宋續(xù)軍，張 倩，王少磊，柏 娜，劉 杰

(1. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科，山東 青島 266003;2. 青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266003)

種植體周圍炎是與種植體功能喪失相關(guān)的不可逆炎癥反應(yīng)，其特征是軟組織感染和周圍骨質(zhì)流失，最終導(dǎo)致種植體的脫落[1]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制和發(fā)展的重要工具。目前已經(jīng)通過(guò)飼喂含菌飼料法[2]、脂多糖注射法[3]和結(jié)扎法[4]建立了實(shí)驗(yàn)性種植體周圍炎模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[5-6]結(jié)果表明：種植體周圍炎與牙周炎相似，其發(fā)生與菌斑定植有關(guān)聯(lián)。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是牙周病發(fā)展過(guò)程中起破壞組織作用的主要炎癥因子，其可促進(jìn)炎癥細(xì)胞進(jìn)入感染部位。研究[7]表明：種植體周圍炎齦溝液中炎癥因子TNF-α水平較健康種植體組和對(duì)照組齦溝液中TNF-α水平升高，表明TNF-α可通過(guò)協(xié)同作用調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，破壞骨組織，發(fā)生骨吸收。目前針對(duì)種植體周圍炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究主要集中于犬和小型豬等大型哺乳動(dòng)物[8-9]，但其費(fèi)用、畜牧條件以及抗體試劑、遺傳篩檢限制等因素均限制了研究的進(jìn)行[10-11]。本研究擬應(yīng)用即刻種植及結(jié)扎誘導(dǎo)法建立實(shí)驗(yàn)性種植體周圍炎小鼠模型，探討TNF-α在實(shí)驗(yàn)性種植體周圍炎模型小鼠牙齦組織中的表達(dá)，闡明其在種植體周圍炎中的致病作用，以期為種植體周圍炎動(dòng)物模型的建立提供新思路，并為該類疾病治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 4周齡雄性C57BL/6J小鼠18只，體質(zhì)量16～19 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)20190003。在實(shí)驗(yàn)期間小鼠定時(shí)喂軟質(zhì)飲食。Trizol試劑(美國(guó)Ambion公司)，50×ROX Reference Dye 2和 SYBR Green Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，dNTP(天根生化科技有限公司)，Ribonuclease Inhibitor(北京全式金生物)。螺旋型種植體和定制式驅(qū)動(dòng)器(山東威高集團(tuán)有限公司)，顯微組織鑷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，5-0絲線(美國(guó)Johnson & Johnson公司)，微計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)系統(tǒng)(瑞士SCANCO Medical公司)，手術(shù)放大鏡(德國(guó)HEINE公司)，組織勻漿器(美國(guó)Omni International公司)。

1.2 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)前將18只小鼠隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組和模型組，每組6只，均飼養(yǎng)在青島大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心的SPF級(jí)單元中，動(dòng)物管理符合動(dòng)物保護(hù)條例。3組小鼠在手術(shù)之前，腹膜內(nèi)注射氯胺酮(100 mg·kg-1)和賽拉嗪(5 mg·kg-1)對(duì)小鼠進(jìn)行全身麻醉。所有手術(shù)均使用手術(shù)放大鏡在標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌條件下進(jìn)行。使用顯微組織鑷按照既定方案拔除右側(cè)上頜第一磨牙，為了防止愈合過(guò)程中的牙合創(chuàng)傷，將右側(cè)下頜對(duì)應(yīng)第一磨牙同期拔除，然后采用定制式驅(qū)動(dòng)器將定制的純鈦螺旋型種植體(圖1)即刻植入拔牙后留下的遠(yuǎn)中腭根窩洞中。術(shù)后用軟質(zhì)飲食和無(wú)菌水喂養(yǎng)小鼠4周，使種植體植入后進(jìn)行骨結(jié)合。植入種植體后4周，即刻處死空白組小鼠(即結(jié)扎處理前)；對(duì)照組小鼠不做結(jié)扎處理，飼喂2周后處死；模型組小鼠采用結(jié)扎誘導(dǎo)法建立實(shí)驗(yàn)性種植體周圍炎模型，將5-0絲線牢固地環(huán)種植體的齦下頸部纏繞2圈，腭側(cè)打結(jié)，飼喂2周后處死。

圖1 定制式種植體示意圖Fig.1 Schematic diagram of a custom implant

1.3 標(biāo)本處理 上述3組小鼠分別處死，獲取上頜骨，去除皮膚和肌肉，并在手術(shù)放大鏡下切取種植體腭側(cè)的牙齦組織， -80℃條件下儲(chǔ)存，用于基因表達(dá)分析；將剩余頜骨組織儲(chǔ)存于75%酒精中，以備Micro-CT掃描使用。

1.4 牙齦組織形態(tài)學(xué)觀察 使用手術(shù)放大鏡在肉眼情況下觀察種植體周圍牙齦組織的顏色、形態(tài)、質(zhì)地和滲出情況，評(píng)估牙齦炎癥表現(xiàn)。

1.5 采用Micro-CT掃描法測(cè)量種植體周圍骨高度和骨密度 采用Micro-CT掃描系統(tǒng)掃描小鼠上頜骨。將樣品在旋轉(zhuǎn)臺(tái)上暴露于X射線下，在70 kVp、200 mA電流和10 μm各向同性體素分辨率的操作電壓下進(jìn)行測(cè)量，曝光時(shí)間為300 ms，并且每個(gè)視圖平均5幀。使用Mimics Research 20.0軟件進(jìn)行種植體周圍骨質(zhì)的定量三維測(cè)量和影像的收集，種植體周圍骨高度(Bone height)是通過(guò)測(cè)量種植體尖端和附著在種植體近端、遠(yuǎn)端、頰側(cè)、腭側(cè)的邊緣骨的最大冠狀位置之間的距離來(lái)確定的，單位為 μm。在每個(gè)樣本的種植體周圍選擇相同的感興趣體積(volume of interest,VOI)，其被定義為種植體周圍直徑為1.0 mm、高度為1.7 mm的圓柱體，使用Scanco micro-CTμ100 Evaluation Program v6.6軟件分析VOI內(nèi)骨密度，單位為mgHA/ccm。

A：Blank group； B：Control group； C：Model group.
圖2 各組小鼠種植體周圍牙齦組織大體形態(tài)表現(xiàn)
Fig.2 Gross morphology of gingival tissue around implants of mice in various groups

1.6 RT-PCR法檢測(cè)牙齦組織中TNF-αmRNA表達(dá)水平 將上述收集的腭側(cè)牙齦使用組織勻漿器在裂解緩沖液中勻漿，采用Trizol試劑提取總RNA，SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒合成cDNA。采用RT-PCR法測(cè)定種植體周圍牙齦組織中TNF-αmRNA表達(dá)水平。引物如下：TNF-α，forward 5′-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3′,reverse 5′-CTGATGAGAGGGAGGCCATT-3′， GAPDH，forward 5′-ATGGGTGTGAACCACG-

AGA-3′，reverse 5′-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′。GAPDH為內(nèi)參照基因。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TNF-α mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠種植體周圍牙齦組織的大體形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 在種植體植入愈合完全后、施用結(jié)扎之前，空白組小鼠種植體周圍牙齦未見(jiàn)明顯的炎癥征象；未結(jié)扎的對(duì)照組小鼠種植體周圍牙齦無(wú)肉眼可見(jiàn)的炎癥征象；結(jié)扎2周后，模型組小鼠種植體周圍牙齦組織可見(jiàn)明顯的發(fā)紅、水腫、質(zhì)地變軟和滲出。見(jiàn)圖2(插頁(yè)三)。通過(guò)顯微組織鑷手動(dòng)檢查時(shí)，各組種植體仍然保持不動(dòng)。

2.2 各組小鼠種植體周圍骨高度和骨密度 各組小鼠種植體周圍骨高度的三維和二維影像變化見(jiàn)圖3。模型組小鼠種植體周圍可看到明顯的牙槽骨丟失，而空白組和對(duì)照組小鼠種植體周圍牙槽骨無(wú)明顯變化。各組小鼠種植體周圍骨高度值見(jiàn)表1。與空白組比較，對(duì)照組小鼠種植體的近端、遠(yuǎn)端、頰側(cè)和腭側(cè)骨高度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，模型組小鼠種植體的近端、遠(yuǎn)端、頰側(cè)和腭側(cè)骨高度明顯降低(P<0.01)。與空白組[(993.50±10.02)mg HA/ccm]比較，對(duì)照組小鼠種植體周圍牙槽骨骨密度[(1 034.00±44.05 mg HA/ccm] 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，模型組小鼠種植體周圍牙槽骨骨密度[(964.60±6.59)mg HA/ccm]明顯降低(P<0.05)。

A：Blank group； B：Control group； C：Model group.圖3 各組小鼠種植體周圍頜骨的Micro-CT掃描結(jié)果Fig.3 Micro-CT scan results of upper jaw bone around implants of mice in various groups

2.3 各組小鼠牙齦組織中TNF-α mRNA表達(dá)水平 與空白組(1.060±0.090)比較，對(duì)照組小鼠牙齦組織中TNF-α mRNA表達(dá)水平(1.291±0.080)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，模型組小鼠牙齦組織中TNF-α mRNA表達(dá)水平(3.013±0.580)明顯升高(P<0.01)。

3 討 論

牙種植體的植入是目前牙齒缺失患者極為重要的修復(fù)方法之一。而種植體周圍炎會(huì)導(dǎo)致種植體周圍骨質(zhì)的丟失甚至種植手術(shù)的失敗。先前已在犬[12]、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物[13]和小型豬[14]中成功誘導(dǎo)了種植體周圍炎。與較大的動(dòng)物不同，以小鼠作為動(dòng)物模型成本更低，并且可以提供易于操作的多種可修飾基因缺陷，使得小鼠成為了理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，可以借此進(jìn)一步深入探討種植體周圍炎發(fā)病機(jī)制中的細(xì)胞和炎癥因子變化。

本研究采用的即刻種植的手術(shù)方法是基于目前臨床上的主流趨勢(shì)而選擇的。近年來(lái)不翻瓣即刻種植在臨床上廣泛開(kāi)展，其具有療程短、愈合快、保留軟組織能力佳和成功率高的特點(diǎn)[15]。研究[16]表明：

表1 各組小鼠種植體周圍骨高度Tab.1 Bone heights around implants of mice in various groups

*P<0.01 compared with control group.

延期種植和即刻種植對(duì)種植體周圍軟組織無(wú)明顯影響，即刻種植在永久修復(fù)3個(gè)月時(shí)的紅色美學(xué)效果要優(yōu)于延期種植。本研究采用的拔牙后即刻種植的方法無(wú)需翻瓣，手術(shù)使用定制的驅(qū)動(dòng)器植入，該方法簡(jiǎn)單微創(chuàng)，具有侵入性小和最小化出血的特點(diǎn)，最大程度地降低了因?yàn)槭中g(shù)操作過(guò)久或創(chuàng)傷過(guò)大導(dǎo)致的動(dòng)物死亡問(wèn)題，與以前的方法[2-3]相比更加具備科學(xué)性和適用性，值得推廣使用。

在本研究中，模型組小鼠牙齦組織有肉眼可見(jiàn)的炎癥征象，為排除這種炎癥僅是種植體周圍黏膜炎的可能，采用Micro-CT掃描種植體周圍的牙槽骨并分析骨高度，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組小鼠有明顯的種植體周圍骨質(zhì)破壞，與人類種植體周圍炎的定義基本相符，即病變已突破黏膜屏障累及骨組織造成骨缺損。本研究通過(guò)對(duì)比空白組和對(duì)照組小鼠的檢測(cè)結(jié)果，可以觀察到時(shí)間因素并未對(duì)種植體周圍炎起到誘導(dǎo)作用，但也可能是因?yàn)闀r(shí)間較短，若種植體長(zhǎng)期暴露于小鼠口腔內(nèi)未得到良好的清潔，也可能會(huì)導(dǎo)致菌斑相關(guān)性炎癥和種植體周圍軟硬組織的破壞。因此，本研究的結(jié)扎干預(yù)可以在短期內(nèi)誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，從而成功建立實(shí)驗(yàn)性種植體周圍炎小鼠模型。

研究[17]表明：TNF-α水平升高可能與種植體周圍炎有關(guān)。TNF-α可通過(guò)激活細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞黏附分子和轉(zhuǎn)錄因子參與炎癥過(guò)程[18]。研究[19]顯示：在慢性炎性骨疾病如牙周炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，TNF-α能夠直接誘導(dǎo)骨丟失，增加破骨細(xì)胞活性。本研究中，與對(duì)照組比較，模型組小鼠牙齦組織中TNF-α mRNA高表達(dá)，表明TNF-α也是重要的炎癥介體，促進(jìn)了種植體周圍炎的進(jìn)展，介導(dǎo)與種植體周圍炎相關(guān)的骨質(zhì)破壞。研究[20-21]表明：TNF-α可以通過(guò)上調(diào)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生并增加破骨細(xì)胞前體對(duì)RANKL的反應(yīng)性，間接增強(qiáng)破骨細(xì)胞的形成。因此，基于以上結(jié)果，TNF-α mRNA在模型小鼠牙齦組織中高表達(dá)可能對(duì)種植體周圍炎的發(fā)病具有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果為今后的種植體周圍炎治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究成功建立了實(shí)驗(yàn)性種植體周圍炎小鼠模型，并驗(yàn)證了TNF-α在實(shí)驗(yàn)性種植體周圍炎模型小鼠牙齦組織中高表達(dá)。未來(lái)針對(duì)TNF-α的研究有望深入揭示種植體周圍炎的發(fā)病機(jī)制，為尋找其潛在的治療方法探索新的方向。