王 彤 任蒙蒙 徐陸正 趙燕榮 鄒 晶 韓鴻賓 袁 蘭

(北京大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系 北京大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心，北京 100191)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，復(fù)發(fā)率高，尤其是惡性膠質(zhì)瘤[1]。經(jīng)腦間質(zhì)途徑給藥是避開血腦屏障的微創(chuàng)腦病治療新技術(shù)，也是化學(xué)療法治療腦膠質(zhì)瘤的新途徑。Bobo等[2]提出的對流增強(qiáng)給藥方法(convection enhancement delivery，CED)已于2009年獲美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于腦膠質(zhì)瘤的臨床研究。組織間隙(extracellular space，ECS)是相鄰腦細(xì)胞之間不規(guī)則、腔隙性結(jié)構(gòu)，其內(nèi)充滿組織間液(interstitial fluid，ISF)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)[3,4]。ISF是神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的直接生存環(huán)境，負(fù)責(zé)物質(zhì)交流、細(xì)胞間通訊，同時(shí)也是神經(jīng)系統(tǒng)藥物發(fā)揮作用的場所[5,6]。CED將藥物分子在連續(xù)正壓力下經(jīng)導(dǎo)管注入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，認(rèn)為藥物借助壓力可以在腦實(shí)質(zhì)廣泛分布[7]。然而，CED仍然存在局限性：①注入藥物的濃度及分布很難監(jiān)測和控制；②給藥模式對腦組織具有一定的機(jī)械性損害；③注入的藥物容易出現(xiàn)反流，從而降低療效。針對CED存在的問題，本課題組提出經(jīng)間質(zhì)治療的新方法——簡單擴(kuò)散給藥方法(simple diffusion delivery，SDD)并將其成功應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)經(jīng)腦間質(zhì)給予小分子神經(jīng)保護(hù)藥物的簡單擴(kuò)散給藥方法可以有效預(yù)防大腦神經(jīng)元的缺血性損傷[8]。但是，無論CED還是SDD，經(jīng)腦間質(zhì)途徑給藥始終缺少一種監(jiān)測藥物在腦內(nèi)分布的有效手段。探討腦膠質(zhì)瘤內(nèi)部藥物清除、瘤內(nèi)ECS結(jié)構(gòu)特征及其變化規(guī)律，對于腦膠質(zhì)瘤微創(chuàng)治療方法的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

在本研究中，我們將基于示蹤技術(shù)的MRI成像法與光學(xué)成像法結(jié)合起來，對藥物在膠質(zhì)瘤內(nèi)的擴(kuò)散過程進(jìn)行實(shí)時(shí)可視化和定量評估。以Alexa Flour 594和釓噴酸葡銨(Gd-DTPA)分別作為光、磁示蹤劑，比較藥物在對照組大鼠的丘腦區(qū)及尾狀核區(qū)ECS內(nèi)以及在C6膠質(zhì)瘤大鼠位于丘腦區(qū)及尾狀核區(qū)的腦膠質(zhì)瘤內(nèi)隨ISF的分布及擴(kuò)散參數(shù)的改變，以期對膠質(zhì)瘤區(qū)ECS的改變以及瘤內(nèi)腦ISF引流情況進(jìn)行更深的了解，從而為CED給藥治療腦膠質(zhì)瘤方案的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

磁共振對比劑Gd-DTPA購自德國Bayer Schering Pharma AG；熒光探針Alexa Flour 594購自美國Life Technologies；戊巴比妥鈉(25 g)購自美國Sigma-Aldrich；多聚甲醛(4%)購自北京索萊寶科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000購自美國Invitrogen；二甲基亞砜、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒購于美國Amersco。

激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SP8 MP，Leica，德國)和流式細(xì)胞儀(FACS，BD FACSCalibur，美國)由北京大學(xué)醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心提供；3.0T磁共振成像儀(Magnetom Trio，西門子公司，德國)由北京大學(xué)第三醫(yī)院提供；鼠腦立體定位儀和鼠腦模具購自深圳瑞沃德公司。

1.2 細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動物[9]

C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞(ATCC No. CCL 107)，置于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(高糖型)中，在37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)。

48只雄性SD大鼠購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)科學(xué)部[SYXK(京2008-0021)]，體重250～300 g。隨機(jī)分為4組：丘腦對照組、丘腦腫瘤組，尾狀核對照組、尾狀核腫瘤組，每組12只。每組再隨機(jī)分為光學(xué)示蹤亞組及磁示蹤亞組(n=6)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守國家動物實(shí)驗(yàn)指南的要求，并獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會實(shí)驗(yàn)動物福利倫理分會審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：LA2018-306)。

1.3 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)染[10]

C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種在25 mm2培養(yǎng)瓶中至70%～80%融合，為獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，以Lipofectamine 2000為轉(zhuǎn)染試劑，pEGFP-G為質(zhì)粒載體。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟按照Lipofectamine 2000說明書操作。轉(zhuǎn)染48 h后，以1∶10傳代。用800 μg/ml G418分選GFP強(qiáng)陽性細(xì)胞，抗G418熒光陽性克隆出現(xiàn)在培養(yǎng)4周左右。流式分選法重復(fù)篩選熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為GFP-C6細(xì)胞。

1.4 大鼠腦膠質(zhì)瘤模型的制備[9]

丘腦腫瘤組和尾狀核腫瘤組24只SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，固定在鼠腦立體定位儀上，分別按照丘腦(前囟：-3.5，+3.0，-6.0 mm)，尾狀核(前囟：+1.0，+3.5，-6.0 mm)的立體坐標(biāo)，在目標(biāo)植入?yún)^(qū)上方顱骨上鉆直徑1 mm小孔。將GFP-C6細(xì)胞懸液10 μl(1×107細(xì)胞)以漢密爾頓微量注射器以1 μl/min的速度注入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，注射完畢后停針5 min，緩慢拔針?？股叵緜冢揽扑喾忾]顱孔，以原條件飼養(yǎng)接種腫瘤的大鼠。

1.5 腦膠質(zhì)瘤模型的檢測及體積測定

膠質(zhì)瘤種植第10天，用MRI對大鼠腦進(jìn)行磁共振序列掃描(T1WI和T2WI)[9]。丘腦區(qū)、尾狀核區(qū)膠質(zhì)瘤種植區(qū)域出現(xiàn)T1WI低信號，T2WI高信號的團(tuán)狀異常信號表示膠質(zhì)瘤建模成功。用MRI數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算得到腫瘤體積。對光學(xué)示蹤組的12只模型鼠腦切片同時(shí)進(jìn)行共聚焦成像分析，觀察是否得到有綠色熒光的腫瘤組織。

1.6 光學(xué)示蹤法

以Alexa Flour 594(10 mmol/L)作為光學(xué)示蹤法的示蹤劑，對24只光學(xué)示蹤組的SD大鼠(丘腦對照組、丘腦腫瘤組、尾狀核對照組、尾狀核腫瘤組各6只)進(jìn)行示蹤分析。腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，T1加權(quán)成像(3D T1WI MP-RAGE)序列進(jìn)行MRI預(yù)掃描[9]。大鼠暴露顱骨后固定在鼠腦立體定位儀上，根據(jù)腫瘤種植部位確定打藥位點(diǎn)：丘腦腫瘤組及尾狀核腫瘤組進(jìn)針處為MRI預(yù)掃描的腫瘤中心區(qū)域。對照組根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》確定打藥位點(diǎn)。按照上述丘腦、尾狀核的立體坐標(biāo)，以微量注射器吸取Alexa Flour 594 2 μl以0.2 μl/min的速率注射，停針5 min后緩慢拔針。注射2 h后，大鼠心臟灌流取腦[11]，以4%多聚甲醛固定腦組織。固定12 h，鼠腦切片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察ISF的擴(kuò)散分布情況。

1.7 MRI示蹤法

Gd-DTPA以0.9%NaCl溶液稀釋至10 mmol/L作為磁示蹤劑，對24只核磁示蹤組的SD大鼠(丘腦對照組、丘腦腫瘤組、尾狀核對照組、尾狀核腫瘤組各6只)進(jìn)行示蹤分析。腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，T1加權(quán)成像(3D T1WI MP-RAGE)序列進(jìn)行MRI預(yù)掃描[2]，記作T0，根據(jù)光學(xué)示蹤法所述方法，按照上述丘腦、尾狀核的立體坐標(biāo)，以微量注射器吸取Gd-DTPA 2 μl以0.2 μl/min的速率注射。將大鼠置于MRI進(jìn)行連續(xù)3D T1WI MP-RAGE序列掃描(注射后15、30、45、60、90、120、150、180、210和240 min)，掃描期間維持大鼠麻醉狀態(tài)。

1.8 數(shù)據(jù)處理分析

2 結(jié)果

2.1 C6細(xì)胞GFP轉(zhuǎn)染情況

C6細(xì)胞進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)染后，使用激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)。在488 nm激光激發(fā)下，GFP-C6細(xì)胞可以發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光(圖1A)。傳代培養(yǎng)3個(gè)月后，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度基本沒有變化，凍存6個(gè)月以上的細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞存活良好，且熒光強(qiáng)度基本不變。

2.2 膠質(zhì)瘤成像及MRI體積測定

GFP-C6細(xì)胞種于SD大鼠腦內(nèi)10天，鼠腦切片的熒光圖像顯示膠質(zhì)瘤區(qū)呈現(xiàn)綠色熒光，浸潤性生長，破壞了原有區(qū)域的纖維組織(圖1B)。從MRI的T2圖像上可以觀察到尾狀核區(qū)、丘腦區(qū)膠質(zhì)瘤的高信號(圖1C)。通過MRI數(shù)據(jù)處理軟件測得丘腦區(qū)腫瘤體積(128.61±2.04)mm3，尾狀核區(qū)腫瘤體積(101.83±2.72)mm3。

2.3 丘腦腫瘤組腦ISF引流的變化

Gd-DTPA在丘腦對照組以及丘腦腫瘤組隨時(shí)間擴(kuò)散的MRI圖像分別用矢狀位、橫軸位和冠狀位表示(圖2A)。比較Gd-DTPA在丘腦對照組和丘腦腫瘤組的擴(kuò)散參數(shù)，相較于丘腦對照組，丘腦腫瘤組的清除速率(k’)、迂曲度(λ)顯著增加，半衰期(t1/2)、有效擴(kuò)散系數(shù)(DECS)顯著減小(表1)。采用共聚焦顯微鏡采集丘腦對照組、丘腦腫瘤組的斜矢狀位熒光圖像(圖2B)，結(jié)果顯示，相較于丘腦對照組，丘腦腫瘤組的最大擴(kuò)散面積顯著增大。丘腦對照組及丘腦腫瘤組D-mapping圖像更加直觀地體現(xiàn)丘腦腫瘤組DECS減小(圖2C)。

2.4 尾狀核腫瘤組腦ISF引流的變化

Gd-DTPA在尾狀核對照組以及尾狀核腫瘤組隨時(shí)間擴(kuò)散的MRI圖像分別用矢狀位、橫軸位和冠狀位表示(圖3A)。Gd-DTPA表現(xiàn)為高信號。比較Gd-DTPA在尾狀核對照組和尾狀核腫瘤組的擴(kuò)散參數(shù)，相較于尾狀核對照組，尾狀核腫瘤組k’、λ顯著增加，t1/2、DECS顯著減小(表1)。采用共聚焦顯微鏡采集尾狀核對照組、尾狀核腫瘤組的斜矢狀位熒光圖像(圖3B)，結(jié)果顯示，相較于尾狀核對照組，尾狀核腫瘤組的最大擴(kuò)散面積顯著增大。尾狀核對照組及尾狀核腫瘤組D-mapping圖像更加直觀地體現(xiàn)尾狀核腫瘤組DECS減小(圖3C)。

圖1 GFP-C6細(xì)胞的熒光圖像及鼠腦膠質(zhì)瘤檢測：A. 488 nm激光下GFP-C6的熒光圖像、光鏡圖像、熒光圖像與光鏡圖像的疊加圖；B.尾狀核區(qū)、丘腦區(qū)膠質(zhì)瘤的熒光圖像,圖中綠色部分代表膠質(zhì)瘤，B1.尾狀核膠質(zhì)瘤，B2.丘腦區(qū)膠質(zhì)瘤(標(biāo)尺，2 mm)，B3.膠質(zhì)瘤的高倍成像(標(biāo)尺，100 μm)；C.膠質(zhì)瘤的MRI T2WI序列成像，圖中高信號區(qū)代表膠質(zhì)瘤，C1.尾狀核區(qū)膠質(zhì)瘤，C2.丘腦區(qū)膠質(zhì)瘤 圖2 光、磁示蹤劑在丘腦對照組和丘腦腫瘤組ECS中擴(kuò)散分布圖像及擴(kuò)散參數(shù)：A. Gd-DTPA在丘腦對照組及丘腦腫瘤組中隨時(shí)間擴(kuò)散的MRI矢狀位、冠狀位、橫軸位圖像；B. Alexa Flour 594在丘腦對照組及丘腦腫瘤組中擴(kuò)散2 h后的離體腦片圖像，B1-1.丘腦對照組Alexa Flour 594擴(kuò)散的熒光圖像，B1-2.丘腦對照組腦切片的光鏡圖像，B1-3.丘腦對照組熒光圖像與光鏡的疊加圖像，B2-1.丘腦腫瘤組Alexa Flour 594擴(kuò)散的熒光圖像，B2-2.丘腦腫瘤組腦切片的光鏡圖像，B2-3.丘腦腫瘤組熒光圖像與光鏡的疊加圖像，B2-4.丘腦腫瘤組的腫瘤圖像；C.丘腦對照組及丘腦腫瘤組的D-mapping圖像，分別用二維、三維圖像表示示蹤劑在矢狀位圖像中的DECS值分布，紅色代表DECS數(shù)值較大，藍(lán)色代表DECS數(shù)值較小

表1 Gd-DTPA在腫瘤組與對照組中擴(kuò)散參數(shù)的比較

DECS，有效擴(kuò)散系數(shù)；k’，清除速率；λ，迂曲度；t1/2，半衰期；S，擴(kuò)散面積

圖3 光、磁示蹤劑在尾狀核對照組和尾狀核腫瘤組ECS中擴(kuò)散分布圖像及擴(kuò)散參數(shù)：A. Gd-DTPA在尾狀核對照組及尾狀核腫瘤組中隨時(shí)間擴(kuò)散的MRI矢狀位、冠狀位、橫軸位圖像；B. Alexa Flour 594在尾狀核對照組及尾狀核腫瘤組中擴(kuò)散2 h后的離體腦片圖像，B1-1.尾狀核對照組Alexa Flour 594擴(kuò)散的熒光圖像，B1-2.尾狀核對照組腦切片的光鏡圖像，B1-3.尾狀核對照組熒光圖像與光鏡的疊加圖像，B2-1.尾狀核腫瘤組Alexa Flour 594擴(kuò)散的熒光圖像，B2-2.尾狀核腫瘤組腦切片的光鏡圖像，B2-3.尾狀核腫瘤組熒光圖像與光鏡的疊加圖像，B2-4.尾狀核腫瘤組的腫瘤圖像；C.尾狀核對照組及尾狀核腫瘤組的D-mapping圖像，分別用二維、三維圖像表示示蹤劑在矢狀位圖像中的DECS值分布，紅色代表DECS數(shù)值較大，藍(lán)色代表DECS數(shù)值較小

3 討論

MRI和光學(xué)示蹤法是國際上目前研究腦ECS常用的兩種分析方法。MRI是臨床常用的非侵入性活體成像方法，其具有較高的軟組織分辨率，但其具有空間分辨率低的內(nèi)在局限性，有時(shí)無法精確顯示示蹤劑分布的范圍。熒光成像是一種靈敏度高的成像方法，然而其組織穿透力較弱。因此，將MRI與熒光成像技術(shù)聯(lián)合既能提供高分辨率的組織學(xué)信息，又能實(shí)現(xiàn)高靈敏的功能學(xué)顯像，在腦膠質(zhì)瘤成像與診斷上具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。本研究將這兩種成像方法結(jié)合起來，共同評價(jià)其在丘腦、尾狀核生長膠質(zhì)瘤后腦ISF引流規(guī)律的變化。

本研究結(jié)果顯示，丘腦腫瘤組及尾狀核腫瘤組與其對照組相比，膠質(zhì)瘤內(nèi)部ISF的k’顯著增加，t1/2顯著縮短。這可能是由于膠質(zhì)瘤區(qū)瘤內(nèi)壓力高于正常腦，小分子示蹤劑注入瘤內(nèi)后在壓力驅(qū)使下快速清除[13]。丘腦區(qū)及尾狀核區(qū)膠質(zhì)瘤使ISF的DECS顯著降低，同時(shí)丘腦及尾狀核區(qū)膠質(zhì)瘤的生長導(dǎo)致瘤內(nèi)ECS的λ增加，這可能是由于腫瘤細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞外基質(zhì)成分增多，造成ECS結(jié)構(gòu)和其內(nèi)擴(kuò)散的改變[9]。Aibo等[14]的研究顯示，神經(jīng)纖維束除具有電傳導(dǎo)的功能外，還具有引導(dǎo)ISF引流的作用。因此，腦膠質(zhì)瘤的生長所引起的腦ISF引流改變，可能與腫瘤生長導(dǎo)致腫瘤區(qū)鄰近纖維束的破壞有關(guān)。

在我們的前期研究中[15]，利用MRI觀察膠質(zhì)瘤內(nèi)部的藥物擴(kuò)散與分布，觀察到藥物只局限于膠質(zhì)瘤內(nèi)部，并不向膠質(zhì)瘤外擴(kuò)散。本研究將光學(xué)成像方法與MRI成像方法結(jié)合起來共同分析膠質(zhì)瘤內(nèi)藥物的擴(kuò)散過程，結(jié)果顯示微量的藥物可以從瘤內(nèi)擴(kuò)散至瘤周正常組織，這對于腦膠質(zhì)瘤的藥物治療非常重要。

本研究闡明腦ISF在膠質(zhì)瘤內(nèi)藥物擴(kuò)散分布的規(guī)律，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期對于藥物在膠質(zhì)瘤周的擴(kuò)散分布的研究[9,15]，對于經(jīng)ECS給藥治療膠質(zhì)瘤具有重要的指導(dǎo)意義。