聶 瑋，李 娟，曹曉煉，代天聰，郭瀟瀟，劉玉申，王 娟，李卓林

(吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室，吉林 長春 130021)

柯薩奇病毒A組16型(Coxsackie virus A16, CA16)是引發(fā)手足口病的主要病原體之一[1]。近年來，手足口病在我國暴發(fā)流行呈上升的趨勢[2]，因此高效、準(zhǔn)確、特異性地檢測CA16是控制和預(yù)防手足口病流行的關(guān)鍵。目前，對(duì)CA16的檢測方法主要包括傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定法、免疫學(xué)檢測法和分子生物學(xué)檢測法等[3-5]。但上述檢測方法已經(jīng)無法滿足疾病流行期間大樣本量的實(shí)時(shí)同步診斷的要求，因此開發(fā)高效準(zhǔn)確的檢測新技術(shù)是做好傳染病預(yù)防控制的關(guān)鍵。

熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)技術(shù)是指當(dāng)供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，且兩分子的距離在10 nm范圍內(nèi)時(shí)發(fā)生的一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[6-7]。該技術(shù)可極大降低背景光，同時(shí)具有分辨率高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)復(fù)雜生物體系樣本熒光檢測技術(shù)的不足，目前利用該技術(shù)構(gòu)建生物探針是分析檢測領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8]。FRET技術(shù)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在免疫分析方面，該技術(shù)作為一種簡單的均相分析方法，不僅適用于小分子，還適用于大分子[9]。在免疫分析中，抗體的純度和特異性在很大程度上影響了FRET的效率，常用的抗體有單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體由于其成本昂貴并不適用于現(xiàn)場檢測中，因此，以雞卵黃抗體(immunoglobulin yolk, IgY)為代表的多克隆抗體在檢測領(lǐng)域中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。IgY是指存在于經(jīng)抗原免疫后的產(chǎn)蛋母雞卵黃中的免疫球蛋白[11]，是雞血中的IgG經(jīng)受體介導(dǎo)選擇性地以垂直傳播的方式轉(zhuǎn)移到雞卵黃中并產(chǎn)生大量的高特異性的抗體[12-13]。根據(jù)需要的不同，采用不同的抗原進(jìn)行免疫，即可產(chǎn)生針對(duì)該抗原的特異性抗體[14]。

本研究基于FRET技術(shù)構(gòu)建新型納米“熒光開關(guān)”，根據(jù)本課題組前期研究[15]結(jié)果，首次建立了CA16型手足口病病原體的熒光淬滅-恢復(fù)檢測體系，借助熒光分光光度計(jì)對(duì)CA16進(jìn)行定性和定量檢測，并對(duì)檢測體系的靈敏度、特異度和臨床檢測效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期達(dá)到CA16快速檢測的目的，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)手足口病的快速高效檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株和細(xì)胞 CA16、腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)、人橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)為吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 雌性健康無特定病原(SPF)雞購自山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和聚乙二醇PEG-6000購自美國 Sigma 公司，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海康為世紀(jì)試劑有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞 IgY購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，CdSe/ZnS量子點(diǎn)購自星紫(上海)新材料技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 病毒培養(yǎng) 取-80℃保存的CA16病毒接種于RD細(xì)胞，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24 h后，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變時(shí)即可收獲病毒。反復(fù)凍融3次，4℃、3 000 r·min-1離心30 min，收集上清病毒液，采用空斑法測定病毒滴度，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)調(diào)節(jié)病毒液滴度為2×106PFU·mL-1。

1.4 CA16雞卵黃抗體(CA16-IgY)的純化和鑒定 將CA16-IgY經(jīng)蛋白純化儀純化，并對(duì)純化后的CA16-IgY進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，BCA法測定蛋白水平，間接ELISA法測定抗體效價(jià)和特異性。分別用EV17、CA16和牛血清蛋白(BAS)測定抗體的交叉反應(yīng)，以空白孔的吸光度[A(450)]值為對(duì)照，以P/N≥2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 金納米粒子(AuNPs)及其生物探針(IgY-AuNPs)的制備和表征 采用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑均勻，物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分散性好的AuNPs[16]。具體步驟如下：取 50 mL 氯金酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.01%)用恒溫磁力加熱攪拌器加熱到沸騰，迅速加入2 mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，含0.05% 檸檬酸)，繼續(xù)加熱待反應(yīng)液變?yōu)榫萍t色，停止加熱，繼續(xù)攪拌 5 min 后撤去熱源，冷卻至室溫，4℃ 避光保存。根據(jù)文獻(xiàn)[17]，將50 μg CA16-IgY通過靜電自組裝偶聯(lián)至500 μL AuNPs表面，并通過紫外可見光譜(UV-Vis)、紅外光譜(FTIR)和透射電子顯微鏡(TEM)等方法對(duì)所制備的AuNPs和IgY-AuNPs的尺寸、形貌和性能進(jìn)行表征。

1.6 CA16檢測方法的建立及評(píng)價(jià) 以本課題組前期研究建立的EV71檢測方法為基礎(chǔ)[15]，基于FRET原理，建立一種CA16型手足口病病原體快速檢測的新方法，首先，制備CA16雞卵黃抗體金納米生物探針(CA16-IgY-AuNPs)，以AuNPs和量子點(diǎn)為基體，構(gòu)建納米“熒光開關(guān)”體系，以IgY-AuNPs調(diào)控“開關(guān)”，即在待檢狀態(tài)下，IgY-AuNPs與量子點(diǎn)相結(jié)合(dD-A < 10 nm)，電荷從量子點(diǎn)轉(zhuǎn)移到AuNPs表面，熒光發(fā)生淬滅，形成熒光“turn-off”淬滅平衡體系；當(dāng)待檢樣本中存在病毒顆粒時(shí)，病毒顆粒競爭性結(jié)合免疫化的IgY-AuNPs，熒光淬滅平衡體系被破壞，使熒光量子點(diǎn)得以游離，熒光迅速恢復(fù)，形成熒光“turn-on”恢復(fù)體系，為使檢測體系檢測效果達(dá)到最佳，需對(duì)AuNPs-IgY濃度、NaCl用量和熒光恢復(fù)時(shí)間指標(biāo)進(jìn)行條件優(yōu)化[18]。同時(shí)，選擇16例感染CA16和其他腸道病毒的手足口病患者的糞便樣本分別采用本研究建立的CA16檢測方法和qRT-PCR法進(jìn)行檢測，對(duì)2種檢測方法的靈敏度和特異度進(jìn)行評(píng)價(jià)，靈敏度=[a/(a+c)]×100%,特異度=[d/(b+d)]×100%。

2 結(jié) 果

2.1 CA16-IgY鑒定結(jié)果 純化后CA16-IgY呈現(xiàn)2條清晰明顯的目的條帶，重鏈相對(duì)分子質(zhì)量約為75 000，輕鏈相對(duì)分子質(zhì)量約為25 000(圖1)。采用BCA法檢測CA16-IgY的蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.535 8x+0.121 3，R2=0.994 6。根據(jù)所得到的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白水平(圖2A)，免疫期間蛋白水平平均為12.15 mg·L-1。隨著免疫次數(shù)的增加，CA16-IgY效價(jià)逐漸增高，在第3次免疫后的第10天抗體效價(jià)為1∶128 000，達(dá)到最高值，該效價(jià)持續(xù)近10 d(圖2B)。CA16-IgY特異性測定結(jié)果見表1，空白孔A(450)值為0.046，以P/N≥2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，CA16檢測結(jié)果為陽性，EV71和BSA檢測結(jié)果均為陰性，無交叉反應(yīng)。見表1。

M: Protein marker; Lane 1: Purified IgY; Lane 2: Unpurified IgY.
圖1 純化后CA16-IgY的SDS-PAGE凝膠電泳純度鑒定電泳圖
Fig.1 Electrophoregram of SDS-PAGE identification of purity of purified CA16-IgY

2.2 AuNPs和CA16-IgY-AuNPs表征結(jié)果 紫外可見光譜表征結(jié)果：AuNPs在520 nm波長處出現(xiàn)特征吸收峰，峰型對(duì)稱；當(dāng)IgY偶聯(lián)至AuNPs表面形成CA16-IgY-AuNPs時(shí)，可誘導(dǎo)吸收峰紅移6 nm，且吸收峰值降低(圖3 A)。紅外光譜表征結(jié)果：AuNPs的特征峰出現(xiàn)在3 400 cm-1(-OH)。CA16-IgY-AuNPs的特征峰出現(xiàn)在3 400 cm-1(-OH)、2 850 cm-1(-CH2)、1 730 cm-1(-C=O)、1 550 cm-1(-NH)和1 220 cm-1(C-O)(圖3 B)。AuNPs TEM觀察結(jié)果(圖3 C)：AuNPs顆粒形狀以球形為主，粒徑均一，呈高度分散狀態(tài)，平均直徑為20 nm。CA16-IgY-AuNPs TEM觀察結(jié)果：CA16-IgY標(biāo)記的AuNPs顆粒仍呈高分散狀態(tài)，標(biāo)記后的AuNPs顆粒表面出現(xiàn)一圈均勻的CA16-IgY-AuNPs共軛體外層(圖3 D)。

圖2 CA16-IgY免疫應(yīng)答期間抗體蛋白水平(A)和抗體效價(jià)(B)
Fig.2 Protein levels(A)and titers of CA16-IgY during immune response

表1 CA16-IgY特異性檢測結(jié)果Tab.1 Specificity test results of CA16-IgY

2.3 CA16熒光淬滅-恢復(fù)檢測體系實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 IgY-AuNPs濃度優(yōu)化結(jié)果：隨著IgY-AuNPs濃度增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)IgY-AuNPs濃度為0.52×10-3g·L-1時(shí)，檢測體系熒光強(qiáng)度達(dá)到平臺(tái)期，因此確定IgY-AuNPs的最佳濃度為0.52×10-3g·L-1(圖4A)。在熒光檢測體系中NaCl作為一種穩(wěn)定劑對(duì)量子點(diǎn)有一定的淬滅作用，并且起到穩(wěn)定金納米生物探針的作用，因此本實(shí)驗(yàn)需對(duì)NaCl用量進(jìn)行優(yōu)化[18]。NaCl用量優(yōu)化結(jié)果：隨著NaCl用量的增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)NaCl的用量為40 μL時(shí)，檢測體系熒光強(qiáng)度達(dá)到最小值，因此NaCl的最佳用量為40 μL(圖4B)。熒光恢復(fù)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果：當(dāng)熒光淬滅體系中加入CA16后，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸升高，在 90 min時(shí)熒光值達(dá)到最大，因此確定本實(shí)驗(yàn)的最佳熒光恢復(fù)時(shí)間為90 min(圖4C)。

2.4 CA16熒光淬滅-恢復(fù)檢測體系檢出限測定結(jié)果 用所建立的檢測方法檢測不同濃度的CA16病毒液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。隨著CA16濃度的增加，熒光值逐漸恢復(fù)(圖5A)，當(dāng)CA16病毒滴度為1×104～ 2×106PFU·mL-1時(shí)，反應(yīng)物在525 nm處熒光值與病毒滴度呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為I525 nm= 15.452 IgC-9.746，R2=0.993 2，檢測限為1×104PFU·mL-1(圖5B)。

圖3 AuNPs和CA16-IgY-AuNPs的UV-Vis圖(A)、FTIR圖(B)及AuNPs(C)和CA16-IgY-AuNPs(D)TEM圖(Bar=10 nm)
Fig.3 UV-Vis spectra (A) and FT-IR spectra(B) of AuNPs and CA16-IgY-AuNPs and TEM images of AuNPs(C)and CA16-IgY-AuNPs(D)(Bar=10 nm)

A: Optimization of IgY-AuNPs concentration; B: Optimization of NaCl dosage; C:Time optimization of fluorescence recovery.圖4 檢測體系實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Experimental condition optimization results of detection system

A: Fluorescence spectra of different concentrations of CA16; B: Calibration curve for CA16 virus.
圖5 檢測體系檢出限測定結(jié)果
Fig.5 Detection result of limit of detection system

2.5 CA16熒光淬滅-恢復(fù)檢測體系特異性評(píng)價(jià)結(jié)果 向檢測體系加入腸道病毒(EV71)、蛋白干擾物(BSA)和CA16，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，檢測反應(yīng)物熒光值以驗(yàn)證方法的特異度。以P/N≥2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，空白對(duì)照組熒光值為19.93±1.06，CA16組熒光值為54.46±3.79，故檢測結(jié)果判定為陽性；EV71組熒光值為27.63±1.46，BSA組熒光值為24.71±1.81，結(jié)果均判定為陰性。結(jié)果提示本研究建立的檢測方法特異性良好，可用于CA16的定性和定量檢測。

2.6 臨床樣本檢測結(jié)果 為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立的方法在臨床樣本檢測中的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，按照已建立的檢測方法構(gòu)建CA16病原體檢測試劑盒，使用該檢測試劑盒檢測16例感染CA16和其他腸道病毒的手足口病患者的糞便樣本(表2)，檢測結(jié)果與臨床標(biāo)準(zhǔn)檢測方法qRT-PCR對(duì)比分析，經(jīng)計(jì)算可得本方法的靈敏度為83.3%，特異度為100%，且檢測方法與qRT-PCR法的一致率為93.75%(表3)，說明本實(shí)驗(yàn)建立的檢測方法可以應(yīng)用于手足口病臨床樣本的檢測。

3 討 論

近年來，CA16型病原體手足口病的流行暴發(fā)引起了人們的廣泛關(guān)注，由于針對(duì)CA16型病毒的疫苗尚未被研發(fā)應(yīng)用，并且臨床尚未開發(fā)出針對(duì)手足口病的特效藥物[19]，因此加強(qiáng)對(duì)CA16型病毒的高效、靈敏且特異的檢測，對(duì)于控制其流行暴發(fā)，保護(hù)人群健康具有重要意義。由于傳統(tǒng)的檢測方法存在各種缺點(diǎn)，無法滿足當(dāng)今手足口病快速檢測要求，因此開發(fā)一種高效準(zhǔn)確的新檢測方法是控制疾病流行的關(guān)鍵。

本研究對(duì)本課題組前期研究通過聚乙二醇沉淀

表2 16例不同類型腸道病毒感染的手足口病患者糞便樣本檢測結(jié)果Tab.2 Detection results of stool samples from 16 hand, foot and mouth disease patients with different enterovirus-infection

Note: Blank=22.28, 2.1×blank=46.7; “P” meaned positive test result; “N” meaned negative test result; “F” represented value of fluorescence intensity.

表3 FRET與qRT-PCR法檢測16例不同類型腸道病毒感染的手足口病患者糞便樣本的一致性Tab.3 Consistency of FRET method and qRT-PCR method in detection of stool samples from 16 hand, foot and mouth disease patients with different enterovirus infection

法[20]制備的CA16-IgY進(jìn)行鑒定，并且通過靜電自組裝將IgY偶聯(lián)至AuNPs表面制備可以特異性識(shí)別CA16的IgY-AuNPs，基于FRET技術(shù)，建立一種CA16型手足口病病原體快速檢測新方法，結(jié)果顯示：CA16-IgY純度及特異度較好，效價(jià)高達(dá)1∶128 000，平均蛋白水平為12.15 mg·L-1，為下一步制備的可以特異性識(shí)別CA16的IgY-AuNPs提供了物質(zhì)保障。通過UV-Vis、FTIR和TEM等方法對(duì)所制備的AuNPs及其生物探針的尺寸、形貌和性能進(jìn)行表征，結(jié)果顯示： IgY可以通過靜電自組裝偶聯(lián)至AuNPs表面形成IgY-AuNPs；檢測體系實(shí)驗(yàn)條件經(jīng)優(yōu)化，確定最佳IgY-AuNP濃度為0.52×10-3g·L-1，最佳NaCl用量為40 μL，熒光最佳恢復(fù)時(shí)間為90 min，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，測定本方法的線性檢測范圍為1×104～ 2×106PFU·mL-1；根據(jù)檢測體系熒光值與病毒濃度呈線性關(guān)系，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線為I525 nm=15.452 IgC-9.746，R2=0.993 2，判定檢出限為1×104PFU·mL-1，且檢測方法特異性良好，與EV71病毒無交叉反應(yīng)；同時(shí)，該方法以試劑盒的形式對(duì)手足口病臨床糞便樣本檢測，檢測結(jié)果與臨床標(biāo)準(zhǔn)檢測方法qRT-PCR法對(duì)比分析，經(jīng)計(jì)算可得本方法的靈敏度為83.3%，特異度為100%，且檢測方法與qRT-PCR法的一致率為93.75%，表明本研究建立的檢測方法可應(yīng)用于臨床樣本的檢測，為手足口病檢測乃至其他病原體的檢測奠定基礎(chǔ)。