張小華, 劉東艷

溫度與溶解態(tài)有機磷源對中肋骨條藻生長的影響

張小華1, 2, 3, 劉東艷4

(1. 中國科學(xué)院 煙臺海岸帶研究所 海岸環(huán)境過程重點實驗室, 山東 煙臺 264003; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 濱州醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 山東 煙臺 264003; 4. 華東師范大學(xué) 河口與海岸學(xué)國家重點實驗室, 上海 200241)

為探討溫度與溶解態(tài)有機磷(Dissolved organic phosphorus, DOP)對浮游植物生長的共同影響, 本文以中肋骨條藻為研究對象, 選取含有C-O-P鍵的三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)、甘油磷酸鈉(Sodium glycerophosphate, SG-P)、6-磷酸葡萄糖(Glucose 6-phosphate, G-6-P)和含有C-P鍵的草甘膦(Glyphosate, G-P)為不同類型的DOP, 檢測了4種溫度條件下(20、23、26、29℃)藻細胞的生長狀況以及培養(yǎng)液中總?cè)芙鈶B(tài)磷(Total dissolved phosphorus, TDP)、溶解態(tài)無機磷(Dissolved inorganic phosphorus, DIP)濃度與藻細胞內(nèi)堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)的變化。研究結(jié)果表明: 含有C-O-P鍵的ATP、SG-P和G-6-P均能較好地維持中肋骨條藻的生長, 并且升溫可進一步促進各組藻細胞的生長, 最大藻細胞密度分別達到176.7×104、218.8×104和 178×104cell/mL; 此外升溫還可加速ATP、SG-P和G-6-P組培養(yǎng)液中TDP濃度的下降, 以及ATP組培養(yǎng)液中DIP濃度的升高; 但各組藻細胞內(nèi)AP活性在不同溫度條件下均處于較低水平(< 10 fmol pNP /(cell· h))。與含有C-O-P鍵的DOP相比, G-P組的藻細胞在各溫度條件下生長密度均較低, 最大藻細胞密度僅為40.7×104cell/mL ; 但其藻細胞內(nèi)AP活性顯著高于ATP、SG-P和G-6-P組[最高達83 fmol pNP /(cell·h)]且隨溫度升高而降低。以上結(jié)果表明, 不同類型DOP會顯著影響中肋骨條藻的生長, 其中ATP、SG-P和G-6-P能更為有效地被中肋骨條藻生長所利用, 并且溫度升高(20~29℃)是促進3種DOP條件下中肋骨條藻生長的重要環(huán)境因素, 但該效應(yīng)可能并不依賴于AP活性。

中肋骨條藻; 溫度; 生長; 溶解態(tài)有機磷; 溶解態(tài)無機磷; 堿性磷酸酶

溶解態(tài)無機磷(Dissolved inorganic phosphorus, DIP)是海洋浮游植物生長的必需營養(yǎng)元素, 然而, 很多海域存在季節(jié)性磷限制的現(xiàn)象[1-2]。已有研究表明, 在DIP限制的條件下, 部分浮游植物可以利用溶解態(tài)有機磷(Dissolved organic phosphorus, DOP), 大量繁殖生長, 甚至形成赤潮[3]。DOP是近岸海域中廣泛存在的一種重要磷源, 在海洋總?cè)芙鈶B(tài)磷(Total dissolved phosphorus, TDP)中占有很大比例[4-6]。例如, 有調(diào)查表明, 黃河口及鄰近海域DOP的含量大約貢獻了TDP的85%左右[7], 是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的重要因素之一[8]。DOP結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 由眾多復(fù)雜混合物組成。根據(jù)其所含C、P鍵型不同, 基本可分為兩大類有機化合物: 含有C-O-P鍵的磷酸酯和含有C-P鍵的膦酸酯[9]。大量研究表明DOP需要先被轉(zhuǎn)化為DIP才能被浮游植物吸收利用[10-11], 其轉(zhuǎn)換利用能力一方面受到DOP的結(jié)構(gòu)影響, 另一方面受到海洋環(huán)境因子的影響。例如, 海洋中痕量金屬元素(鋁、鋅等)的存在可以促進浮游植物對DOP的利用[12-13]; 較高的海水溫度也會促進浮游植物對DOP的轉(zhuǎn)化吸收速率[14]。

有研究表明, 海洋變暖會加劇海水的富營養(yǎng)化效應(yīng),促進浮游植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用, 加劇赤潮的爆發(fā)頻率和規(guī)模[15-16]。DOP是富營養(yǎng)化海域的重要磷源, 浮游植物在海水暖化條件下, 對不同結(jié)構(gòu)DOP的吸收利用能力可顯著影響到生物生產(chǎn)量, 乃至赤潮的發(fā)生, 因此, 有必要深入探討溫度與DOP對浮游植物生長的影響效應(yīng)。本研究選取我國東部沿海的一種常見赤潮藻-中肋骨條藻()[17-18]為研究對象, 在四個不同的溫度條件下(20、23、26、29℃), 分別添加三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)、6-磷酸葡萄糖(Glucose 6-phosphate, G-6-P)、甘油磷酸鈉(Sodium glycerophosphate, SG-P)和草甘膦(Glyphosate, G-P)四種不同形態(tài)的DOP, 通過分析藻細胞生長特征, 以及培養(yǎng)液中TDP、DIP濃度和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)活性變化, 探討了升溫與不同DOP對中肋骨條藻生長的影響特征, 研究結(jié)果將為揭示海水暖化條件下DOP豐富海區(qū)浮游植物的生長狀態(tài)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)及實驗設(shè)計

中肋骨條藻()分離自我國黃海海域。實驗所用玻璃器皿均使用10% HCl浸泡24 h, 純凈水沖洗干凈后, 放于烘箱烘干備用。培養(yǎng)所用海水為人工海水, 參照Harrison等[19]的方法配制, pH值為8.0±0.1, 鹽度為30±1, 經(jīng)121℃高壓濕熱滅菌30 min,室溫冷卻后備用。實驗室中肋骨條藻的培養(yǎng)條件光照為55 μmol/(m2· s), 光暗周期為12 h/12 h, 溫度為20℃, 培養(yǎng)液為f/2營養(yǎng)鹽配方[20]。

實驗選擇4種不同類型的DOP, 分別代表海洋中存在的兩種P鍵類別: G-6-P、ATP和SG-P代表含有C-O-P鍵的磷酸酯, G-P代表含有C-P鍵的膦酸酯。參照f/2培養(yǎng)基中NaH2PO4的濃度(36 μmol/L), 分別添加36 μmol/L G-6-P、12 μmol/L ATP(約為36 μmol/L P)、36 μmol/LSG-P和36 μmol/L G-P配制不同類別磷源的培養(yǎng)液, 其他各種元素依舊按f/2配方添加; 對照組使用f/2培養(yǎng)基。中肋骨條藻生長最適溫度在20~30℃之間[21-22], 因此本次實驗在此區(qū)間設(shè)定4個溫度條件, 分別為20、23、26、29℃。接種指數(shù)生長期的中肋骨條藻到各含有600 mL不同磷源培養(yǎng)液的1 L錐形瓶中(表1), 起始藻細胞密度為5×104cell/mL, 然后分別置于預(yù)設(shè)4個溫度條件的恒溫光照培養(yǎng)箱中, 連續(xù)培養(yǎng)7 d, 每個處理組合均設(shè)3個重復(fù)。每天固定時間從各組中取50 mL樣品, 用于藻細胞計數(shù)、培養(yǎng)液中TDP、DIP濃度以及細胞AP活性的測定。

1.2 藻細胞計數(shù)

取100 μL樣品用于藻細胞計數(shù), 取樣前混勻藻液, 將盧戈氏液加入取樣樣品中固定藻細胞, 使用0.1 mL浮游植物計數(shù)框(20 mm×20 mm)于顯微鏡下對每個樣品進行計數(shù), 計算每mL樣品中含有的藻細胞個數(shù)。

表1 實驗分組情況列表

1.3 生長速率計算

根據(jù)每天獲得的藻細胞密度, 采用下列公式[23]計算本實驗中肋骨條藻的生長速率:

= (ln2– ln1)/(2–1),

式中,2和1分別代表時間2和1的細胞密度。

1.4 培養(yǎng)液中DIP與TDP濃度的測定

50 mL的培養(yǎng)液離心后, 上清經(jīng)醋酸纖維膜過濾, 用于測定培養(yǎng)液中DIP和TDP的濃度。DIP采用以抗壞血酸為還原劑的磷鉬藍比色法測定(海洋調(diào)查規(guī)范第4部分: 海水化學(xué)要素調(diào)查GB17378.4- 2007)。TDP根據(jù)Jeffries等[24]的方法進行測定, 過濾培養(yǎng)液加入50 g/L的過硫酸鉀, 121℃消解30 min, 冷卻至室溫, 再采用以抗壞血酸為還原劑的磷鉬藍比色法進行測定。

1.5 胞內(nèi)AP活性的測定

離心收集的藻細胞用于胞內(nèi)AP活性的測定。參照Lin等[25]的方法, 以對硝基苯磷酸二鈉(4-Nitrophenyl phosphate, pNPP)為底物測定AP活性變化。收集到的藻細胞加入1 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl (pH=9)的緩沖液, 在冰浴條件下勻漿1~2 min, 勻漿后離心取上清, 與50 μL 20 mmol/L的pNPP混勻, 對應(yīng)培養(yǎng)溫度條件下黑暗中放置2 h, 隨后將樣品放置冰上終止酶反應(yīng), 10 000離心2 min, 取上清于405 nm處測定胞內(nèi)AP活性。酶活計算單位為單個藻細胞含有的AP 1 h降解pNPP所產(chǎn)生對硝基苯酚(p-nitrophenol, pNP)的fmol數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗測定結(jié)果均表示為平均值±標準方差(=3)。采用三因子方差分析DOP(ATP、G-6-P、SG-P和G-P)、溫度(20、23、26、29℃)和取樣時間對藻細胞密度、TDP、DIP濃度和AP活性的影響, 如果交互作用因子<0.05, 則使用單因素重復(fù)方差分析來確定差異性。重復(fù)測量方差分析時, 如果重復(fù)性方差分析的方差-協(xié)方差矩陣的球形假設(shè)被違反, 則對自由度(df)進行Greenhouse-Geisser校正。所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 17.0軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 中肋骨條藻生長特征比較

中肋骨條藻在不同溫度與DOP組中表現(xiàn)出不同的生長特征(圖1; 表2)。在ATP組中, 藻細胞在4 d后快速生長, 最大藻細胞密度與平均生長率出現(xiàn)在29℃條件下 (圖1a; 表2); SG-P和G-6-P組的藻細胞生長變化趨勢相似, 5 d后快速生長, 最高藻細胞密度與平均生長率均出現(xiàn)在26℃條件下(圖1b, c; 表2)。相比之下, G-P組的藻細胞密度維持在較低水平, 沒有出現(xiàn)顯著生長, 生長速率明顯低于其它組, 29℃條件下的生長略高于其他溫度條件(圖1d; 表2)。NaH2PO4組隨著溫度的升高細胞密度顯著上升, 29℃生長最好(圖1e)。以上結(jié)果可以看出, 含有C-O-P鍵的磷酸酯(ATP, SG-P和G-6-P )表現(xiàn)出與NaH2PO4組相似的生長趨勢, 較高的溫度條件可以顯著促進中肋骨條藻的生長; 而含有C-P鍵的膦酸酯(G-P)對中肋骨條藻生長的影響不顯著。

圖1 不同溫度和DOP條件下中肋骨條藻的生長特征

表2 中肋骨條藻在各組中的最高生物量(×104 cell/ mL)及平均生長速率(d–1)

三因子方差分析表明, 溫度與DOP類型均對中肋骨條藻生長有顯著影響, 并且兩者之間存在顯著的交互效應(yīng)(表3)。單因素重復(fù)性方差分析發(fā)現(xiàn), 在相同的DOP類型下, 溫度對藻細胞生長均有顯著影響(<0.01); 在相同的溫度下, SG-P和G-6-P組之間的生長差異不顯著外(>0.05), 其余各DOP組之間均具有顯著差異(<0.01)。

2.2 培養(yǎng)液中磷酸鹽的變化特征

培養(yǎng)液中TDP與DIP的濃度變化在不同DOP組中顯著不同(圖2)。ATP組的培養(yǎng)液中, TDP在實驗過程中迅速下降, 29℃下降最為顯著(圖2a); 培養(yǎng)液中DIP濃度在實驗前5 d顯著上升, 隨后下降至實驗結(jié)束(圖2b)。SG-P和G-6-P組培養(yǎng)液中的TDP均在29℃條件下下降最為顯著(圖2c, e); 兩組培養(yǎng)液中DIP濃度變化相似, 均在實驗后期有少量DIP產(chǎn)生(<10 μmol/mL)(圖2d, f)。相比之下, G-P組培養(yǎng)液中TDP濃度到實驗結(jié)束時均呈現(xiàn)上升趨勢(圖2g); 整個實驗過程均難以檢測到DIP(圖2h)。三因子方差分析發(fā)現(xiàn), 溫度和DOP類型對TDP與DIP濃度均有顯著影響(表3), 且DOP類型對TDP和DIP濃度的影響較溫度更為顯著。在相同溫度條件下, G-P組的TDP濃度與其他各DOP組之間差異顯著(<0.01); ATP組的DIP濃度與其他各DOP組之間差異顯著(<0.01)。

表3 三因子方差分析DOP類型、溫度和取樣時間對細胞密度、TDP和DIP濃度以及AP活性的影響

注:表示這些因素或其相互作用的顯著性,<0.05時表示差異顯著.

2.3 細胞堿性磷酸酶活性變化特征

不同溫度條件與DOP組中, 中肋骨條藻胞內(nèi)AP活性表現(xiàn)出顯著不同的變化特征(圖3)。AP 活性在ATP組中不活躍(<10 fmol pNP/(cell·h)), 僅在26℃條件下培養(yǎng)的第6, 7 d出現(xiàn)峰值(圖3a); SG-P和G-6-P組中, AP活性的變化特征相似(圖3b, c), 培養(yǎng)期間變化不顯著。各溫度條件下G-P組的AP活性均顯著升高, 其中酶活最高值出現(xiàn)在20℃第5 d(83 fmol pNP/ (cell·h))(圖3d)。三因子方差分析結(jié)果表明, 溫度和DOP類型均對AP活性有顯著影響(表3)。相同溫度條件下, G-P組AP活性與其他各DOP組之間均存在顯著差異(<0.01); 此外G-P組AP活性在26℃與29℃條件下差異不顯著(>0.05), 其余各溫度條件下的AP活性均有顯著差異(<0.01)。

3 討論

DOP是富營養(yǎng)海岸水域存在的重要磷源之一, 其中, 磷酸酯類DOP可以占到總DOP類型的75%左右[26-28]。目前已有多種磷酯化合物被鑒定出來, 其中,核酸、游離核苷酸(如ATP)、甘油磷酸脂(如SG-P)、糖類衍生物(如SG-P)等是其主要組成成分[29-30]。ATP、G-6-P、SG-P都屬于小分子磷酸酯, 含有C-O-P鍵, 易于被降解, 因此常被用來作為研究浮游植物對海水DOP利用的代表性對象。已有研究表明東海原甲藻()[31-32]、球形棕囊藻()[33]、具槽帕拉藻()[34]、塔瑪亞歷山大藻()[35]等可利用ATP、G-6-P、SG-P等DOP化合物維持生長。膦酸酯約占海洋中DOP的25%[30], 廣泛分布于許多海洋生命形式中。近年來由于G-P的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致其在沿海海域中積累, 成為水體膦酸鹽的重要組成部分[36]。G-P屬于小分子膦酸鹽, 含有化學(xué)穩(wěn)定的C-P鍵, 從能量上講, 它比水解C-O-P鍵更困難, 因此, 只有少數(shù)細菌和海洋浮游植物被報道可以利用G-P作為磷營養(yǎng)源, 例如小定鞭藻()[37]、銅綠微囊藻()[38]以及絲狀藍細菌魚腥藻(sp.)[39]等。不同浮游植物對不同DOP的利用能力不同[35], 且易受環(huán)境因子影響。

圖2 不同溫度和DOP條件下培養(yǎng)液中TDP和DIP濃度變化特征

圖3 不同溫度和DOP條件下中肋骨條藻AP酶活性變化特征

本研究發(fā)現(xiàn)中肋骨條藻可以在ATP、G-6-P和SG-P條件下快速生長, 而在G-P條件下, 中肋骨條藻的生長顯著低于其他DOP組。這表明中肋骨條藻對不同結(jié)構(gòu)類型DOP的利用能力不同, 更易利用磷酸酯。在相同DOP處理條件下, 中肋骨條藻的生長響應(yīng)了較高的溫度條件, 這與Tian等[40]報道中肋骨條藻在較高溫度下分裂更快, 更易引起赤潮的結(jié)果一致。通過監(jiān)測藻細胞生長過程中培養(yǎng)液里TDP、DIP的變化, 進一步了解中肋骨條藻對不同DOP的利用過程。實驗發(fā)現(xiàn), 在ATP、G-6-P和SG-P培養(yǎng)液中TDP濃度迅速下降, 表明中肋骨條藻可以有效利用磷酸酯ATP、G-6-P和SG-P維持自身生長, 在較高溫度培養(yǎng)液中的TDP消耗更為顯著。G-P組培養(yǎng)液中TDP濃度沒有下降反而略有升高, 表明中肋骨條藻不能直接利用G-P, 培養(yǎng)液中TDP濃度升高可能是由于部分細胞死亡后, 細胞破裂導(dǎo)致含磷內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)液中。有研究報道表明, DOP的吸收利用是通過被酶水解成DIP的途徑來進行的[11, 41], 但也有研究發(fā)現(xiàn)一些小分子DOP可以被藻類直接吸收利用, 例如, 米氏凱倫藻()可以直接吸收利用G-6-P[42]。本研究發(fā)現(xiàn)ATP組培養(yǎng)液中有大量DIP, 而SG-P和G-6-P組中僅有少量DIP, 表明中肋骨條藻對ATP與SG-P和G-6-P的利用途徑可能不同。溫度對ATP組DIP濃度變化有顯著影響(<0.01), 培養(yǎng)液中DIP濃度隨溫度的升高顯著增多, 表明溫度升高可能加速ATP水解產(chǎn)生更多的DIP, 從而促進了中肋骨條藻的生長。

AP被認為是最重要的DOP利用酶, 在DIP缺失的環(huán)境被誘導(dǎo)合成, 通過分解水體中的DOP 為浮游植物提供磷源[10, 25]。本研究發(fā)現(xiàn), 不同類型DOP條件下的藻細胞內(nèi)AP活性存在較大差異, 其中ATP、SG-P和G-6-P組的AP活性均較低且各組間無顯著差異(>0.05), 而G-P組的AP活性顯著高于ATP、SG-P和G-6-P組的AP活性(<0.01), 表明在含有C-P鍵的DOP條件下中肋骨條藻的AP活性較高。有研究報道, 當環(huán)境中可利用磷匱乏時, 浮游植物會通過合成AP利用細胞內(nèi)儲存的多聚磷酸鹽維持細胞較低水平的生長[31]。因為G-P較難被水解, 中肋骨條藻可能會通過合成較高AP利用胞內(nèi)多聚磷酸鹽, 這可能是本實驗在G-P營養(yǎng)條件下, 中肋骨條藻細胞生長率較低及培養(yǎng)液中TDP沒有降低現(xiàn)象的一種解釋。ATP、SG-P和G-6-P組的AP活性均較低, 可能是小分子磷酸酯較易被水解, 藻細胞保持較低的AP水平就能維持較好生長, 也可能是藻細胞存在其他酶利用DOP維持生長[41, 43]。Healey等[44]研究表明溫度會不同程度上影響浮游植物AP活性。本研究中, 溫度變化對G-P條件下的細胞AP活性有顯著影響, AP活性在20℃和23℃下活性更高。

4 結(jié)論

1) 不同類型DOP會顯著影響中肋骨條藻的生長。與G-P相比, ATP、SG-P和G-6-P能更為有效地被中肋骨條藻生長所利用。

2) 本實驗溫度范圍內(nèi)(20~29℃), 溫度升高能顯著促進中肋骨條藻在ATP、SG-P和G-6-P三種DOP條件下的生長, 但該效應(yīng)可能并不依賴于AP活性。

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Effects of temperature and dissolved organic phosphorus on the growth characteristics of

ZHANG Xiao-hua1, 2, 3, LIU Dong-yan4

(1. Key Laboratory of Coastal Zone Environmental Processes and Ecological Remediation, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Department of pharmacy, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China; 4. State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, East China Normal University, Shanghai 200241, China)

The effects of temperature and dissolved organic phosphorus (DOP) on the growth of phytoplankton were investigated in this study. We selectedas the study species and used adenosine triphosphate (ATP), sodium glycerophosphate (SG-P), glucose 6-phosphate (G-6-P) that contains the C-O-P ester bond, and glyphosate (G-P) that contains the C-P bond as DOP sources to measure cell density, total dissolved phosphorus (TDP), and dissolved inorganic phosphorus (DIP) concentrations in the culture medium and alkaline phosphatase (AP) activity in algal cells under four temperature conditions (i.e., 20℃, 23℃, 26℃, and 29℃). Results showed that ATP, SG-P, and G-6-P with a C-O-P ester bond could maintain the growth of, and warming could promote the growth of algal cells in each group. The maximum cell concentrations in the ATP, SG-P, and G-6-P groups reached 176.7 × 104, 218.8 × 104, and 178 × 104cells/mL, respectively. Warming could also accelerate the decrease of TDP concentration in the ATP, SG-P, and G-6-P groups and the increase of DIP concentration in the ATP group. The AP activity in the algal cells of each group was low at different temperatures (<10 fmol pNP/(cell·h)). Compared with that in G-6-P with C-O-P ester bond, the algal cells in G-P with C-O-P bond were lower under the four temperature conditions with maximum cell concentration of 40.7 × 104cells/mL. However, the AP activity in the algal cells was higher than that in the ATP, SG-P, and G-6-P groups (up to 83 fmol pNP/(cell·h)) and decreased with warming. These results showed that different types of DOPs could significantly affect the growth of, among which ATP, SG-P, and G-6-P could be more effectively used by algal cells. Moreover, warming (20~29℃) was an important environmental factor that promoted the growth of algal cells under ATP, SG-P, and G-6-P conditions but did not depend on the AP activity.

; temperature; growth; dissolved organic phosphorus; dissolved inorganic phosphorus; alkaline phosphatase

Feb. 25, 2020

X173

A

1000-3096(2020)11-0036-09

10.11759/hykx20200225001

2020-02-25;

2020-07-20

國家自然科學(xué)基金項目(41876127); 國家重點研發(fā)計劃項目 (2016YFE0133700, 2016YFA0600904)

[National Natural Science Foundation, No. 41876127; Ministry of Science and Technology, Nos. 2016YFE0133700, 2016YFA0600904]

張小華(1980-), 女, 山東榮成人, 博士研究生, 研究方向為藻類生理學(xué), E-mail: 17062997@qq.com; 劉東艷,通信作者, 研究員, 博士生導(dǎo)師, E-mail: dyliu@sklec.ecnu.edu.cn

(本文編輯: 康亦兼)