馬 杰，丁 野，羅 艷，李瑞蓮，王湘波△

（1．湖南省藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001； 2．湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)中心，湖南 長沙 410001）

燙骨碎補是骨碎補的炮制品，由水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）J．Sm．的干燥根莖經(jīng)凈制或切制后照燙法用砂燙至鼓起，再撞去毛而得。其功效為療傷止痛、補腎強骨，筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動；外用消風祛斑，用于跌撲閃挫，外治斑禿、白癜風［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，骨碎補功效作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為總黃酮［2-3］。經(jīng)砂燙后，骨碎補質(zhì)地酥脆，有利于有效成分的提取［4］。柚皮苷作為骨碎補中總黃酮的代表性成分，文獻對其含量受燙制的影響程度報道不一，如有研究認為炮制后其柚皮苷含量變化不大［5］，但也有研究表明砂燙后柚皮苷含量降低［6］。以上研究對骨碎補的炮制均在實驗室中完成，但目前市售燙骨碎補飲片由中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)，在炮制過程中設(shè)備、規(guī)模及工藝參數(shù)均與實驗室存在差異。為全面、客觀地考察燙制對骨碎補中柚皮苷含量變化的影響，本研究中開展了2個方面的研究：一是與中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)合作，實地參與骨碎補的砂燙炮制，考察不同溫度、炮制時長對柚皮苷含量的影響；二是收集不同中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)的多批次骨碎補藥材及相對應(yīng)的燙骨碎補飲片產(chǎn)品中柚皮苷的數(shù)據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Mettler AE-200型電子天平（萬分之一），Mettler CP-225D型電子天平（十萬分之一），德國梅特勒公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；CY-700型滾筒式燃油炒藥機（杭州市富陽方正制藥設(shè)備廠）；CTDC900型電磁炒藥機。

試藥：柚皮苷對照品（含量測定用，批號為110722-201714，純度為93．4%）由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

樣品：從不同飲片生產(chǎn)企業(yè)收集10批骨碎補藥材（序號為Y1～Y10）和其對應(yīng)生產(chǎn)的批燙骨碎補飲片，以及現(xiàn)場炮制骨碎補藥材2批（序號為Y11～Y12），所有樣品均經(jīng)湖南省藥品檢驗研究院主任藥師丁野鑒定為水龍骨科植物槲蕨的干燥根Drynaria fortunei（Kunze）J．Sm．。樣品信息詳見表1。

表1 骨碎補藥材樣品及對應(yīng)燙骨碎補信息表

2 方法與結(jié)果

2．1 樣品炮制

在炒藥筒內(nèi)加入河砂（粒徑5～8 mm）及少量植物油，加熱并開啟滾筒，待溫度升至設(shè)定值后，取骨碎補藥材適量加至滾筒中翻炒，并隨時觀察骨碎補形態(tài)，當全部骨碎補炒至鼓起后，出料，篩去河砂后攤涼，再撞去毛，即得。電磁炒藥機設(shè)置加熱溫度為280℃，約6 min可炒好；燃油炒藥機設(shè)置加熱溫度為300℃，約2 min可炒好。

為考察燙制時長的影響，電磁式加熱炒藥機于加料后的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 min時分別取部分樣品待測；燃油式加熱炒藥機于加料后的0．5，1．0，1．5，2．0，2．5，3．0，3．5，4．0，4．5，5．0，5．5，6．0，7．0 min時分別取部分樣品待測。

為考察燙制溫度的影響，取同一批骨碎補藥材（批號為20190202，產(chǎn)地為貴州施秉），分別在電磁式加熱炒藥機設(shè)置加熱溫度為140，200，240，280，320，360℃下砂燙，以炒至全部鼓起為準，出料，篩去河砂后攤涼，再撞去毛，即得。

2．2 溶液制備

供試品溶液［7-9］：取本品粗粉約0．25 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇30 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置50 mL容量瓶中，用少量甲醇分數(shù)次洗滌容器，洗液濾入同一容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

對照品溶液：稱取柚皮苷對照品23．83 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液（445．144 4μg／mL）。精密吸取對照品貯備液，加甲醇依次稀釋成質(zhì)量濃度為89．028 8，17．805 7，3．561 1，0．712 2μg／mL的對照品溶液。

2．3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Capcell Pak C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：甲醇-2%冰醋酸水溶液（35∶65）；流速：1．0 mL／min；檢測波長：283 nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)按柚皮苷計不低于3 000。

圖1 高效液相色譜圖

2．4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：吸取質(zhì)量濃度為445．144 4，89．028 8，17．805 7，3．561 1，0．712 2μg／mL的對照品溶液5μL或10μL，注入液相色譜儀，測定，以進樣量為（X，ng）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程Y＝1 862．3X＋7 156．3，r＝0．999 9。結(jié)果表明，柚皮苷進樣量在3．561 2～2 226 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取同一燙骨碎補（批號為180603）供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次5μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果的RSD為0．59%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一燙骨碎補（批號為180603）供試品溶液，分別于配制后的0，3，6，12，24 h時精密吸取5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。結(jié)果的RSD為0．61%（n＝5），表明供試品溶液在配制后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一燙骨碎補樣品（批號為180603），依法平行制備6份供試品溶液，測定含量。結(jié)果為7．91 mg／g，RSD為0．78%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已測定含量的同一燙骨碎補（批號為180603，含柚皮苷7．913 mg／g）供試品約0．125 g共9份，精密稱定，置錐形瓶中，按80%，100%，120%的水平精密加入質(zhì)量濃度為476．6μg／mL的柚皮苷對照品溶液適量，依法制備供試品溶液，測定并計算。結(jié)果見表2。

2．5 樣品含量測定

取各批樣品粉碎，按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，測定柚皮苷峰面積積分值，按外標法計算柚皮苷的百分含量（按干燥品計）。結(jié)果見表3、表4和圖2。

表3 燙骨碎補與骨碎補藥材柚皮苷含量變化（%）

表4 燙制溫度對柚皮苷含量的影響

3 討論

圖2 燙制時長對柚皮苷含量的影響

電磁式炒藥機和燃油式炒藥機的加熱方式不同，電磁式更易把握加熱速率和控制加熱時間，不會在很短時間內(nèi)將樣品炒焦。但二者對柚皮苷含量的影響相似，隨著炮制時間的增加，柚皮苷的含量逐漸降低。使用電磁式炒藥機燙制，6 min即可炒至全鼓起，柚皮苷含量降至炒前的69．6%，12 min后樣品被炒焦，柚皮苷含量逐漸降至最低。使用燃油式炒藥機燙制，2 min即可炒至全鼓起，柚皮苷含量降至炒前的80．4%，7 min便將樣品炒焦，柚皮苷含量逐漸降至最低。

不同燙制溫度對燙制后骨碎補的含量影響結(jié)果表明，不同燙制溫度對柚皮苷含量水平的影響程度不同，電磁炒藥機設(shè)置為240℃、燃油炒藥機設(shè)置為220℃可使柚皮苷損失最少，2家生產(chǎn)企業(yè)設(shè)置的加熱溫度和時間并未讓柚皮苷含量得到最大程度的保留。

扣除水分的影響，以干燥品計，收集的10批次燙骨碎補與燙制前相比，柚皮苷含量明顯升高的有4批，明顯降低的有2批，未見明顯變化的有4批，變化率范圍從20．29%～151．98%，不同批次間的含量變化情況迥異，與本試驗中考察的柚皮苷含量均降低的結(jié)果不吻合。一方面不同生產(chǎn)企業(yè)燙骨碎補柚皮苷的變化率差異較大，可能由于中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)之間不同的砂燙工藝參數(shù)對柚皮苷的含量造成了不同程度的影響；另一方面，部分生產(chǎn)企業(yè)的柚皮苷含量變化趨勢也存在較大差異，表明在生產(chǎn)企業(yè)燙制時工藝參數(shù)不穩(wěn)定。因此，有必要繼續(xù)擴大生產(chǎn)企業(yè)、炮制方法等考察范圍，以更加全面、準確、客觀地評價柚皮苷的含量變化規(guī)律。

在燙制骨碎補時，使用的是現(xiàn)代化的加熱設(shè)備，燙制溫度可設(shè)定為固定數(shù)值，而燙制時長即燙制終點仍需操作人員憑經(jīng)驗時刻觀察骨碎補的鼓起情況來判斷。在實際考察中發(fā)現(xiàn)，骨碎補藥材的規(guī)格均一性對燙制時長有較大影響：藥材大小、粗細越接近，所有骨碎補藥材均燙至鼓起的時間越相當，燙制時長就相對較固定；藥材大小、粗細差異較大，則在燙制時，細小和粗大的鼓起時間差異較大，造成當粗大的燙至鼓起時，細小的已錯過了最佳出料時間，從而降低了柚皮苷的含量。因此，建議在生產(chǎn)燙骨碎補時，使用大小、粗細等規(guī)格較接近或經(jīng)均勻切制后的骨碎補藥材作為原料。

為研究骨碎補毛（鱗片）的保留情況對柚皮苷含量的影響程度，試驗還考察了燙制前后骨碎補毛（鱗片）中柚皮苷的含量，結(jié)果表明，骨碎補毛（鱗片）中柚皮苷含量為根莖主體的10%左右，燙制后柚皮苷略有上升。因其質(zhì)量占比較低，故骨碎補毛的保留程度對骨碎補砂燙后造成的影響可忽略不計。