陳 菲，周小越，白日蘭，崔久嵬

(吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春130021)

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)最新定義為從惡性腫瘤原發(fā)部位或轉移灶脫落，通過血管或淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán)的細胞，CTCs能反映腫瘤發(fā)生發(fā)展情況，并可通過無創(chuàng)方式和動態(tài)監(jiān)測對腫瘤進行病理診斷、分子測序、疾病監(jiān)測和判斷預后等[1]。近年來許多研究[2-4]證實：存在于外周血中的CTCs與腫瘤轉移有密切關系，隨著檢測技術的逐步進展，CTCs在惡性腫瘤患者診斷、治療效果和預后預測方面的意義受到越來越多的關注。

1 CTCs的生物學特性

1.1 CTCs的表型和亞群分類CTCs可因表型不同而分為幾個亞群，如上皮型CTCs、間質型CTCs、上皮-間質混合型CTCs和腫瘤干細胞樣CTCs(cancer stem cells, CSCs)。上皮-間質混合型CTCs兼有上皮細胞和間質細胞特性，CSCs具有自我更新能力和多向分化潛能，這可能是腫瘤復發(fā)和轉移的根本原因[2，5]。CTCs黏附是腫瘤轉移的關鍵步驟，有研究者[6]利用開放式微流控技術分析3種類型單個CTCs(腦膠質瘤U87 CTCs、結腸腺癌Caco-2CTCs和肝細胞癌HepG2CTCs)在血管內皮細胞(endothelial cells, ECs)上的黏附性，發(fā)現(xiàn)不同表型CTCs對ECs的黏附程度相差明顯，且HepG2CTCs的黏附能力最強。上皮型CTCs黏附于血管內皮通過上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)進入血管成為混合表型CTCs，其經(jīng)歷了機械損傷、細胞凋亡和免疫系統(tǒng)識別殺傷后，到達外周血時僅占外周血白細胞的 1/107～1/106[7]。上皮-間質混合型CTCs再通過間質-上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition, MET)從血管侵入組織形成新的轉移灶[8]，同一疾病的不同進展階段，CTCs表型亦存在明顯差異，且其遠處轉移的潛能和器官偏好性不同[9]。 CTCs具有聚集成團的特性，多個CTCs可形成循環(huán)腫瘤微栓(circulating tumor microemboli, CTM)和CTCs簇(CTCs cluster)，二者均比單個CTCs的存活和轉移能力更強，標志著腫瘤的高度轉移潛能[10]。

1.2 血小板對CTCs存活的影響研究[11-12]顯示：血小板可能參與CTCs的形成、存活和轉移等環(huán)節(jié)。CTCs表面具有與血小板結合的受體或配體，如整合蛋白αvβ3和CD44等，可直接或間接地激活血小板，血小板表面黏附分子αⅡbβ3的抑制劑可減少肺癌CTCs在血管壁定植。在整合蛋白、黏附分子和選擇素(P-選擇素和L-選擇素)等的參與下，CTCs在血液中與纖維蛋白原、血小板及白細胞等形成聚合物即癌栓，逃避血流剪切損傷及免疫殺傷，并在血流中通過逐步黏附而減速直至在血管壁定植，進入組織器官形成轉移[13]。故血小板可能參與CTCs形成、存活和轉移等環(huán)節(jié)，研制新型靶向藥物阻斷CTCs與血小板之間的相互作用有可能在一定程度上阻止腫瘤的復發(fā)和進展。

1.3 免疫細胞對CTCs免疫逃逸的影響CTCs表面廣泛表達生存素是一種抗凋亡蛋白[14]，生存素-3B亞型可以封閉自然殺傷(natural killer, NK)細胞 的細胞毒作用而使腫瘤細胞逃避免疫識別[15]。CTCs的免疫耐受和生存優(yōu)勢很大程度上與其周圍免疫環(huán)境有關。誘導性調節(jié)性T細胞(induced regulatory T cells, iTregs)可由腫瘤誘導產(chǎn)生，抑制免疫細胞對腫瘤的清除，促進腫瘤生長[16]。髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)促進自然調節(jié)性T細胞(natural regulatory T cells, nTregs)增多，并通過白細胞介素10(interleukin-10, IL-10)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)和CD40-CD40L間相互作用等使iTregs增加，也可通過TGF-β的細胞接觸依賴機制或識別NK細胞受體NKp30及NKG2D來抑制NK細胞毒作用及干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)的產(chǎn)生[17]。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)和程序性細胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1, PD-1)是重要的免疫負調控分子，CTCs表面配體與免疫細胞表面受體結合可抑制免疫細胞活性，減弱免疫細胞對腫瘤的殺傷作用，且CTCs表面程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)的表達水平呈動態(tài)變化[18]，這些免疫細胞在外周血中數(shù)量、功能狀態(tài)及表面受體表達可能對CTCs的免疫耐受及生存起決定性作用，可促進遠處轉移的形成。未來應開展更多有關CTCs與免疫治療的研究。

2 CTCs的富集、檢測和分析方法

由于CTCs數(shù)量稀少且表面標志物表達的差異，需要利用多種技術對其篩選和鑒定。臨床實踐中富集和檢測CTCs的技術方法主要有兩大類：①利用CTCs的物理特性，如CTCs大小、密度和電荷等將CTCs與血細胞分離；②在蛋白質分子水平利用CTCs表面的特有分子以區(qū)分腫瘤細胞和血細胞，通?；诳乖贵w反應的原理。獲取CTCs后，還可對其進行核酸分子水平的深入分析，檢測CTCs表達的mRNA或分析CTCs全基因組信息，主要利用逆轉錄多聚酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和二代測序技術(next-generation sequencing, NGS)。

2.1 CTCs的物理富集方法利用CTCs密度、體積大小、細胞剛性和電性能等物理性質與血細胞不同，可實現(xiàn)對CTCs初步篩選，其中最常用的是根據(jù)CTCs密度低于血細胞的密度梯度離心法與根據(jù)CTCs直徑大于血細胞的膜濾過分離法(ISET)。此外，因CTCs表面積更大，導致CTCs的膜電容較高，可通過雙向電泳法分離CTCs[19]。因CTCs具有更高的質核比，還可通過篩選具有高質核比特征的細胞進行CTCs富集[20]。新開發(fā)的柔性微彈簧陣列(flexible micro spring array, FMSA)裝置[21]采用創(chuàng)新設計，無需對血樣預處理即可快速富集活的CTCs，并在10 min內即對CTCs行下游分析，降低了操作過程對CTCs的破壞和對CTCs表型的改變，不僅可富集單個CTCs，還可富集CTCs簇；另一種富集CTCs簇的技術為Cluster-Chip[22]，此微流控芯片技術通過特定的分支誘捕器，從未經(jīng)處理的血液中捕獲具有完整細胞群的CTCs簇，即使是2個細胞組成的CTCs簇也能夠被有效捕獲。對分離的CTCs簇進行下游分析，可有助于理解CTCs簇的生物學特性及其在腫瘤發(fā)展中的作用，并為抑制腫瘤轉移提供新的研究視角。物理富集方法的優(yōu)點是操作簡便、價格相對低、對CTCs活性影響小和便于進行下游分析，避免遺漏具有特定免疫標識的CTCs，從而使富集到的CTCs種類更全面；但仍有一些物理特性與CTCs相似的血細胞會混雜其中，導致分離得到的CTCs純度不高，計數(shù)難度大。因此，迫切需要開發(fā)高性價比的CTCs檢測技術，便于基礎研究和臨床工作。

2.2 CTCs的免疫富集方法利用免疫親和原理開發(fā)的CTCs富集方法較為常用，其利用特異性抗體與細胞表面抗原特異性結合來富集CTCs，根據(jù)捕獲原理不同，可分為陽性富集和陰性富集。陽性富集主要根據(jù)CTCs表達的膜表面特異性標志物如上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)和細胞角蛋白(cytokeratin, CK)等，帶有磁珠的抗體與CTCs表面抗原結合后，在磁場的作用下將CTCs與血細胞分離，后續(xù)再將磁珠與CTCs分離，但是該分離過程會遺漏間質型和EMT型等不表達上述標志物的CTCs，同時也會混入正常循環(huán)上皮細胞，導致假陰性和假陽性，富集到的CTCs活性受損，給下游分析帶來困難。近年來，隨著對腫瘤細胞表面葉酸受體(folate receptors, FRs)高表達的認識，利用CTCs表面FRs檢測CTCs在肺癌中的應用逐漸增多[23]，利用PCR技術識別“配體-寡聚核苷酸偶和物”探針檢測FRs陽性的CTCs，其靈敏度和特異度均較高。陰性富集是利用白細胞表面抗原如CD45的特異性抗體結合白細胞后將白細胞分離，間接篩選出全部類型CTCs，且CTCs未參與抗原抗體反應得以保留其完整特征以便進行下游分析，但該方法獲得的CTCs純度低，富集后剩余的背景白細胞干擾后續(xù)基因分析[24]?；谝陨显黹_發(fā)的技術主要有流式細胞術(flow cytometry,FCM)[25]、細胞搜索系統(tǒng)[26]和生物芯片技術[27]等。細胞搜索系統(tǒng)還可對CTCs簇進行分離檢測。

2.3 基因水平上對CTCs的檢測和分析除了檢測CTCs表面標志物外，對血樣中溶解的CTCs特異性mRNA序列通過RT-PCR技術逆轉錄為互補DNA序列并進行實時PCR擴增后，通過分析mRNA互補DNA序列從而確定CTCs的存在。正常人外周血中不表達上述mRNA，其存在常提示腫瘤基因高表達。mRNA在血液中極易被RNA酶降解，因此mRNA檢測陽性即提示CTCs存在。該技術可在5×107個外周單核細胞中檢測到1個腫瘤細胞[28]，靈敏度高；但RNA易被降解會致結果假陰性，且細胞裂解會影響下一步分析。取樣時細胞污染、假基因干擾和腫瘤標志物在非腫瘤細胞內的非正常轉錄等因素均可能致假陽性結果。

當已經(jīng)獲取得CTCs后，可通過分離和溶解單個CTCs后獲取基因組DNA，利用PCR技術行全基因組擴增，最后經(jīng)NGs分析CTCs全基因組[29]，對腫瘤的認識可深入到分子層面，發(fā)現(xiàn)更多靶點基因和信號通路，最大限度地增加每個患者對藥物選擇的正確性。多位點置換擴增(multiple displacement amplification, MDA) 為目前最常用的全基因組擴增方法。MDA方法是利用枯草芽孢桿菌噬菌體phi29 DNA 聚合酶和具有核酸外切酶抗性的隨機引物，在等溫條件下進行擴增，覆蓋度和均勻性較PCR法均明顯提升[30]。MDA 的缺點主要是偏倚較大，ZONG 等[31]將MDA與常規(guī)PCR技術相結合，開發(fā)出MALBAC 技術以提高擴增的覆蓋度和均勻度。JIANG 等[32]采用納米塑膠CTCs 芯片聯(lián)合激光捕獲顯微切割技術，研發(fā)出一種新型單個CTCs全基因組測序平臺。高通量單細胞基因測序法檢測CTCs有益于從基因水平上對CTCs進行全面分析，并可為腫瘤分子分型和個體化治療提供更加精準的信息。

通過對CTCs檢測方式優(yōu)化的探索，一種新的技術被篩選出來，其將差相富集和瘤標免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交(immunostaining-fluorescenceinsituhybridization, i-FISH)結合, 不依賴腫瘤上皮細胞表面標志物的表達, 對CTCs同時進行瘤標染色與i-FISH染色體計數(shù)的雙重檢測, 具有高靈敏度和高特異度，即SE-i-FISH技術[33]，但尚需更多高質量、多中心和大樣本數(shù)據(jù)支持其應用于臨床。

3 CTCs的臨床應用

3.1 CTCs在腫瘤臨床診斷中的應用CTCs檢測作為液體活檢的方式之一可早于影像學發(fā)現(xiàn)早期腫瘤。對肺癌的研究[34]證明：CTCs對腫瘤的早期診斷和分期判斷具有重要意義。一項納入168例慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者的研究比較了胸部CT和CTCs檢測結果對患者臨床診斷的不同影響，結果顯示:5例患者外，周血中存在CTCs，而胸部CT檢查未發(fā)現(xiàn)肺部小結節(jié)，隨訪監(jiān)測1～4年后，患者胸部CT檢查才發(fā)現(xiàn)肺部小結節(jié)，術后病理結果顯示均為Ⅰa期肺癌[34]。肺部磨玻璃結節(jié)性質的判定對患者治療與否和治療方式的選擇至關重要。CTCs的檢測對結節(jié)性質的判斷意義重大。研究[35]證明：在鑒別非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和肺部良性疾病時，配體靶向PCR技術檢測FRs陽性CTCs比常用的肺癌標志物(CEA、NSE和CYFRA21-1)具有更高的敏感度和特異度，且CTCs與傳統(tǒng)腫瘤標志物結合應用可提高對NSCLC診斷的準確性。此外，肺癌分期越高，患者體內CTCs計數(shù)也越高[35-36]。在其他部位腫瘤的診斷中，CTCs同樣扮演重要角色，如胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)患者4 mL血液中> 3 個CTCs有助于區(qū)分患者的局限期和轉移期[37]，食管癌Ⅲ-Ⅳ患者CTCs陽性表達率高于Ⅰ-Ⅱ患者[38]。轉移性結腸癌進展的晚期階段，患者CTCs的CSCs樣表型表達水平逐漸升高[9]。CTCs計數(shù)和表型的轉變能夠輔助腫瘤的定性及惡性程度的判斷，CTCs計數(shù)越多提示病灶臨床分期可能越晚，可在一定程度上指導臨床決策。

3.2 CTCs對腫瘤治療效果評價的作用與常用腫瘤標志物和影像學檢查比較，CTCs計數(shù)在用于評估抗腫瘤治療的療效更易被患者接受，因為CTCs血液取樣方便，無輻射，特異度高，避免了影像學檢查的滯后性。CTCs細胞核大小可揭示甚至預測疾病進展。關于前列腺癌[39]、胃癌[40]、胰腺癌[41]和NSCLC[42]的研究證明：CTCs基線數(shù)及其動態(tài)變化可評估化療的敏感性和腫瘤復發(fā)風險。CTCs細胞核的大小與疾病的發(fā)展階段有關。對前列腺癌患者的研究[43]發(fā)現(xiàn)：在轉移性去勢抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC)患者中非常小核CTCs(very small nuclear CTCs, vsnCTCs)和小核CTCs(small nuclear CTCs, snCTCs)居多，且在具有內臟轉移的患者中vsnCTCs計數(shù)更多，提示不僅CTCs計數(shù)是評價療效的指標，且CTCs細胞核大小亦具有療效評估意義，可能預測發(fā)生內臟轉移的患者，但需要更大規(guī)模的前瞻性試驗去驗證該結果，vsnCTCs的生物學特點也需要深入探究，并研究其在檢測和預測內臟轉移中的應用價值。在免疫治療中，CTCs也具有重要的應用價值和研究空間。研究[18]證明：CTCs表面PD-L1表達水平和PD-L1高表達(PD-L1 high) CTCs占CTCs總數(shù)的比例與抗PD-L1藥物療效呈正相關關系，PD-L1 high患者接受抗PD-L1治療后預后更好。CTCs計數(shù)的動態(tài)變化可用于免疫治療效果評估，且基線PD-L1 high CTCs≥20%可作為抗PD-1治療中對可能受益的患者進行分層的生物標志物。CTCs與組織活檢得到的腫瘤細胞共同表達免疫檢查點，只需抽取患者外周血即可預測免疫治療效果，避免了多次組織活檢給患者帶來的痛苦。未來需要更多的研究探討CTCs表面免疫治療靶點在臨床應用中的潛在價值。

3.3 CTCs對判斷患者預后的價值CTCs計數(shù)已被證明與腫瘤患者的總生存時間(overall survival, OS)呈負相關關系。監(jiān)測mCRPC患者的CTCs計數(shù)[44]結果提示血液中CTCs >5個/7.5 mL的患者OS率低于血液中CTCs <5個/7.5 mL的患者。隨著對CTCs與腫瘤患者預后關系認識的深入，2018年美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC)指南已將CTCs列為乳腺癌預后評估工具，即乳腺癌患者外周血中存在CTCs提示預后不良。研究[45]顯示：CTCs陽性的激素受體陽性乳腺癌患者5年后腫瘤復發(fā)風險是CTCs陰性患者的13倍。CTCs作為新型液體生物標志物，可輔助腫瘤危險分層和預測腫瘤復發(fā)風險，提示對于激素受體陽性的早期乳腺癌，若其CTCs陽性，則術后輔助治療需要更積極的治療手段和更長的療程，但該結論尚有待更多高質量和多中心的臨床研究證實。此外，CTCs表型也是患者的預后影響因素。CSCs(+)/部分EMT(+)CTCs計數(shù)高的患者對化療不敏感，尤其是在人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)陰性的患者中，其無進展生存時間(progression-free survival, PFS)和OS更短[46]，所以CSCs(+)/部分EMT(+)CTCs是乳腺癌復發(fā)風險的獨立預后影響因素。經(jīng)化療栓塞治療的不可切除肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者中，EpCAM(+)CTCs計數(shù)越高，患者的存活率越低[47]。因此對具有上述CTCs特征患者的治療手段是否要更積極也值得思考。未來，在對CTCs計數(shù)研究的基礎上，尚需開展更多針對CTCs表型與腫瘤發(fā)展和治療關系的研究，以探討不同表型CTCs可能表達的受體可以作為特異性標志物在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學作用機制，從CTCs中鑒別出能夠真正形成轉移的亞群細胞，靶向甚至逆轉侵襲性表型是腫瘤治療的研究方向之一。

3.4 CTCs對個體化治療的影響CTCs起源于實體腫瘤，監(jiān)測CTCs可了解患者對藥物的敏感性及其變化情況。一方面，CTCs攜帶的基因信息與腫瘤組織具有一致性，如組織活檢證實為EGFR-T790M突變陽性的NSCLC患者， CTCs中同樣存在該突變[48]，因此CTCs可能替代腫瘤組織活檢指導靶向治療。但另一方面，腫瘤細胞分化過程中，會產(chǎn)生具有顯著異質性的亞克隆細胞群體，CTCs基因組與原發(fā)病灶基因組并非始終一致，如在一些HER-2陰性的乳腺癌患者外周血中發(fā)現(xiàn)HER-2陽性的CTCs[49]，這部分患者也可考慮使用曲妥珠單抗等針對HER-2位點的靶向藥物進行治療。因此可將CTCs檢測作為組織活檢的補充，在首次確診腫瘤時可以利用組織活檢指導治療，而在后續(xù)跟蹤療效中可選擇檢測和分析CTCs替代組織活檢指導藥物選擇。HER-2陰性、CSCs(+)、部分EMT(+)和CTCs計數(shù)高的乳腺癌患者對化療不敏感[46]，對該患者采取其他治療手段至關重要，如可采用針對CSCs、EMT(+)CTCs相關分子和途徑的新型靶向療法。將CTCs分離培養(yǎng)行體外研究可能發(fā)現(xiàn)腫瘤的原發(fā)和繼發(fā)耐藥分子機制，從而為發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供信息，為研發(fā)新型靶向藥物和選擇精準合理的治療方案提供切實的理論依據(jù)。

CTCs代表實體瘤的液體成分，是腫瘤殘留負荷的替代性標志物。盡管CTCs狀態(tài)是乳腺癌復發(fā)和死亡的預后影響因素，但關于其在指導臨床治療中作用的研究較少。研究[50]提示：HER-2的乳腺癌患者經(jīng)過5年內分泌治療后，CTCs計數(shù)增加代表腫瘤負荷較大，繼續(xù)內分泌治療可預防或延緩患者復發(fā)。目前早期乳腺癌患者接受術后放療是否獲益尚無有效的生物標志物可以預測。而最近研究[51]表明：CTCs狀態(tài)可能對預測放療是否獲益有一定臨床價值。研究[51]顯示：接受保乳術的乳腺癌患者若CTCs呈陽性，術后放療可明顯改善患者的DFS、無局部復發(fā)生存時間(local recurrence-free survival, LRFS)和OS，這種生存獲益可能與CTCs陽性患者具有較高局部殘留病灶負荷或存在內分泌抵抗有關；而接受保乳術的CTCs陰性患者和接受乳房切除術的CTCs陽性患者是否接受術后放療與預后均無顯著相關性。這可在一定程度上指導乳腺癌臨床治療策略，并提示CTCs陽性與病灶殘留可能相關，需進一步研究以闡明CTCs陽性與局部復發(fā)風險增加相關的潛在機制。此外，檢測CTCs中腫瘤相關蛋白的表達也可指導個體化治療。研究[52]證明：CTCs中雄激素受體剪接變異體7(androgen receptor splice variant 7, AR-V7)蛋白表達水平檢測有助于指導mCRPC患者的臨床治療，AR-V7蛋白陽性表達的mCRPC患者對雄激素受體信號(androgen receptor signal,ARS)抑制劑不敏感，而對紫杉類化療藥物較敏感，提示對CTCs中相關蛋白表達水平的分析可能是未來CTCs研究的方向之一。

4 展 望

近年來，CTCs在腫瘤早期篩查、診治和監(jiān)測等方面的研究已經(jīng)取得顯著進步，CTCs檢測是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實時療效監(jiān)測手段。CTCs檢測安全無創(chuàng)并可反復獲取以對腫瘤進行實時監(jiān)測，作為液體活檢的方式之一，CTCs檢測有助于腫瘤個體化診療、轉移監(jiān)測和預后判斷。臨床實踐中，充分利用患者血樣中的CTCs可輔助制定最佳治療計劃，對其進行分子水平分析可實現(xiàn)對疾病的有效監(jiān)測并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。與傳統(tǒng)影像學診斷、內鏡檢查和病理學診斷比較，CTCs檢測的優(yōu)勢更顯著，可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，更科學和迅速地評價治療方案的效果，但其作為新一代腫瘤標志物的探索和臨床應用仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如CTCs的異質性和脆性、對CTCs基因表達認識的不足、相關檢測技術價格高和存在假陽性及假陰性等。未來研究中，應改進分離和檢測CTCs的方法以提高檢測結果的特異度、敏感度及通量，優(yōu)化培養(yǎng)及分析技術，更好地認識患者血樣中CTCs的形態(tài)及功能特性。臨床治療中應實時監(jiān)測CTCs計數(shù)以了解疾病進展，為患者制訂更個體化的治療方案以更好地輔助腫瘤精準治療。