種子細(xì)胞。

2 基質(zhì)(支架材料)

生物材料已作為3D載體被廣泛使用，協(xié)助細(xì)胞移植到動(dòng)物或人體內(nèi)以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)揮作用，生物材料的引入使移植后細(xì)胞的存活率得到了很大的提高[34]。目前，生物材料可被細(xì)分為生物活性陶瓷材料、高分子生物材料及復(fù)合材料3種類型[35]。生物材料可與生物系統(tǒng)相互作用，在體內(nèi)具有治療、增強(qiáng)、替代任何組織或器官的作用，成功的生物支架材料應(yīng)具有生物相容性，并保持其機(jī)械性能，直到被天然組織取代，在替代的過(guò)程中解體成小碎片，最終被身體吸收或被排出體外[36]。

2.1生物活性陶瓷 生物活性陶瓷可以是天然的或是合成的，包括珊瑚、生物活性玻璃、硅酸鈣、羥基磷灰石(HA)及磷酸三鈣(TCP)等生物材料[35]。因其固有的生物相容性[37]，各種生物陶瓷材料在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用日益突出，含有磷酸鈣的生物玻璃或陶瓷材料被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)組織工程中，如骨科植入物、骨缺損修復(fù)、金屬植入物涂層、牙科及耳廓植入物等醫(yī)療領(lǐng)域[38]。盡管生物活性陶瓷具有優(yōu)異的生物活性，但其主要缺點(diǎn)在于機(jī)械強(qiáng)度及斷裂韌性較低，因此，在心血管疾病中的應(yīng)用極少。

2.2高分子生物材料 高分子生物材料包括天然聚合物[如殼聚糖(CTS)、膠原(COL)、纖維蛋白及透明質(zhì)酸]和合成聚合物[如聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乙酸醇(PGA)及聚乙烯磷酸(PVPA)][39]。高分子生物材料因其獨(dú)特的性能已經(jīng)被應(yīng)用到不同的研究領(lǐng)域，人們開(kāi)始通過(guò)優(yōu)化其生物化學(xué)性能及機(jī)械性能，以新型的材料制造技術(shù)開(kāi)發(fā)各種材料體系的新產(chǎn)品，進(jìn)而使天然高分子材料在許多醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)得到高效的應(yīng)用[40]。Hussain等[41]利用靜電紡絲技術(shù)制備具有生物活性的三維殼聚糖納米纖維支架，并將大鼠心肌細(xì)胞種植到該支架材料上，結(jié)果表明，殼聚糖納米纖維支架材料在長(zhǎng)期的培養(yǎng)條件下仍可保持其柱狀形態(tài)，同時(shí)表現(xiàn)出良好的細(xì)胞黏附及鋪展特性，而共培養(yǎng)的細(xì)胞形成了極化的心肌細(xì)胞形態(tài)，并保留了長(zhǎng)期培養(yǎng)的形態(tài)及功能，提示殼聚糖納米纖維支架材料可以作為一種潛在的支架材料被應(yīng)用到組織工程心肌的研究中。Puperi等[42]采用透明質(zhì)酸水凝膠作為支架材料，將瓣膜細(xì)胞以3D形式包裹在支架材料中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸水凝膠在3D環(huán)境培養(yǎng)條件下保持了瓣膜細(xì)胞的表型，并被調(diào)整到接近瓣膜海綿層的機(jī)械性能，由此證明，透明質(zhì)酸可作為層狀組織工程心臟瓣膜支架海綿層的合適材料。此外，快速內(nèi)皮化及預(yù)防再狹窄是制備小直徑血管移植物面臨的兩大挑戰(zhàn)，而植入后的感染往往被忽視，因此，選擇合適的生物支架材料對(duì)組織工程血管尤其重要。Wang等[43]采用殼聚糖生物支架材料制備不對(duì)稱的小直徑血管移植物，結(jié)果表明殼聚糖的加入可使移植物的外層具有一定的抗菌效果，移植物的內(nèi)層可極大地促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，由此證明殼聚糖的特殊優(yōu)勢(shì)將有助于組織工程血管移植物的臨床應(yīng)用。

因此可得出，合成的高分子天然生物材料大多數(shù)與其他天然聚合物或生物活性陶瓷材料一起作為復(fù)合材料被應(yīng)用到組織工程技術(shù)中，以促使高分子生物材料達(dá)到最大的應(yīng)用價(jià)值。

2.3復(fù)合材料 復(fù)合材料是含有兩種或兩種以上不同性能的材料以共聚物、聚合物-聚合物混合物或聚合物-陶瓷復(fù)合材料的形式組合而成，如聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、硅酸鈣(CS)與殼聚糖混合物等復(fù)合材料[44]。Wang等[45]將CS引入殼聚糖靜電紡絲納米纖維支架材料中，構(gòu)建復(fù)合的心臟貼片支架材料，結(jié)果表明復(fù)合的心臟貼片支架材料對(duì)心肌細(xì)胞的生物活性具有協(xié)同作用，體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)，種植了心肌細(xì)胞的心臟貼片支架材料可以減少心肌梗死的瘢痕面積并促進(jìn)血管生成，由此證明硅酸鈣/殼聚糖復(fù)合心臟貼片支架材料有望成為修復(fù)心肌梗死的支架材料。Hasan等[46]采用聚己內(nèi)酯(PCL)和聚L-乳酸(PLLA)材料構(gòu)建一種三葉式心臟瓣膜結(jié)構(gòu)，將該細(xì)胞種植到該支架材料上，觀察到細(xì)胞可在PCL-PLLA支架材料上生長(zhǎng)并增殖，證實(shí)了將硬質(zhì)聚乳酸與更具柔順性及細(xì)胞黏附性的聚乳酸相結(jié)合，可以得到一種強(qiáng)度、柔韌性和生物學(xué)性能都較良好的支架材料，在組織工程心臟瓣膜疾病的應(yīng)用中具有巨大的潛力。天然血管具有多層次、細(xì)胞特異性的空間結(jié)構(gòu)，模擬這種空間結(jié)構(gòu)是一條很有前途的血管再生途徑。Li等[47]采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)及明膠的混合物制備了一種新型的雙向雙層管狀支架，將具有血管再生功能的內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞接種至支架上，可觀察到支架對(duì)兩種細(xì)胞的增殖均具有促進(jìn)作用，證實(shí)雙向雙層支架是天然血管的優(yōu)良結(jié)構(gòu)及功能類似物，是一種潛在的血管組織工程候選材料。

最近，生物材料已經(jīng)作為3D載體被廣泛使用[48]。 已有研究表明，將聚乙二醇(PEG)、丙烯酸酯及均質(zhì)化心包基質(zhì)(HPM)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出了一種可三維打印并可降解的支架，具有重建先天性心臟缺損的潛力[49]。另外也有研究表明，采用海藻酸鈉包裹人臍靜脈平滑肌細(xì)胞通過(guò)同軸噴嘴沉積系統(tǒng)以血管導(dǎo)管的形式進(jìn)行三維打印，可構(gòu)建組織工程血管[50]。生物支架材料的開(kāi)發(fā)具有一定的挑戰(zhàn)性，主要是因?yàn)樯锊牧系谋砻娣浅Ｖ匾?，它需要具有良好的黏附性以增?qiáng)細(xì)胞的附著及生長(zhǎng)能力。在心臟組織工程的醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，合成聚合物已經(jīng)被證明具有良好的生物降解性及力學(xué)性能，但其細(xì)胞附著能力很差，因此，研究人員重點(diǎn)關(guān)注了生物材料的生物功能化以增強(qiáng)細(xì)胞的黏附力，并加大細(xì)胞與材料之間的相互作用[51]。

3 應(yīng)用線索(生化或生物物理線索)

生物材料的生化或生物物理線索可以引發(fā)細(xì)胞發(fā)生一系列生理反應(yīng)，進(jìn)而刺激受損組織的愈合，生物物理線索可以直接將離子、納米材料或蛋白質(zhì)內(nèi)化到胞質(zhì)中，而生化線索通過(guò)引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因組的變化決定細(xì)胞的最終轉(zhuǎn)向[52]。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在體外將細(xì)胞種植于生物支架材料上，細(xì)胞能夠在生物支架材料上生長(zhǎng)及增殖，將生物支架材料移植入體內(nèi)后，細(xì)胞可以在體內(nèi)發(fā)生作用。Blondiaux等[53]將BMSCs種植到組織工程纖維蛋白貼片上，并將纖維蛋白貼片移植到裸鼠心肌梗死模型體內(nèi)，可觀察到移植后裸鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)較前有所改善，梗死面積及梗死區(qū)域周圍的纖維化程度均有所減少，結(jié)果表明，BMSCs構(gòu)建的組織工程纖維蛋白貼片能有效改善梗死后心臟的心功能。Jana等[54]將豬瓣膜間質(zhì)細(xì)胞種植到聚己內(nèi)酯微纖維支架內(nèi)，并將微纖維支架植入到大鼠模型皮下2個(gè)月，結(jié)果表明，聚己內(nèi)酯支架材料可促進(jìn)細(xì)胞在支架上的黏附及增殖，進(jìn)而證明了瓣膜間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建的組織工程心臟瓣膜可以改善心臟瓣膜的功能。Jang等[55]采用聚己內(nèi)酯、海藻酸鈉及具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化能力的自體間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)3D打印技術(shù)制備人工血管，并移植入犬類動(dòng)物模型中，結(jié)果表明，移植后的人工血管可以抵抗炎癥，不會(huì)發(fā)生因移植導(dǎo)致的急性血栓形成。

組織工程技術(shù)在心肌、心臟瓣膜及血管在體內(nèi)的研究雖已經(jīng)取得了一定成果，但組織工程技術(shù)取得成功的關(guān)鍵在于移植的有效率，就現(xiàn)有研究而言，移植的細(xì)胞密度、移植到體內(nèi)存活的概率及移植物在體內(nèi)的反應(yīng)機(jī)制等問(wèn)題仍阻礙了組織工程技術(shù)在心血管疾病中的發(fā)展。

4 問(wèn)題與展望

種子細(xì)胞的選擇、支架材料的選取及體內(nèi)移植的成功與否均為組織工程技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用到心血管疾病中面臨的挑戰(zhàn)。盡管組織工程技術(shù)在動(dòng)物研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了一些成果，但真正應(yīng)用到臨床仍面臨著很大的困難，主要是：①如何在體外獲得足夠數(shù)量的種子細(xì)胞，并判斷種子細(xì)胞的最佳移植數(shù)量及比例；②組織工程組織構(gòu)建物的大小問(wèn)題；③體外構(gòu)建的組織工程組織在移植后細(xì)胞的存活率問(wèn)題。作為一項(xiàng)革命性的全新技術(shù)，組織工程技術(shù)在心血管疾病中的研究和臨床試驗(yàn)不會(huì)一帆風(fēng)順，但從國(guó)內(nèi)外研究已取得的成果中可得出，使用組織工程技術(shù)治療心血管疾病的前景可期。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，人類醫(yī)學(xué)的發(fā)展也將進(jìn)入全新的階段，過(guò)去無(wú)計(jì)可施的疾病有望得到治療的機(jī)會(huì)，過(guò)去亟需提高療效的疾病在臨床上的治療局面終將開(kāi)啟一個(gè)新的篇章。