★ 盧黃欣 劉萍 李瑋婷 楊軍平（.江西中醫(yī)藥大學 南昌 0004；. 南昌大學 南昌 0004；.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 0006）

類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一類以慢性滑膜炎為特征的全身性自身免疫疾病，從屬中醫(yī)學“痹病”“痹證”范疇，又有“骨痹”“尪痹”“白虎歷節(jié)”“鶴膝風”等稱謂。RA在老年疾病中患病率極高，后期容易誘發(fā)嚴重并發(fā)癥，并易致殘，末期患者生活質量大大降低，因此一直是風濕免疫病研究重點。目前對本病的病因和發(fā)病機制的研究取得較大進展，但認識尚不全面，且臨床治療效果局限。中醫(yī)對該病的本質及診療有獨特見解，其中，《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標準·中醫(yī)病證診斷療效標準》將尪痹證候分為風濕熱郁、風寒濕阻、氣血虧虛、腎虛寒凝、肝腎陰虛、痰瘀互結六種證型［1］，根據中醫(yī)臨床證候分型及辨證論治，其療效較佳［2］，其中關于辨證論治的生物學基礎研究較多，但尚未形成規(guī)范化的證候診斷標準。隨著系統(tǒng)生物學研究不斷推進，環(huán)狀RNA與RA關系被逐步闡明，其中越來越多的研究者已然認識到環(huán)狀RNA在分子生物水平上以不同的作用機制對RA的發(fā)生發(fā)展產生巨大影響。同時，環(huán)狀RNA所具備的穩(wěn)定性、保守性、時空特異性和組織特異性等特性可為證候研究提供思路。因此從環(huán)狀RNA角度來構建出與類風濕性關節(jié)炎中醫(yī)證候相關的環(huán)狀RNA來尋找特異性證候生物學標志譜具有較高的科學研究意義。本文通過對環(huán)狀RNA在類風濕性關節(jié)炎和中醫(yī)證候中的研究進展進行綜述，探討環(huán)狀RNA在類風濕性關節(jié)炎及其中醫(yī)證候研究中的潛在臨床應用。

1 circRNA概述

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類缺乏典型3’端polyA尾和5’端帽子結構、并具有共價鍵閉合環(huán)狀結構的內源性非編碼RNA。在1976年，circRNA首次在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)［3］，后來又發(fā)現(xiàn)其在真核生物中廣泛存在。circRNA在被發(fā)現(xiàn)的短期內一直被認為代表剪接錯誤的副產物，并認為其低豐度存在。直到近期，circRNA的特點及生物學功能不斷被挖掘，證明其發(fā)現(xiàn)在人類疾病中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明，circRNA種類繁多，數量豐富［4］，并且具有細胞類型特異性，在造血細胞，血小板，紅細胞中差異表達，且在成熟過程中其種類和數量會發(fā)生變化［5］。不僅如此，circRNA在組織、疾病、種屬間具有特異性［6-7］；同時，circRNA不同于線性RNA，對核酸外切酶識別不敏感，更具保守性和穩(wěn)定性［8］。深入研究發(fā)現(xiàn)，circRNA具有多種生物學功能，比如：可通過海綿狀的吸附miRNA［9-10］，或通過調節(jié)RNA結合蛋白相互作用參與RNA、蛋白質的存儲和轉運［11-12］，并發(fā)揮著調控基因轉錄作用［13］，以及直接翻譯成蛋白質［14-15］。其中CircRNA可通過充當miRNA海綿調節(jié)許多生物學過程，包括DNA甲基化、免疫反應和炎癥反應，促進疾病的發(fā)展。同時，因免疫細胞中的circRNA的多種生物學功能性，而在自身免疫性疾病中起到重要治療作用［16-17］。

2 類風濕性關節(jié)炎中醫(yī)證候研究

在RA疾病治療中，傳統(tǒng)中醫(yī)學充分發(fā)揮病證結合、辨證論治的特點，具有獨特的優(yōu)勢。其中中醫(yī)證候的規(guī)范化診斷對其治療效果尤為重要。在對RA證候分型研究中，學者認為RA具有獨特的證候學特征，但辨證分型多樣，證素相對簡約，而證素可通過排列組合形成證候，從而建立以證素為核心的辨證診療體系［18］。其中也有學者綜合應用多元統(tǒng)計分析方法探討RA癥狀、舌脈與常見中醫(yī)證候之間的關系，使今后的證候診斷及臨床辨證更加客觀化［19-20］。然而，目前RA證候龐雜，證型多樣，在臨床上辨證施治時欠缺規(guī)范、標準的證候診斷體系，所以明確證候診斷極其重要。其中在證候初期研究中，學者主要圍繞證候的分類、命名、診斷標準以及與現(xiàn)代醫(yī)學指標相關性、分型指導現(xiàn)代醫(yī)學臨床決策等內容展開研究，但對證候的實質認識始終模糊不清。其中20世紀80年代“微觀辨證”的提出，將中醫(yī)經典辨證論治的視野擴展到神經遞質、免疫甚至基因調節(jié)，為中醫(yī)證候診斷標準提供了新的指導意義。由于中醫(yī)證候是一個“動態(tài)時空”“內實外虛”“多維多階”的復雜系統(tǒng)［21］，具有動態(tài)性、整體性、非線性等特點，只有將系統(tǒng)生物學引入到證候研究中，才能探討其實質，使證候更具科學性及客觀性。其中，為探索證候本質及明確診斷標準，學者將研究重點轉向系統(tǒng)生物學，目前已有大量學者從代謝組學、轉錄組學、蛋白質組學等［22-23］不同角度揭示RA中醫(yī)證候實質，為明確證候診斷標準提供科學依據。其中，研究者的思路并不局限于局部觀和線性思維，而是轉向整體觀和復雜思維的基因組學研究來探究證候的本質［24］，并取得一定進展。根據基因芯片技術和高通量測序技術的提出與應用，以及對其技術結果進行生物信息學和統(tǒng)計學的比較分析，篩選出疾病證型特定的表達基因，為中醫(yī)的微觀化研究提供了新思路。盡管目前從cicrRNA角度進行證候研究鮮有報道，但將cicrRNA應用到中醫(yī)證候微觀辨證研究中，仍大有作為，可為指導臨床診斷及治療提供理論依據。

3 circRNA在類風濕性關節(jié)炎中的應用

circRNA是人類疾病表觀遺傳調控的關鍵因素，其中表觀遺傳的失調可直接影響自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展及免疫細胞功能［25］。目前大量研究表明circRNA在分子生物水平上廣泛參與類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展［26］。

3.1 參與發(fā)病機制 RA的主要特征就是類風濕性關節(jié)炎成纖維滑膜細胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs）大量增生，進而對關節(jié)軟骨及骨組織造成進行性破壞。目前大量研究表明，miRNA廣泛參與調控RASFs增殖、RASFs凋亡及RASF侵襲，同時miRNA異常表達可導致自身免疫耐受機制受損。CircRNA是競爭性內源性RNA網絡的一部分，被認為是miRNA海綿，在許多疾病的發(fā)展中起著至關重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-125a-3p是由其他研究實驗證實的has-circ-0005397靶向的miRNA［27］，可能參與類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。同時也有研究表明has-circ-0001859可以與轉錄因子2（ATF2）競爭miR-204/211，has-circ-0001859的下調抑制了SW982細胞ATF2的表達，降低炎癥活性，從而參與了滑膜組織的慢性炎癥過程［28］。除此以外，Tang等［29］研究發(fā)現(xiàn)介導CDR1反義穩(wěn)態(tài)調節(jié)的miR-671在RA患者中的相對表達顯著降低，其下調可影響RA患者ciRS-7的水平。研究中明顯增加的ciRS-7可抑制miR-7的功能，進一步減輕miR-7對mTOR的抑制作用，從而參與RA的發(fā)生。

3.2 作為生物分子標志物 早期診斷對人類疾病治療與預后尤為重要，尋找早期診斷的方法一直是研究熱點。circRNA特殊的閉合環(huán)狀結構且不易降解的特點決定其在進化過程中更具穩(wěn)定性，并且大量存在于血液和唾液等其他生物液體中［30-31］；同時，有研究表明circRNA在不同組織、種屬和疾病中具有特異性，表明其在生物學標志物領域具有潛在作用。目前關于circRNA的生物標志物功能研究主要集中于心血管疾病及各類腫瘤等疾病中，隨著相關技術的推進，此功能在類風濕性關節(jié)炎中也得到體現(xiàn)。Zheng等［32］通過circRNA芯片發(fā)現(xiàn)RA患者與健康對照組共表達差異表達circRNA584個，其中255個circRNA顯著上調，329個circRNA顯著下調，采用qRT-PCR結果顯示hsa_circ_0088088和hsa_circ_0038644表達顯著下調，hsa_circ_0092285、hsa_circ_0058794表達顯著上調，對RA的診斷及治療提供了一個嶄新的方向。Ouyang等［33］通過circRNA微陣列篩選5名RA患者和5名健康對照者的PBMCs中發(fā)現(xiàn)circRNA_104871、circRNA_003524、circRNA_101873、circRNA_103047顯著升高，并通過ROC曲線分析顯示circRNA_104871對RA診斷有顯著價值。楊璇等［34］采用高通量測序技術發(fā)現(xiàn)4例RA患者和3例健康對照組PBMC中共有71種顯著差異表達的circRNAs，其中41種上調，30種下調，生物信息學分析顯示，涉及的通路多與炎癥和轉錄活性相關。經實時熒光定量PCR（qRT-PCR）結果顯示hsa_circ_0000396和hsa_circ_0130438在RA患者PBMCs中的表達水平顯著下調，其中，ROC曲線分析進一步表明顯示hsa_circ_0000396有望成為RA診斷分子標志物。同時，外周血中hsa_circ_0002715和hsa_circ_0035197的組合被證實可能是新發(fā)RA患者的潛在生物標志物［35］。

3.3 反應疾病嚴重性 隨著研究推進，眾多研究者發(fā)現(xiàn)circRNA的表達與疾病的檢驗指標存在顯著相關性，可反應疾病嚴重性或活性。了解疾病嚴重程度可對患者病情進行更準確的評估，避免嚴重并發(fā)癥，進而有利于患者后續(xù)治療及預后。研究者發(fā)現(xiàn)RA患者PBMC中hsa_circ_0000175的表達與抗枸櫞酸蛋白抗體、淋巴細胞/中性粒細胞百分率、白細胞/淋巴細胞/中性粒細胞計數、中性粒細胞與淋巴細胞比值相關［36］；PBMC中hsa_circ_0008410表達與關節(jié)活動度、血小板壓積、血小板計數、病程有關［36］；外周血中hsa_circ_0002715［35］表達水平與關節(jié)腫脹計數（SJC）、抗環(huán)瓜氨酸蛋白抗體（ACPA）、關節(jié)壓痛計數（TJC）、血液病、類風濕因子（RF）、病程相關；外周血中hsa_circ_0035197表達水平與血液病相關［35］；以及在WEN的研究中發(fā)現(xiàn)RA患者血清hsa-circ_0001200水平與CCP水平呈正相關［37］，hsa-circ_0001566水平與CCP呈正相關，與IGA呈負相關，hsa-circ_0003972與DAS28、關節(jié)壓痛呈正相關，hsa-circ_0008360水平與CCP呈負相關，均表明異常表達的circRNA與RA的疾病活性和嚴重程度相關。

4 circRNA與類風濕性關節(jié)炎中醫(yī)證候相關性

“證”不僅包括“望、聞、問、切”四診所了解的宏觀指標，還包括微觀信息。作為中醫(yī)診斷基本原理之一，“見微知著”即通過對細微變化的觀察，可以測知整體的狀況?！拔⒂^辨證”應同“宏觀辨證”相結合，在傳統(tǒng)中醫(yī)辨證施治理論的指導下，對“證”的診斷統(tǒng)一規(guī)范化起輔助作用。在中醫(yī)證候的微觀研究中，掌握好中醫(yī)整體觀念與微觀指標的聯(lián)系，結合證候的模糊性與微觀信息的準確性是研究中應重視的部分。微觀研究是探索中醫(yī)證候內涵與實質的途徑之一，其中不少學者利用病證結合的方法，通過應用轉錄組、蛋白組、基因組的差異信息，建立“異病同證”“同病異證”的生物學基礎和潛在的生物標志物［38］。眾所周知，“異病同證”即不同疾病，即使存在個體差異、季節(jié)差異、地區(qū)或氣候改變，卻有相同的癥狀，“證”的屬性就相同，即具有共同的病理機制；同病異證指同一疾病因個體差異及環(huán)境因素不一致，從而“證”的屬性不同。學者根據這一中醫(yī)理論知識，將目光轉向circRNA與中醫(yī)證候相關性研究，但目前應用circRNA芯片技術和高通量測序技術探索circRNA和RA中醫(yī)證候相關性的研究較少，而將circRNA引入到中醫(yī)證候研究中，優(yōu)勢頗多，如：（1）circRNA具有較強的疾病特異性、組織特異性，與中醫(yī)“同病異證”“異病同證”有一定聯(lián)系；（2）circRNA表達的時空特異性與中醫(yī)證候的動態(tài)時空特異性相似；（3）circRNA廣泛存在于血液、唾液和其他生物體液中，且種類繁多，其差異性表達可一定程度體現(xiàn)中醫(yī)的整體觀；（4）目前關于circRNA的發(fā)現(xiàn)與命名較少，其基因表達相對證候復雜性比例較小，將circRNA應用到證候研究，更易開展實施，有利于研究的進一步深入進行。總之，從circRNA角度建立與中醫(yī)證候間的聯(lián)系，可加深目前對中醫(yī)證候機制的理解，并為進一步研究中醫(yī)理論的分子基礎提供基礎，進而為傳統(tǒng)中醫(yī)精準辨證論治提供科學依據。

目前有學者篩選RA及其他疾病氣滯血瘀證型（QSBSS）患者異常表達的circRNA，探討circRNA在證候研究中的作用。Chen［39］通過測序技術獲得circRNA表達譜，并與類風濕性關節(jié)炎、冠心病、慢性胃炎氣滯血瘀證型患者及正常對照組進行比較，發(fā)現(xiàn)2個circRNA有顯著差異表達；并對其進行生物信息學分析表明，QSBSS中差異表達的RNA最顯著的富集途徑是鞘脂類信號通路、神經營養(yǎng)蛋白信號通路和內吞作用，此外，網絡藥理學分析表明，幾種差異表達的RNA被納入了中藥治療QSBSS的靶點。同時，在高嘉良［40］的研究中，同樣選取類風濕性關節(jié)炎、冠心病、慢性胃炎氣滯血瘀證型患者和冠心病非氣滯血瘀證型患者以及健康人群共25例，分為5組，并通過高通量測序技術，在25例樣本中共檢測到25059個circRNA。其中circRNA_24450、circRNA_18046、circRNA_11523、circRNA_09849在氣滯血瘀證型中差異表達。這些研究提示不同疾病在同一證候中cicrRNA有差異性表達，不僅為中醫(yī)證候生物學基礎研究做出新貢獻，并使中醫(yī)臨床診斷更加客觀化，但目前關于cicrRNA在同一疾病不同證候的差異表達鮮有報道。隨著不同疾病同一證型cicrRNA表達的研究不斷深入，其同一疾病不同證型的cicrRNA表達研究亦具有可行性。

5 展望

中醫(yī)證候的生物學基礎研究是中醫(yī)證候現(xiàn)代化研究中的一大方向，其中尋找中醫(yī)證候分子生物學標志物是中醫(yī)證候生物學基礎研究的重點所在。自從circRNA被發(fā)現(xiàn)以來，科研人員在RA方面已做大量研究，但是circRNA與RA中醫(yī)證候相關性研究較少。將circRNA引入RA中醫(yī)證候研究，探索中醫(yī)證候特定基因譜可為我們研究證候生物學基礎及尋找證候生物標志物提供新的切入點，并使RA中醫(yī)證候診斷和辨證論治更具科學性，同時可為古代方劑的優(yōu)化和新藥物的發(fā)現(xiàn)提供新的思路，并為中醫(yī)理論的發(fā)展和醫(yī)療醫(yī)療保健的改善鋪平道路。但是，目前關于circRNA的研究處于初期階段，以及由于臨床診斷的局限性和脫靶效應，將circRNA整合于臨床實踐中并有效應用仍面臨很多問題。因此，需進一步驗證circRNA的功能，并發(fā)揮其臨床應用價值。例如：（1）進行實驗驗證時增加樣本量和樣本類型，降低偶然性；（2）分析檢測circRNA的最佳血液成分；（3）統(tǒng)一circRNA的命名；（4）簡化并標準circRNA檢測方法。相信隨著相關研究的不斷推進，circRNA不僅廣泛參與RA的發(fā)生發(fā)展，亦能基于circRNA異常表達尋求RA證候分型標志物，也能為中醫(yī)藥診治RA做出貢獻。