劉銀花

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全球胃癌死亡患者約有74萬[1]，我國胃癌發(fā)病率也逐年遞增，5年總體生存率僅為20%[2]。目前胃癌的診斷仍以病理活檢作為金標(biāo)準(zhǔn)，但此時大多數(shù)患者已是胃癌晚期，對于胃癌早期患者缺少非侵入性的檢查手段，導(dǎo)致漏診率高、診療不及時等后果。因此尋找特異性的生物標(biāo)志物，輔助胃癌早期診斷及治療具有重要意義。近年來，研究發(fā)現(xiàn),Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的過度激活會誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，而分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP蛋白)含有Frizzled結(jié)構(gòu)能抑制Wnt通路所介導(dǎo)的細(xì)胞生長效應(yīng)，其中SFRP2甲基化與腫瘤的發(fā)病過程密切相關(guān)[3-4]。NDRG4是抑癌基因NDRG家族的主要成員之一[5]，相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NDRG4在結(jié)腸癌、直腸癌中是腫瘤抑制基因，不表達(dá)或低表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用[6-7]。但SFRP2和NDRG4雙重抑癌因子在胃癌組織中的表達(dá)如何及其功能影響未見明確報道，本研究擬采用Western-blot和熒光定量PCR檢測SFRP2和NDRG4在胃癌病灶組織和正常組織中的表達(dá)，旨在評估其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為胃癌的診斷治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月至2017年12月我院64例接受手術(shù)切除治療的胃癌患者作為研究對象。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)[2]：①所有患者術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)活檢證實(shí)胃癌且符合手術(shù)切除治療指征。②術(shù)后病理切片證實(shí)病變組織性質(zhì)胃癌。③患者術(shù)前均未接受過任何放、化療。④無其他合并腫瘤疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他外科手術(shù)。②合并心血管疾病。③肝功能異常。入選患者男性35例，女性29例；年齡48～69歲，平均年齡(55.1±8.74)歲。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)和國際抗癌聯(lián)盟TNM系統(tǒng)(2010年)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理分型Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期39例，其他臨床資料完整。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 手術(shù)切除中，取適量胃癌病灶組織和距離腫瘤邊緣5 cm以上的癌旁正常組織分別作為觀察組和對照組。4 ℃生理鹽水清洗清除組織殘留血液后-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫印跡Western-blot檢測胃組織中SFRP2和NDRG4蛋白含量 取100 mg胃組織，以1∶10的加入RIPA裂解液(含1% PMSF)于冰下勻漿提取蛋白樣品，10000×g離心(4 ℃)10 min后取上清，BCA試劑盒(碧云天有限公司)測定蛋白含量并調(diào)節(jié)蛋白濃度至相同，加入5×上樣緩沖液沸水浴10 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?5 μl樣品上樣，通過10%SDS-P聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-聚丙烯酰胺試劑盒)跑膠分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。分別加入GAPDH(1∶3000，武漢安特捷有限公司)、SFRP2(1∶1000，Abcam)和NDRG4(1∶1000，Abcam)一體4 ℃孵育過夜。次日TBST洗滌5次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶1000)室溫孵育后，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑ECL法曝光顯影獲得蛋白條帶。

1.2.3 RT-PCR檢測胃組織SFRP2和NDRG4 mRNA水平變化 稱取各組胃組織40 mg，利用TRIzol法提取總RNA，然后將1 μg總RNA通過cDNA Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR在LightCycler@480(Roche公司)設(shè)備中進(jìn)行，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，并以GAPDH作為內(nèi)參測定SFRP2和NDRG4 mRNA水平(引物序列均由安特捷有限公司設(shè)計提供)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱10 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；循環(huán)30次。定量PCR特異產(chǎn)物通過溶解曲線分析，以2-ΔΔCT表示相對基因表達(dá)變化。用于定量PCR的引物序列如表1。

表1 實(shí)時定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。SFRP2和NDRG4 檢測結(jié)果采用(±s)表示，組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌病灶組織和正常組織中SFRP2和NDRG4蛋白含量的表達(dá)

Westren-blot檢測結(jié)果如圖1所示，胃癌病灶組織中SFRP2(灰度值0.149±0.044)和NDRG4(灰度值0.19±0.038)蛋白含量，顯著低于正常對照組SFRP2(灰度值0.557±0.123)及NDRG4(灰度值0.740±0.093)蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.396，P=0.006；t=9.511，P=0.001)。

2.2 胃癌病灶組織和正常組織中SFRP2和NDRG4 mRNA水平的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果如表2所示，胃癌病灶組織中SFRP2和NDRG4 mRNA的相對表達(dá)量分別為(0.331±0.048)和(0.276±0.085)，正常組織中SFRP2和NDRG4 mRNA的相對表達(dá)量則是(1.056±0.145)和(1.043±0.150)，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SFRP2和NDRG4 mRNA在胃癌病灶組織中的表達(dá)顯著低于正常組織。

圖1 胃癌病灶組織和正常組織中SFRP2和NDRG4蛋白表達(dá)

表2 胃癌病灶組織和正常組織中SFRP2和NDRG4mRNA水平(±s)

表2 胃癌病灶組織和正常組織中SFRP2和NDRG4mRNA水平(±s)

分組SFRP2/GAPDHmRNANDRG4/GAPDHmRNA正常組織1.056±0.1451.043±0.150病灶組織0.331±0.0480.276±0.085t8.2097.718P0.0010.002

2.3 SFRP2、NDRG4表達(dá)聯(lián)合預(yù)測診斷胃癌的能力

如表3所示，本研究采用 Logistic回歸分析了SFRP2、NDRG4表達(dá)對預(yù)測胃癌的作用。Logistic回歸顯示，NDRG4表達(dá)水平(OR=4.2，95%CI：2.3～8.7，P<0.05)對胃癌的預(yù)測能力略優(yōu)于SFRP2(OR=3.5，95%CI：1.9～7.3)。同時檢測到2種基因表達(dá)的敏感性和特異性分別為44.2%和87.6%，OR值為5.8(95%CI：2.8～12.9)，表明SFRP2和NDRG4聯(lián)合檢測優(yōu)于單獨(dú)檢測。

表3 SFRP2、NDRG4表達(dá)聯(lián)合檢測診斷胃癌的能力

3 討論

胃癌的發(fā)病過程非常復(fù)雜，其中涉及到遺傳、基因突變、蛋白表達(dá)異常等情況。近年來，有研究報道，基因突變、相關(guān)因子異常甲基化在胃癌中較為常見，尤其是某些腫瘤相關(guān)基因的啟動子發(fā)生甲基化修飾，抑癌因子的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)會誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生、發(fā)展[3,8]。

腫瘤疾病中，Wnt信號通路與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程密切相關(guān)。當(dāng)Wnt配體與其受體Frizzled蛋白結(jié)合后經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，β-catenin聚積進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此當(dāng)Wnt配體及其受體組織中過度表達(dá)時就會導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化異常，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[9]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP蛋白)含有Frizzled結(jié)構(gòu)能抑制Wnt通路所介導(dǎo)的細(xì)胞生長效應(yīng)。既往研究報道[3,10-11]，SFRP2能拮抗Wnt/β-catenin 通路抑制細(xì)胞增殖及凋亡，胃癌發(fā)病過程中，SFRP2甲基化及表達(dá)顯著下調(diào)，這可能與Wnt信號通路過度激活有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌病灶組織中SFRP2蛋白灰度值為(0.149±0.044)，較正常組織中的(0.557±0.123)明顯降低，同時SFRP2 mRNA在胃癌病灶組織表達(dá)也顯著低于正常組織，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果和趙成海、鄭朝坂等的研究相似[3,9]，證實(shí)了SFRP2表達(dá)下調(diào)參與了胃癌的病理發(fā)展。

前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[7,12-13]，NDRG家族的基因表達(dá)增加在結(jié)/直腸癌、宮頸癌中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化作用；其中，NDRG4作為一種抑癌基因可能參與了腫瘤疾病的發(fā)生。Schiling等報道[14-15]，NDRG4高表達(dá)可阻滯癌細(xì)胞的侵襲，并抑制P13K/AKT信號通路的活性發(fā)揮抑癌作用。目前該基因及蛋白在胃癌中的表達(dá)及其功能未見明確的報道。本實(shí)驗(yàn)采用Western-blot和熒光定量PCR檢測了胃癌病灶組織和正常組織NDRG4蛋白及mRNA的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)了胃癌病灶組織中NDRG4蛋白表達(dá)與正常組織比較顯著下調(diào)，NDRG4 mRNA水平也明顯降低(P<0.05)，這提示該基因在在胃癌中也起抑癌蛋白功能。最后，本研究還首次分析了聯(lián)合檢測SFRP2、NDRG4的表達(dá)對預(yù)測胃癌診斷的作用，結(jié)果提示聯(lián)合檢測SFRP2和NDRG4蛋白及mRNA表達(dá)OR值最高，有助于提高胃癌診斷的特異性，優(yōu)于單獨(dú)檢測。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胃癌病灶組織中SFRP2和NDRG4蛋白及mRNA表達(dá)同時下調(diào)，證實(shí)了SFRP2和NDRG4均參與了胃癌的病理發(fā)展；同時還探究了聯(lián)合測定這兩種腫瘤相關(guān)因子有助于提高胃癌診斷的特異性。因此，我們認(rèn)為在臨床實(shí)踐中可以考慮同時檢測SFRP2和NDRG4的表達(dá)作為輔助診斷胃癌的重要指標(biāo)，為胃癌的早期診療提供參考。