高明月，楊雅坤，殷雅楠，崔清卓，張秀，趙京山*

1錦州醫(yī)科大學(xué)遼寧省人類表型組重點實驗室，遼寧錦州 121001；2河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，石家莊 050200

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損害因素所致的，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)[1]。肝脂肪變性被視為NAFLD的良性開始，該階段沒有明顯的肝損傷，但部分肝脂肪變性患者會發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)及其相關(guān)的肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[2-3]。目前，研究人員致力于驗證引起肝臟“雙重打擊”的假設(shè)[4]：導(dǎo)致NAFLD形成的“第一擊”是指脂肪細(xì)胞中游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)的水平升高，肝臟中FFAs氧化水平降低，進(jìn)而引起肝細(xì)胞中脂肪過度積累；“第二擊”是指NAFLD患者中炎性細(xì)胞因子水平和氧化應(yīng)激參數(shù)升高，從而對肝臟造成持續(xù)損傷。但大量研究表明，腸道菌群失調(diào)在人類肝病發(fā)病中起著重要作用，尤其是NAFLD及其相關(guān)的代謝紊亂[5]。人體腸道上皮的吸收面積達(dá)300～400 m2，定植約1014種細(xì)菌[6-7]，其多為共生微生物，依賴于飲食中的營養(yǎng)物質(zhì)，同時處理難消化的物質(zhì)，產(chǎn)生必需的代謝物，形成適應(yīng)性免疫，以抵抗病原微生物的定植和入侵[8-9]，但這種相互影響的關(guān)系可能會因疾病表型而被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)[10]。因此，腸道菌群失調(diào)被認(rèn)為是NAFLD發(fā)病的關(guān)鍵因素，亦是NAFLD潛在的臨床治療靶點。

1 腸道菌群失調(diào)與NAFLD的關(guān)系

腸道內(nèi)存在大量的微生物群，正常情況下各菌群比例和數(shù)量相對穩(wěn)定，但宿主內(nèi)外環(huán)境改變，包括飲食、酒精攝入、抗生素的使用和遺傳因素等，可能導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[11-12]。NAFLD的主要危險因素(如飲食、肥胖和胰島素抵抗)與腸道菌群密切相關(guān)，提示腸道菌群與NAFLD的病理生理機制密切相關(guān)。Le Roy等[13]將高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的腸道菌群移植入無菌小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)無菌小鼠發(fā)生NAFLD，表明腸道菌群在NAFLD發(fā)病中起著重要作用。Loomba等[14]分析86例經(jīng)活檢證實為NAFLD的患者[n=72，0-2期肝纖維化；n=14，3-4期(“晚期”)肝纖維化]的糞便微生物群發(fā)現(xiàn)，晚期肝纖維化患者的變形桿菌水平較高，而0-2期肝纖維化患者的厚壁菌門水平較高；晚期肝纖維化患者的37個(共40個)預(yù)測指標(biāo)與腸道菌群相關(guān)。

盡管有研究支持NAFLD與腸道菌群失調(diào)的相關(guān)性，但最近的系統(tǒng)綜述指出該結(jié)果具有一定局限性，如缺乏可重復(fù)性、未能闡明腸道菌群失調(diào)影響NAFLD的機制以及二者間的因果關(guān)系等。此外，多數(shù)研究的微生物組是從糞便中取樣，但糞便的細(xì)菌組成與腸道菌群并不完全相同[15]。

2 NAFLD的微生物調(diào)節(jié)機制

2.1腸-肝軸 肝臟和腸道皆起源于腹前腸內(nèi)胚層，兩者在解剖學(xué)和生物學(xué)功能方面存在內(nèi)在聯(lián)系[16-17]。 肝臟和腸道通過門靜脈相連，肝臟70%～75%的血液供應(yīng)通過起源于腸道毛細(xì)血管的門靜脈，與此同時，腸道中產(chǎn)生的一系列細(xì)菌、細(xì)菌代謝物和環(huán)境毒素可能通過門靜脈到達(dá)肝臟[18]，致使肝臟成為腸道細(xì)菌及其衍生物最容易接觸的器官之一。

腸道菌群與肝臟的共生關(guān)系是由一個相互作用的網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控的，該網(wǎng)絡(luò)包括代謝、免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌之間的相互作用。腸上皮的緊密連接是細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物的天然屏障[19]。來自病原微生物或食物的抗原通過腸上皮的緊密連接被樹突狀細(xì)胞識別，或者通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)來激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，而與病原體相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖和鞭毛蛋白等通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和Nod樣受體(Nod-like receptors，NLRs)激活核因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)入門脈循環(huán)；除了肝細(xì)胞損傷外，PAMPs還可激活參與纖維化進(jìn)展的星狀細(xì)胞，而Kupffer細(xì)胞對LPS的反應(yīng)比星狀細(xì)胞更強烈[20]。 腸-肝軸參與肝病的發(fā)病機制已成為當(dāng)前臨床研究的熱點。

2.2微生物群對腸道屏障功能的影響 腸道上皮形成的緊密封閉的物理屏障主要由腸黏膜層和腸上皮細(xì)胞構(gòu)成，上皮細(xì)胞間的連接復(fù)合體包括緊密連接、貼壁連接、橋粒連接和縫隙連接[21-22]。在生理條件下，緊密連接蛋白(如血帶閉塞蛋白)在根尖處封閉相鄰的上皮細(xì)胞，阻止細(xì)菌穿過腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)[23]，部分研究將緊密連接視為腸通透性最重要的生理和病理調(diào)節(jié)因素之一[24]，但這種調(diào)節(jié)因素會隨著緊密連接被破壞和細(xì)胞旁非自身抗原向固有層過度滲漏而變?yōu)椴B(tài)。Li等[25]發(fā)現(xiàn)，腸黏膜炎癥反應(yīng)增強，腸上皮屏障被破壞，導(dǎo)致微生物產(chǎn)物易位，從而誘發(fā)NAFLD；Rahman等[26]發(fā)現(xiàn)，在缺氧和炎癥刺激的病理條件下，緊密連接蛋白可產(chǎn)生收縮現(xiàn)象并向細(xì)胞質(zhì)移動；而Hundertmark等[27]在2年后的研究中證實了細(xì)胞孔隙明顯擴張，腸黏膜通透性增加，導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位及其代謝物L(fēng)PS通過門靜脈系統(tǒng)進(jìn)入血液和肝臟，刺激肝臟釋放炎性因子，如腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-6。

2.3微生物群對肝脂肪變性的影響 Martinez-Castillo等[28]認(rèn)為脂肪吸收受腸道微生物群(包括十二指腸微生物群)的影響，且脂肪吸收是肝脂肪變性的一個因素，一些效應(yīng)分子與脂肪吸收等效應(yīng)有關(guān)。

2.3.1腸道菌群-膽汁酸軸 原發(fā)性膽汁酸(bile acids，BAs)由肝臟合成并分泌至膽囊，進(jìn)食后被釋放至十二指腸，在腸道中被腸道細(xì)菌代謝為次生膽汁酸，然后被重新吸收入門靜脈，大部分分子被肝臟捕獲再循環(huán)，但有一部分仍留在血液中，充當(dāng)信號分子。某些膽汁酸合成酶的表達(dá)受腸道菌群的調(diào)控，即膽汁酸的合成受腸道菌群的調(diào) 控[29]，因此，膽汁酸在NAFLD的發(fā)展中具有重要作用。Venetsanaki等[29]發(fā)現(xiàn)，NASH患者的糞便總膽汁酸、膽酸、鵝去氧膽酸和膽汁酸的合成濃度高于健康對照組。

膽汁酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)取決于被激活的受體，膽汁酸與其受體的親和性各不相同，因此膽汁酸成分變化直接影響膽汁酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[30]。NAFLD最重要的膽汁酸受體為法氏X核受體(farnesoid X nuclear receptor，F(xiàn)XR；主要被初級膽汁酸激活)和跨膜G蛋白偶聯(lián)受體5(transmembrane G-protein coupled receptor 5，TGR5；主要被次級膽汁酸激活)[31]。FXR是核受體超家族成員之一，在膽汁酸的肝臟吸收轉(zhuǎn)運、新生肝脂肪生成、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)轉(zhuǎn)運和三酰甘油(triglyceride，TG)代謝等過程中起關(guān)鍵作用。Watanabe等[32]發(fā)現(xiàn)FXR缺陷小鼠的肝臟TG和膽固醇含量升高。Takahashi等[30]研究NAFLD高脂飲食小鼠模型發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控腸道菌群使腸道細(xì)菌與FXR發(fā)生拮抗作用，會導(dǎo)致肝脂肪生成減少。FXR通過降低糖異生調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達(dá)，降低腸道中胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的表達(dá)，以及增加肝糖原合成等調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[33]。

總之，腸道菌群可能通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝引發(fā)NAFLD。FXR在NAFLD的發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用，其可能成為治療膽汁淤積、NAFLD引起的肝臟膽汁酸異常，以及脂質(zhì)代謝疾病的靶點[34]。

2.3.2腸道菌群與短鏈脂肪酸 短鏈脂肪酸(shortchain fatty acid，SCFAs)是一種揮發(fā)性脂肪酸(如乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯)，主要由腸道微生物發(fā)酵可溶性膳食纖維和不易消化的碳水化合物產(chǎn)生[35]。 SCFAs在機體代謝中發(fā)揮多種作用，如調(diào)節(jié)食欲、促進(jìn)能量消耗、刺激胰島素敏感性以及激活肝臟和骨骼肌中腺苷單磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)等，從而影響NAFLD的發(fā)展。SCFAs影響肝臟脂肪和脂肪組織積累的機制之一為通過G蛋白耦聯(lián)受體43(G-protein-coupled receptors 43，GPR43)調(diào)節(jié)胰島素敏感性，脂肪組織中GRP43被SCFAs激活，促進(jìn)能量消耗，抑制脂肪組織和肝臟脂肪堆積，同時，腸道對SCFAs的識別可引起胰島素增敏肽酪氨酸(peptides peptide tyrosine tyrosine，PYY)和GLP-1的釋放，抑制胃腸蠕動，延長胃腸轉(zhuǎn)運時間[36]。通過上述途徑，腸道菌群及其代謝產(chǎn)生的SCFAs促進(jìn)NAFLD的發(fā)生發(fā)展。

有研究探討了SCFAs在腸道中的生理作用，但其在肝病中的作用尚未明確。Cortez-Pinto等[36]發(fā)現(xiàn)，NASH與低纖維飲食有關(guān)；Rocha等[37]發(fā)現(xiàn)，高纖維飲食的NAFLD患者血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和膽固醇水平有一定改善。此外，Schwiertz等[38]發(fā)現(xiàn)，超重和肥胖者糞便中丙酸鹽含量更高，表明丙酸鹽可能生產(chǎn)過?；蛭毡恢袛唷CFAs對肝脂肪變性的作用機制尚不明確，仍需深入研究。

3 腸道菌群參與NAFLD的發(fā)病機制

有研究表明，腸道菌群參與了NAFLD的發(fā)病，例如，Kaden-Volynets等[39]研究高熱量飲食的無菌小鼠模型發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)飼養(yǎng)的小鼠相比，高熱量飲食喂養(yǎng)的無菌小鼠體重增加和脂質(zhì)代謝受損，但肝臟無脂肪變性。此外，Martinez-Guryn等[40]發(fā)現(xiàn)，給無菌小鼠定植高脂飲食誘導(dǎo)的空腸菌群，即使食用低脂食物，其脂質(zhì)吸收也增加，提示腸道菌群在觸發(fā)代謝反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。此外，部分臨床試驗也在積極探索NAFLD與腸道菌群失調(diào)的因果關(guān)系，如Boursier等[41]比較了NASH患者與健康對照組的糞便菌群，發(fā)現(xiàn)兩組糞便中的擬桿菌和普氏桿菌數(shù)量差異明顯；類桿菌、NASH和瘤胃球菌與肝纖維化獨立相關(guān)。由此可見，NAFLD的嚴(yán)重程度與腸道菌群的失調(diào)和代謝功能的改變密切相關(guān)，而目前的“多重打擊”假說認(rèn)為，多重打擊共同作用于具有遺傳易感性的受試者，從而誘發(fā)NAFLD。Ji等[42]分析腸道微生物源成分及其代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)腸道微生物群在導(dǎo)致NAFLD發(fā)展的多重平行打擊中發(fā)揮了重要的相互作用。Casta?o-Rodríguez等[43]的研究表明，人類NAFLD與腸道通透性增加和小腸細(xì)菌生長有關(guān)，而后者可能是由腸內(nèi)細(xì)胞間緊密連接破壞引起的。

綜上所述，臨床前的證據(jù)支持腸道菌群在NAFLD進(jìn)展中的因果作用，但二者的因果機制尚未建立，因此，需要設(shè)計良好的、縱向的、前瞻性的隊列研究，使用多組學(xué)分析技術(shù)，并輔以動物模型來解釋復(fù)雜(和可能的多因子)的微生物群落與NAFLD宿主之間的相互作用[44]。

4 腸道菌群是NAFLD潛在的治療靶點

微生物靶向治療包括使用抗生素、益生菌(培養(yǎng)對人體健康有益的活微生物)、益生元(可發(fā)酵的膳食纖維，刺激益生菌的生長和生存)、合生菌(益生菌和益生菌的組合)和糞便移植等[45]。

4.1益生菌、益生元及合生菌 研究動物模型表明，益生菌、益生元和合生菌對腸道菌群具有明顯的調(diào)節(jié)作用，通過改善脂肪代謝異常和腸道菌群失調(diào)，有助于NAFLD的治療[46]。補充益生菌可調(diào)節(jié)炎性因子水平[47]，改善NAFLD的內(nèi)臟脂肪、總膽固醇、胰島素抵抗等代謝參數(shù)[48]；益生元主要是通過發(fā)酵成SCFAs來促進(jìn)腸道細(xì)菌的生長[49]，相關(guān)的臨床前研究表明其改善了NAFLD的生化和組織學(xué)各項指標(biāo)水平[50]；合生菌是益生菌和益生元的結(jié)合體，是NAFLD治療研究的一個新興領(lǐng)域。Raso等[50]通過動物實驗表明，大鼠經(jīng)合生菌處理后，肝臟炎癥和胰島素抵抗均得到明顯改善。

近年來，關(guān)于益生菌、益生元及合生菌的人體試驗研究持續(xù)增多，初步證實了其在多種臨床疾病中發(fā)揮著重要作用[51]。Ahn等[52]以合生菌(包括鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、戊酸乳桿菌、帕拉卡塞乳桿菌、布雷夫和雙歧乳桿菌)作為對照藥進(jìn)行了為期12周的隨機雙盲試驗，結(jié)果顯示，治療期間，肥胖患者的BMI和內(nèi)臟脂肪面積明顯減少，TG水平、肝內(nèi)脂肪含量降低。特別的是，Parnell等[53]發(fā)現(xiàn)，超重和肥胖的成人在補充3個月的低果糖后，體重明顯下降。Kellow等[54]對26項隨機對照研究進(jìn)行系統(tǒng)回顧發(fā)現(xiàn)，益生元可增強健康和肥胖個體的飽腹感、刺激胰島素釋放并維持餐后葡萄糖穩(wěn)態(tài)。最近，Bomhof等[55]給予NASH患者低果糖作為對照藥，進(jìn)行了24周的隨機雙盲臨床試驗，首次發(fā)現(xiàn)益生元可對微生物組成進(jìn)行組織學(xué)改良和修飾。Brett Bonnie等[56]的Meta分析發(fā)現(xiàn)，通過微生物治療，肝臟酶、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、BMI、血清膽固醇和TG水平明顯降低，未引發(fā)炎癥反應(yīng)。按治療類別進(jìn)行亞組分析發(fā)現(xiàn)，益生菌和益生元對BMI和肝臟酶的影響相同，但對總膽固醇、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)和LDL的影響不同。總之，益生菌、益生元及合生菌在NAFLD治療中發(fā)揮著重要作用，對NAFLD的長期調(diào)控具有重要意義。

4.2抗生素 抗生素對NAFLD的作用機制是多因素的，可能包括腸道菌群組成、細(xì)菌毒性和(或)細(xì)菌代謝功能的改變，盡管每種抗生素的具體作用途徑不同，但在小鼠模型中，服用抗生素雞尾酒 (桿菌肽、新霉素和鏈霉素)后觀察到NAFLD得到改善[50]。

在臨床試驗方面，Gangarapu等[57]研究了利福西敏短期(28 d)療程對肝損傷免疫激活和內(nèi)毒素血癥標(biāo)志物的影響，表明利福西敏與NASH患者的BMI輕度下降以及血清ALT、AST、丙種谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、LPS和鐵蛋白水平明顯下降有關(guān)。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在利福西敏治療后，NAFLD患者的轉(zhuǎn)氨酶水平和NAFLD肝脂肪評分明顯降低[58]。而Ponziani等[59]發(fā)現(xiàn)，利福西敏對NASH的治療效果甚微。這種差異可能是藥物劑量低、治療時間短和樣本量小引起的。特定的抗生素可以促進(jìn)益生菌(如雙歧桿菌和乳酸菌)的生長，從而對腸道菌群產(chǎn)生積極的影響。雖然短期抗生素治療可能效果顯著，但長期使用可能引發(fā)細(xì)菌耐藥性，從而限制了藥物療效，增加了繼發(fā)感染的風(fēng)險[60]。因此，不鼓勵長期使用抗生素。

4.3糞便微生物移植(fecal microbial transplantation，F(xiàn)MT) FMT是將健康供體的腸道微生物群通過消化道途徑移植入患者體內(nèi)，以恢復(fù)患者腸道微生物的多樣性[61]。FMT在我國有1500多年的歷史[62]，其中4例與1958年糞灌腸治療假性膜性結(jié)腸炎有關(guān)[63]， 目前這種方法已被證實有效。根據(jù)2013年的指南，F(xiàn)MT被確認(rèn)為一種治療艱難梭菌反復(fù)感染的臨床技術(shù)[64]，療效已達(dá)90%[65]。到目前為止，在臨床實踐或已發(fā)表的研究中，尚未有證據(jù)表明FMT會在NAFLD、NASH和肝硬化病例的治療中增加不良事件[66]。但是，這些初步結(jié)果需要包括不同病因和復(fù)雜肝硬化階段在內(nèi)的更大規(guī)模的臨床試驗來驗證。Nistal等[67]將較瘦捐贈者的腸道細(xì)菌移植到NASH患者體內(nèi)，6周后，患者胰島素敏感性明顯升高，產(chǎn)生丁酸鹽的腸道微生物群水平升高。FMT可能為肝病患者提供更多治療模式，但仍需深入研究進(jìn)行驗證。此外，關(guān)于FMT對人類健康產(chǎn)生有益影響的證據(jù)不足，更多臨床試驗正在研究FMT對NAFLD和NASH并發(fā)癥的影響。總之，F(xiàn)MT被認(rèn)為是NAFLD患者的一種治療工具，許多研究結(jié)果揭示了FMT的潛在作用及其減輕NAFLD及NASH的可行性。

5 總結(jié)與展望

腸道菌群與肝病關(guān)系密切，在NAFLD、纖維化進(jìn)展、肝硬化、肝癌等慢性肝病的發(fā)病中起重要作用。膽堿缺乏、SCFAs和BAs代謝等炎癥通路與NAFLD和NASH有關(guān)。腸道微生物群與NAFLD發(fā)展相關(guān)的機制可能為進(jìn)一步研究和治療NAFLD提供潛在靶點，如以膽堿代謝和炎癥為靶點的通路，但由于轉(zhuǎn)基因的復(fù)雜性，確定腸道菌群在NAFLD發(fā)生中的具體作用具有挑戰(zhàn)性。以往研究多采用16S rRNA測序，分辨率較低，僅局限于種屬水平，因此利用高度精確的宏基因組測序在菌株水平上識別NAFLD相關(guān)微生物勢在必行，同時宏基因組研究不能僅局限于物種和基因豐度的分析，還應(yīng)該關(guān)注基因內(nèi)容的變化，如單堿基突變、插入刪除以及結(jié)構(gòu)變化等。目前已有研究者提出對宏基因組進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的研究，筆者認(rèn)為，如能在大規(guī)模樣本下比較分析NAFLD患者與健康人群腸道微生物組基因組水平的變化，尋找NAFLD相關(guān)微生物組單核苷酸多態(tài)性模式，將對揭示微生物組與肝硬化的關(guān)系提供全新的視角，為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的依據(jù)。微生物組學(xué)研究為NAFLD的研究及臨床治療提供了新思路，未來轉(zhuǎn)基因技術(shù)有望成為治療腸道功能失調(diào)相關(guān)疾病的一項新技術(shù)。