周嘉怡，吳遜偉，戴莉娟，趙瑰麗，余波瀾

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省母胎醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510150)

1969年，孕婦血漿中發(fā)現(xiàn)了胎兒細(xì)胞[1]；1997年，通過PCR擴(kuò)增攜帶男性胎兒的孕婦血漿和血清中Y染色體特異性序列，證實(shí)了母體血液中存在著胎兒游離的DNA(cell free fetal nucleic acid，cff-DNA)[2]。自此無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)(non-invasive prenatal test，NIPT)伴隨著胎兒特意標(biāo)志物不斷的發(fā)展，在許多研究下，無論體外或者體內(nèi)證據(jù)都證明，cff-DNA來源于胎盤，并且可以通過cff-DNA檢測(cè)胎盤的健康與相關(guān)的妊娠疾病，例如妊娠期高血壓疾病、子癇前期、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等。而妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是孕產(chǎn)婦發(fā)病率和病死率的主要原因，并且使6%～8%的妊娠期復(fù)雜化[3]。據(jù)報(bào)道， 全世界16%的孕產(chǎn)婦死亡是由高血壓引起

的;妊娠期高血壓疾病的危險(xiǎn)因素有年齡、多次妊娠、慢性高血壓(chronic hypertension，cHTN)、其他外周血管以及妊娠期高血壓病史等，但具體的發(fā)病機(jī)制仍不能確定[4]。根據(jù)國(guó)際妊娠高血壓研究學(xué)會(huì)(international society for the study of hypertension in pregnancy，ISSHP)妊娠期高血壓(gestational hypertension，GH)定義為妊娠20周后新發(fā)高血壓[血壓140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上]，尿中無蛋白。子癇前期(preelcampsia，PE)定義為新發(fā)高血壓，其特征是妊娠20周后24 h尿樣尿液中蛋白含量為300 mg以上，血壓為140/90 mmHg以上。PE基于嚴(yán)重程度可分為兩類，第一是輕度到中度(mild preeclampsia，MPE)定義的血壓140/90 mmHg和159/109 mmHg， 24 h尿樣尿液中蛋白含量大于300 mg但不超過2.0 g。第二類為重度子癇前期(sever preeclampsia，SPE)，定義為收縮壓大于160 mmHg或舒張壓大于110 mmHg，24 h尿樣尿液中蛋白含量大于2.0 g[5]。

1 胎兒游離DNA在PE中的變化

PE的發(fā)病機(jī)制較為清楚，確切病因仍難以捉摸的。其中普遍認(rèn)為PE的發(fā)病機(jī)制包括子宮胎盤灌注下降，導(dǎo)致缺氧胎盤[6]，同時(shí)循環(huán)促炎因子和血管生成因子的改變，以及系統(tǒng)性內(nèi)皮功能障礙[7]。嬰兒分娩和胎盤排出后導(dǎo)致子癇前期的癥狀消失[8]，這現(xiàn)象表明了在PE的發(fā)病機(jī)制中胎盤的作用。目前的理論主要支持孕婦血漿中cff-DNA的來源是胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡與壞死所釋放出來的胎兒DNA。并且在PE患者血液中觀察到cff-DNA和總循環(huán)游離DNA(circulating free DNA，cf DNA)的增加可能與胎盤螺旋動(dòng)脈異常重構(gòu)、氧化應(yīng)激增加和缺血有關(guān)，導(dǎo)致胎盤源性顆粒或因子的釋放[9]。缺血性胎盤的概念導(dǎo)致細(xì)胞碎片的釋放，這一概念被進(jìn)一步細(xì)化，包括微泡和納米泡、胎兒DNA以及最近的外泌體等顆粒，這些從胎盤釋放的細(xì)胞碎片充當(dāng)著危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(danger associated molecular patterns,DAMP)，最近的實(shí)驗(yàn)研究證明，在小鼠體內(nèi)，細(xì)胞外囊泡可引起小鼠胎盤無菌炎性反應(yīng)和PE的類似癥狀[10]。并且Toll樣受體9(TLR9)最初被稱為外源DNA片段的傳感器，在小鼠妊娠模型中，胎兒提取的DNA和TLR9激動(dòng)劑會(huì)使懷孕小鼠誘發(fā)炎性反應(yīng)，主要是通過增加炎性細(xì)胞因子IL-6、sENG和sFlt1分泌，引起妊娠小鼠出現(xiàn)PE樣特征，如高血壓、蛋白尿、胎盤炎癥和胎兒生長(zhǎng)受限[11]。因cff-DNA的去甲基化的程度比母體的DNA高，特別是低甲基化的CpG DNA序列，這有可能是TLR9的強(qiáng)配體[12]。有趣的是，妊娠期間發(fā)生子癇前期，其絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的異常增加和含有cff-DNA的細(xì)胞碎片的釋放有關(guān)，刺激母體炎性反應(yīng)發(fā)生，促使母體內(nèi)皮功能障礙，而其中的原因可能要?dú)w因于妊娠疾病中嗜中性粒細(xì)胞的激活[13]?；罨氖戎行粤＜?xì)胞擠出染色質(zhì)纖維網(wǎng)，稱為嗜中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)，以消除病原體。 NET的主要結(jié)構(gòu)是DNA和組蛋白。這些碎片激活中性粒細(xì)胞并釋放DNA，從而形成PE中所見的cf DNA總量，并且在患有PE的妊娠婦女中已觀察到NETs的過量產(chǎn)生[13]。

另外在不同程度的PE，其總cf DNA和cff-DNA通過定量可反應(yīng)其嚴(yán)重程度。在重癥子癇前期和輕或中度子癇前期中的總cf DNA和cff-DNA都增加[14]。但與MPE相比，SPE患者cff-DNA和總cf DNA均升高，而且SPE組循環(huán)cf DNA增加可能是由于這些疾病中胎盤病理的差異，同時(shí)SPE患者中的胎盤以合胞結(jié)和梗死數(shù)量增加為特征，這可能與胎盤灌注減少有關(guān)[15]。

2 胎兒分?jǐn)?shù)與PE的關(guān)系

cff-DNA是由凋亡和壞死的胎盤合胞滋養(yǎng)細(xì)胞釋放而來，而胎兒分?jǐn)?shù)是cff-DNA的數(shù)量除以總cf DNA，在大多數(shù)婦女懷孕10周時(shí)超過4%。研究發(fā)現(xiàn)胎兒分?jǐn)?shù)與妊娠34、37周前PE風(fēng)險(xiǎn)存在顯著負(fù)相關(guān)，即胎兒分?jǐn)?shù)越低，妊娠發(fā)生PE的風(fēng)險(xiǎn)越高[16]。這與先前報(bào)道的比較了發(fā)展成PE的女性和沒有發(fā)展PE的女性的胎兒分?jǐn)?shù)結(jié)果一致。其結(jié)果的差異可能是由于cff-DNA相對(duì)于母體cf DNA的增加不那么明顯，從而導(dǎo)致胎兒分?jǐn)?shù)的減少。同時(shí)PE的早期妊娠標(biāo)志物與胎兒分?jǐn)?shù)有密切的關(guān)系，如平均動(dòng)脈壓、妊娠相關(guān)血漿蛋白A、胎盤生長(zhǎng)因子，子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)，胎兒分?jǐn)?shù)與平均動(dòng)脈壓和子宮動(dòng)脈博動(dòng)指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與妊娠相關(guān)血漿蛋白A和胎盤生長(zhǎng)因子呈正相關(guān)。胎兒分?jǐn)?shù)越低，發(fā)生PE的風(fēng)險(xiǎn)越高[16]。因此cf DNA檢測(cè)中胎兒分?jǐn)?shù)低可能是胎盤發(fā)育不良和胎盤功能障礙的一個(gè)標(biāo)志。

3 DNA甲基化在PE中的表達(dá)差異

因?yàn)閏ff-DNA相對(duì)于背景較大的母體DNA濃度較低，缺乏普遍的胎特異性DNA標(biāo)志物，限制了其在NIPT廣泛的臨床應(yīng)用。表觀遺傳改變是細(xì)胞內(nèi)基因組以外的其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變，使基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變。這種改變?cè)谟薪z分裂時(shí)保持穩(wěn)定，通過減數(shù)分裂代代相傳。組織特異性DNA甲基化模式的差異可用于區(qū)分母體DNA和胎盤DNA。在2002年發(fā)現(xiàn)母胎DNA之間存在表觀遺傳學(xué)差異[17]，隨后發(fā)現(xiàn)位于ERG、RUNX3、LINE-1、和HSD11B2基因等大量基因在母胎DNA上存在甲基化差異[1 8-19]，其后ERG被證實(shí)在母體DNA為低甲基化，在胎兒DNA為高甲基化[19]，正常孕婦血漿中甲基化ERG基因的檢出量隨妊娠進(jìn)展而呈升高趨勢(shì)，提示ERG基因含量在母體血漿中隨孕周增加而增加[19]。而對(duì)于RUNX3、LINE-1、和HSD11B2基因，研究發(fā)現(xiàn)HSD11B2基因編碼在高血壓中起關(guān)鍵作用的11β羥基類固醇脫氫酶2型。其主要通過阻止睪丸和胎盤等組織中鹽皮質(zhì)激素受體的激活，在血壓調(diào)節(jié)中起重要作用。與對(duì)照組相比，患有PE的母體中RUNX3、LINE-1和HSD11B2基因的甲基化下降，但這種降低并不明顯。 有趣的是，在PE患者中，HSD11B2、RUNX3和LINE-1甲基化與兒童的出生體質(zhì)量，胎齡和分娩呈正相關(guān)[18]。

SERPINB5基因定位于染色體18q21.33主要表達(dá)子宮胎盤組織[20]。過往的研究報(bào)道SERPINB5基因在胎盤中呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，并在母體血液中呈現(xiàn)高甲基化[21]。乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(mammary serine protease inhibitor，MASPIN)是由SERPINB5基因編碼的人類蛋白質(zhì)，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族[22]。SERPINB5的啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)是影響妊娠早期絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和侵襲的重要因素。 甲基化狀態(tài)的降低可以抑制絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillous trophoblasts，EVTs)的遷移和侵襲，從而影響胎盤形成，并可能導(dǎo)致胎盤缺血和缺氧[22]。同時(shí)之前的研究已發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血漿未甲基化的SERPINB5基因含量比正常妊娠孕婦增加約5.5倍[23]。因此，母體血漿中未甲基化SERPINB5可作為胎兒特異性標(biāo)志物，可用于測(cè)定cf DNA。SPE孕婦母體血液中的未甲基化SERPINB5水平高于正常妊娠的孕婦，但因未甲基化SERPINB5在MPE與妊娠晚期正常孕婦的表達(dá)無明顯差異性，因此未甲基化SERPINB5可能不是MPE的良好標(biāo)志物[23]。

近期發(fā)現(xiàn)在子癇前期的血漿中，STAT5A啟動(dòng)子甲基化較正常妊娠晚期的血漿要低，提示STAT5A抗凋亡的作用下降，胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡率會(huì)增加，cf DNA會(huì)增加[24]。STAT5A啟動(dòng)子區(qū)域，位于母體和胎盤DNA之間。STAT5A在各組胎盤組織中均表現(xiàn)出較高的甲基化水平，提示它是一種更有效的表觀遺傳標(biāo)記。并且也觀察到在PE患者中最明顯失調(diào)的是母體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子DLX5，約70%的PE樣品中DLX5上調(diào)顯著，其胎盤表達(dá)與PE的血清生物標(biāo)志物水平相關(guān)，包括胎盤生長(zhǎng)因子比上可溶性Fms樣酪氨酸激酶。在滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞系中，DLX5的過表達(dá)導(dǎo)致增殖減少，增加新陳代謝和激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[25]。這表明了表觀遺傳變化在PE疾病的發(fā)展和進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。不同途徑中的每個(gè)表觀遺傳變化都會(huì)導(dǎo)致PE的發(fā)生，與PE相關(guān)的變化之一是DNA甲基化變化。因此使DNA甲基化用于PE的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷成為可能，而且DNA甲基化不受性別和基因多態(tài)性影響?？v觀表觀遺傳學(xué)研究，由于基因的表觀遺傳受較多因素的影響，如環(huán)境、遺傳和營(yíng)養(yǎng)等，使得其實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差，穩(wěn)定性也相對(duì)較弱。目前而言并不能完全作為一種診斷疾病的生物標(biāo)志物。雖然如此，但通過了解PE中主要的表觀遺傳學(xué)變化，有助于在治療研究方面上提出一個(gè)猜想——是否糾正這些表觀遺傳學(xué)的變化可預(yù)防或治療對(duì)應(yīng)的疾病，同時(shí)也為產(chǎn)前診斷提供了一個(gè)全新的思路。

4 問題與展望

過去20年來，母體血漿游離胎兒核酸分析取得了快速進(jìn)展。該領(lǐng)域始于1997年使用PCR進(jìn)行單基因檢測(cè)，并已發(fā)展成研究者可以分析整個(gè)胎兒全基因組，并且不斷研究循環(huán)cff-DNA在胎兒全基因組的作用，這將有助于將來確定胎兒每個(gè)基因的完整DNA序列。這些發(fā)展的方面已經(jīng)影響了臨床實(shí)踐，對(duì)于子癇前期的研究在不斷的深入并且可能在不久的未來會(huì)出現(xiàn)相關(guān)的非侵入性產(chǎn)前診斷方法。隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和成本的降低，胎兒甲基組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析有可能最終成為常規(guī)臨床試驗(yàn)。因此，外周游離核酸基因組分析可能在未來的產(chǎn)前醫(yī)學(xué)實(shí)踐中發(fā)揮越來越重要的作用。