何虹霄，周春燕，王 藝，翟世英，耿 放，王金秋

(成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

0 引 言

雞蛋的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，價(jià)格相對(duì)較低，是“性價(jià)比”(營(yíng)養(yǎng)價(jià)格比)最高的食品之一[1].與雞蛋清相比，雞蛋黃中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類和含量更高.雞蛋黃中干物質(zhì)含量約為50%，其干物質(zhì)主要包括65%～70%的脂質(zhì)和約30%的蛋白質(zhì)[2].雞蛋黃脂類因富含磷脂等功能性脂質(zhì)被認(rèn)為具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.按類別，雞蛋黃脂質(zhì)中約含65%甘油酯，28%～30%磷脂，4%～5%膽固醇，以及少量的游離脂肪酸等其他脂質(zhì).在脂肪酸組成方面，雞蛋黃脂質(zhì)水解后的脂肪酸以棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)為主[3].在雞蛋黃的脂質(zhì)類別和脂肪酸組成方面，已有諸多研究報(bào)道.但對(duì)雞蛋黃脂質(zhì)的分子種類，即甘油(或其他配體)和脂肪酸的不同組合，當(dāng)前的研究和報(bào)道相對(duì)較少.

由于脂質(zhì)的分子種類呈現(xiàn)多樣性，這為脂質(zhì)分子的鑒定帶來(lái)了挑戰(zhàn).近年來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中脂質(zhì)分子種類的高通量鑒定，由此，脂質(zhì)組概念被提出并得到快速發(fā)展.當(dāng)前，脂質(zhì)組已廣泛應(yīng)用于食品的研究和檢測(cè)中.例如，朱玲嬌[4]對(duì)禽蛋磷脂的組成及其脂肪酸的分布進(jìn)行了分析研究；李靜[5]不僅對(duì)不同種類的禽蛋及蛋制品中的膽固醇含量進(jìn)行了分析測(cè)定，還對(duì)受精蛋蛋黃中膽固醇含量在孵化期間的變化規(guī)律進(jìn)行了研究.基于液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)的脂質(zhì)組分析流程具有高通量與高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，已被應(yīng)用于畜產(chǎn)食品中脂質(zhì)的分析.例如，Gu等[6]從牦牛、犏牛和黃牛的里脊肉中鑒定到296種脂質(zhì)分子，定量分析顯示磷脂和?；鈮A是3個(gè)品種牛肉中差異較大的脂質(zhì)分子類別.但目前尚無(wú)關(guān)于雞蛋黃整體的脂質(zhì)分子種類鑒定和分析報(bào)道.基于此，本研究運(yùn)用脂質(zhì)組分析技術(shù)對(duì)雞蛋黃樣品中的脂質(zhì)分子種類進(jìn)行鑒定和相對(duì)定量分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)雞蛋黃脂質(zhì)的詳細(xì)了解，為進(jìn)一步優(yōu)化雞蛋貯藏保鮮方案，加工工藝條件，以及開(kāi)發(fā)高附加值蛋制品提供重要參考.

1 材料與方法

1.1 儀 器

Shimadzu CBM-30A型超高效液相色譜儀(上海島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司)，Qtrap-4500型質(zhì)譜儀器(上海SCIEX分析儀器貿(mào)易有限公司)，Agilent 7890B型氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，HH-S6型水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，JA2003型分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司).

1.2 材 料

新鮮雞蛋，由四川圣迪樂(lè)村生態(tài)食品股份有限公司家禽養(yǎng)殖場(chǎng)提供；甲醇、甲酸銨、甲基叔丁基醚、乙腈、氯仿、醋酸、正己烷，均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)默克公司；甲苯、石油醚、濃硫酸，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；溶血磷脂酰膽堿(12∶0，LPC)、神經(jīng)酰胺(d18∶1/4∶0，Cer)、磷脂酰膽堿(13∶0/13∶0，PC)、甘油二酯(12∶0/12∶0，DG)、甘油三酯(17∶0/17∶0/17∶0，TG)，購(gòu)自阿凡提極地脂質(zhì)公司.

1.3 方 法

1.3.1 雞蛋黃樣品的制備

用蛋黃分離器分出雞蛋黃，將收集的雞蛋黃在濾紙上滾動(dòng)以去除吸附在蛋黃膜上的蛋清液和系帶，直到能肉眼看到蛋黃膜表面比較干燥為止.用牙簽刺破蛋黃膜，然后用燒杯收集流出的蛋黃液.共收集15 枚雞蛋的蛋黃液，磁力攪拌充分混勻.用移液器吸取蛋黃液并分裝至50 mL離心管中，立即用液氮迅速冷凍，然后放入冰箱(-80 ℃)進(jìn)行超低溫保存，用于后續(xù)檢測(cè)分析.

1.3.2 脂質(zhì)組分析前處理

樣品從-80 ℃冰箱中取出，在液氮下手動(dòng)研磨至粉末狀，稱取50 mg置2 mL離心管中，并向離心管中加入1 mL脂質(zhì)提取液(甲基叔丁基醚和甲醇混合物，3∶1，V/V)，并放入鋼珠，用球磨機(jī)將樣品勻漿.取出鋼珠，加入500 μL水，渦旋混勻1 min，然后在12 000 ×g、4℃下離心10 min.吸取上層清液500 μL于1.5 mL離心管中，真空濃縮器揮干溶劑至恒重，用100 μL含有0.04%乙酸的乙腈溶液復(fù)溶.

1.3.3 液相分離

色譜柱為T(mén)hermo C30，2.1 mm×100 mm(內(nèi)徑×柱長(zhǎng))，填料粒徑2.6 μm.流動(dòng)相A為乙腈∶水混合溶液，體積比為60∶40(含0.04%乙酸與5 mmol/L甲酸銨)；流動(dòng)相B為乙腈∶異丙醇混合溶液，體積比為10∶90(含0.04%乙酸與5 mmol/L甲酸銨).進(jìn)樣量為2 μL.梯度洗脫程序?yàn)椋? min，A∶B=80∶20；3 min，A∶B=50∶50；5 min，A∶B=35∶65；9 min，A∶B=25∶75；15.5 min，A∶B=10∶90.流速為0.35 mL/min，柱溫45 ℃.

1.3.4 質(zhì)譜分析

電噴霧離子源溫度為550 ℃；質(zhì)譜電壓為5 500 V(正極)或-4 500 V(負(fù)極)；簾氣壓力241.3 kPa；碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為中；在三重四極桿中，每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測(cè).

1.3.5 脂質(zhì)分子的定性

基于靶向標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫(kù)MWDB，根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間、子母離子對(duì)信息(50～1 000 m/z)及二級(jí)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行脂質(zhì)分子的鑒定.

1.3.6 脂質(zhì)分子的相對(duì)定量

基于代謝物的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量分析，通過(guò)三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行分析.脂質(zhì)組分析重復(fù)測(cè)定3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋黃中脂質(zhì)的分子種類

脂肪酸的不同組合可以形成種類豐富的脂質(zhì)分子.大量研究顯示，食品中脂質(zhì)的分子種類可多達(dá)數(shù)百上千種.這些不同結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子具有不同的特性，因此，若要對(duì)食品中的脂質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)地了解，需對(duì)其脂質(zhì)分子種類進(jìn)行鑒定.

脂質(zhì)組分析結(jié)果顯示，共從雞蛋黃樣品中鑒定出787種脂質(zhì)分子.其中，甘油酯及脂肪酸類包括212種TG、55種DG、3種單甘油酯(MG)和37種游離脂肪酸(FFA).磷脂類包括139種PC、122種磷脂酰乙醇胺(PE)、34種LPC、23種溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、14種磷脂酰甘油(PG)、14種磷脂酰絲氨酸(PS)、4種磷脂酸(PA)、4種磷脂酰肌醇(PI)、2種溶血磷脂酰絲氨酸(LPS)、1種溶血磷脂酸(LPA)、1種溶血磷脂酰肌醇(LPI)和1種溶血磷脂酰甘油(LPG)、41種Cer和30種鞘磷脂(SM).其他脂質(zhì)包括36種?；鈮A(CAR)、9種膽固醇脂(CE)、2種輔酶Q(COQ)和3種類花生酸(Eicosanoid).

基于鑒定到的脂質(zhì)分子在質(zhì)譜中的信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)雞蛋黃中鑒定到的787種脂質(zhì)分子進(jìn)行相對(duì)含量分析.結(jié)果顯示，雞蛋黃脂質(zhì)中磷脂的相對(duì)含量最高，為64.5%，其中PE和LPE含量最為豐富.雞蛋黃中甘油酯相對(duì)含量為26.7%，主要為T(mén)G和DG.FFA相對(duì)含量為8.1%，CAR相對(duì)含量為0.31%，其他脂質(zhì)相對(duì)含量較少.

2.2 雞蛋黃中的磷脂

在鑒定到的139種雞蛋黃PC分子中，相對(duì)含量最高的3種PC分子為PC(18∶0/22∶5)、PC(16∶1/22∶2)和PC(22∶4/14∶1)，分別占雞蛋黃總PC的18.1%、13.0%和6.1%(見(jiàn)圖1(A)).在34種LPC分子中，LPC(18∶1/0∶0)占雞蛋黃中所有LPC的61.8%(見(jiàn)圖1(B))，表明LPC類別中，脂質(zhì)分子的相對(duì)含量比較集中.此外，在豐度前十的PC分子和豐度前五的LPC分子中，PC(18∶0/22∶5)、PC(22∶4/14∶1)、PC(18∶1/22∶6)、PC(16∶1/22∶6)、LPC(20∶4/0∶0)和LPC(22∶6/0∶0)均含有二十二碳六烯酸(C22∶6，DHA)、二十二碳五烯酸(C22∶5，DPA)和二十碳四烯酸(C20∶4，ARA)等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，表明雞蛋黃PC和LPC具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.

圖1 雞蛋黃中的主要PC和LPC

雞蛋黃中PE和LPE分子相對(duì)含量亦具有類似特點(diǎn).PE分子的相對(duì)含量相對(duì)分散，前3種PE分子合計(jì)占比為30.9%(見(jiàn)圖2(A))；而LPE分子的相對(duì)含量相對(duì)集中，前3種LPE分子合計(jì)占比達(dá)到85.8%(見(jiàn)圖2(B)).相對(duì)PC和LPC，在豐度靠前的PE和LPE分子中含有DHA和ARA的分子種類較少，僅PE(18∶0/22∶6)、LPE(0∶0/22∶6)和LPE(0∶0/20∶4)3種分子.這在一定程度上表明，雞蛋黃中PE的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可能弱于PC.

圖2 雞蛋黃中的主要PE和LPE

2.3 雞蛋黃中的SM和Cer

SM是鞘氨醇的氨基以酰胺鍵與1分子脂肪酸相連形成的，含有鞘氨醇或二氫鞘氨醇，但不含甘油的磷脂.蛋黃中鑒定到30種SM和41種Cer.其中，SM(d18∶1/22∶0)、1-磷酸神經(jīng)氨酸(d18∶1/16∶0,CerP)和Cer(d18∶1/24∶1)3種分子豐度最高，占雞蛋黃總SM和Cer的15.1%、10.8%和7.8%(見(jiàn)圖3).豐度前10的SM和Cer分子中，不飽和雙鍵的數(shù)量為1～3個(gè)，與PC(不飽和雙鍵的數(shù)量為1～7個(gè))和PE(不飽和雙鍵的數(shù)量為0～6個(gè))相比明顯較少，表明雞蛋黃中SM和Cer分子的飽和度相對(duì)較高.

圖3 雞蛋黃中的主要SM和Cer

2.4 雞蛋黃中的甘油酯

脂肪酸甘油酯根據(jù)甘油骨架上結(jié)合的脂肪酸數(shù)目不同進(jìn)行分類，分為T(mén)G、DG和MG.在雞蛋黃脂質(zhì)中檢測(cè)出212種TG、55種DG和3種MG.雞蛋黃中TG的種類豐富，脂肪酸的雙鍵數(shù)、雙鍵位置，以及不同脂肪酸的組合等形成了TG的多樣性.而雞蛋黃脂質(zhì)中的DG種類相對(duì)較少.

在所鑒定到的甘油酯中，DG(18∶1/18∶1/0∶0)、TG(14∶0/18∶1/20∶1)和TG(16∶0/16∶1/20∶1)的相對(duì)含量最高，分別占蛋黃總甘油酯的15.6%、13.1%和8.2%(見(jiàn)圖4).這3種甘油酯均含有2個(gè)單不飽和脂肪酸(MUFA)，顯示出雞蛋黃甘油酯較高的不飽和度.在相對(duì)含量前10的甘油酯中，TG(18∶1/18∶1/18∶2)的不飽和度最高，其占雞蛋黃總甘油酯的3.5%.

圖4 雞蛋黃中的主要甘油酯

2.5 雞蛋黃中的FFA

在雞蛋黃脂質(zhì)中檢測(cè)出37種FFA.其中，油酸(C18∶1)的占比最高，達(dá)到雞蛋黃總FFA的38.0%(見(jiàn)圖5)，在雞蛋黃FFA中，鑒定到6種鏈長(zhǎng)較短的(C15及以下)脂肪酸，這些脂肪酸在先前基于GC的雞蛋黃總脂肪酸分析中未被鑒定到.這可能是由于檢測(cè)方法不同，脂質(zhì)組分析所采用的LC-MS/MS靈敏度顯著高于雞蛋黃脂肪酸分析所采用的GC.

圖5 雞蛋黃中的主要FFA

雞蛋黃FFA中，飽和脂肪酸(SFA)共12種，占雞蛋黃FFA的19.8%；MUFA共9種，占40.4%；多不飽和脂肪酸(PUFA)共16種，占39.8%.雞蛋黃FFA中PUFA占比顯著高于雞蛋黃總脂肪酸.詳細(xì)地，F(xiàn)FA中ARA(C20∶4)、DHA(C22∶6)和DPA(C22∶5)的相對(duì)占比，均顯著高于已有報(bào)道的雞蛋黃總脂肪酸.這些結(jié)果顯示出雞蛋黃FFA的整體不飽和度更高.

2.6 雞蛋黃中的CAR

本次實(shí)驗(yàn)在雞蛋黃脂質(zhì)中檢測(cè)到36種CAR.其中，油?；鈮A(Oleyl-carnitine)和戊二?；鈮A(Glutaconyl-carnitine)占比最高，兩者合計(jì)約占雞蛋黃總CAR的50%(見(jiàn)圖6).按照鏈長(zhǎng)劃分，雞蛋黃CAR中短鏈CAR有8種(C2～C5)、中鏈CAR有13種(C6～C12)和長(zhǎng)鏈CAR有15種(C13以上).

圖6 雞蛋黃中的主要CAR

2.7 雞蛋黃中的DHA和二十碳五烯酸(EPA)

在雞蛋黃TG和磷脂中鑒定出29種含有DHA的脂質(zhì)分子，13種含有EPA的脂質(zhì)分子.DHA主要以磷脂的形式存在于雞蛋黃中，其中48.7%為PE-DHA，39.0%為PC-DHA和11.2%為L(zhǎng)PE-DHA，而TG-DHA和DG-DHA僅占0.74%.EPA亦具有相似的規(guī)律，79.2%為PC-EPA，20.2%為PE-EPA，0.45%為L(zhǎng)PE-EPA，僅0.15%為T(mén)G-EPA.DHA和EPA的營(yíng)養(yǎng)功效已經(jīng)被深入研究和廣泛認(rèn)可.雞蛋黃中DHA和EPA主要存在于磷脂中，表明雞蛋黃磷脂具有優(yōu)異的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.

3 討 論

3.1 脂質(zhì)組分析的定量準(zhǔn)確性

值得注意的是，不同類型脂質(zhì)在離子化效率與碎裂難易等方面具有顯著的不同，這使得不同脂質(zhì)類別的質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度具有較大差異.例如，檢測(cè)到的雞蛋黃PE含量高于PC，可能的原因是PE和PC分子中sn-3位上的極性頭部基團(tuán)存在差異，導(dǎo)致PE在質(zhì)譜檢測(cè)中離子化效率或信號(hào)響應(yīng)高于PC.因此，基于質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行跨類別的相對(duì)含量計(jì)算和對(duì)比將產(chǎn)生較大誤差.基于此，需針對(duì)每個(gè)脂質(zhì)類別分別開(kāi)展定量分析.

3.2 雞蛋黃脂質(zhì)分子與雞胚發(fā)育

在雞胚發(fā)育過(guò)程中，TG和DG的吸收需要跨越絨毛尿囊膜，在跨膜過(guò)程中，被水解為甘油和FFA.其中，部分FFA參與雞胚發(fā)育的能量供給；另一部分脂肪酸重新與甘油組裝形成甘油酯，進(jìn)而參與細(xì)胞膜的構(gòu)建.在貯藏過(guò)程中，雞蛋黃中少量的TG和DG在雞蛋黃內(nèi)源脂肪酶的作用下被水解，產(chǎn)生FFA，這一過(guò)程被認(rèn)為是雞蛋黃自身抑制脂質(zhì)氧化的一種潛在機(jī)制[7].

雞蛋黃中的FFA在雞胚發(fā)育能量供給方面具有天然優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗麄兛梢愿斓乇晦D(zhuǎn)運(yùn)至雞胚中并直接通過(guò)β-氧化提供能量.因此，雞蛋黃中保持一定含量的FFA，可能是為雞胚發(fā)育的啟動(dòng)做準(zhǔn)備.此外，相對(duì)于TG和磷脂，F(xiàn)FA可以直接與自由基等反應(yīng)，從而為雞胚和雞蛋黃脂質(zhì)提供抗氧化的屏障.這可能是FFA中PUFA占比相對(duì)更高的潛在原因.

CAR是肉堿與脂肪酸結(jié)合形成的一類代謝物，是脂肪酸參與β-氧化的中間物質(zhì).在脂酰輔酶A合成酶的催化下，脂肪酸首先被活化為脂酰輔酶A，長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A需要進(jìn)一步與肉堿形成CAR，以跨越線粒體內(nèi)膜進(jìn)入線粒體基質(zhì)，從而參與β氧化.由此，推測(cè)雞蛋黃中微量的CAR，對(duì)保證雞胚發(fā)育啟動(dòng)時(shí)的快速能量供給具有重要作用.

3.3 雞蛋黃磷脂分子與蛋黃營(yíng)養(yǎng)特性

膳食中高比例的磷脂有利于食物脂質(zhì)在小腸中形成平均粒徑更小的球形膠束[8]，從而影響人體對(duì)脂質(zhì)的消化和吸收.此外，雞蛋黃中含有豐富的SM和Cer.作為重要的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，SM和Cer主要位于細(xì)胞膜、脂蛋白和其他富含脂質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)上，對(duì)維持細(xì)胞膜的完整性，以及脂筏的形成至關(guān)重要.同時(shí)，SM和Cer廣泛參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等重要生理過(guò)程，并在細(xì)胞代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)分化、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、機(jī)體衰老和腫瘤免疫等方面發(fā)揮著重要作用.此外，SM和Cer還是合成一系列重要生理鞘脂的通用前體.因此，膳食SM和Cer具有諸多健康功效作用，不僅參與細(xì)胞膜的形成并維護(hù)其流動(dòng)性，還能防止脂質(zhì)代謝異常、發(fā)揮抗氧化與抗炎作用[9].已有研究表明，膳食SM及其代謝產(chǎn)物可以劑量依賴性地抑制膽固醇、TG和脂肪酸的吸收，并可顯著改善動(dòng)物血漿與肝臟的膽固醇和TG代謝[10].此外，膳食SM有利于腸道微生物群和胃腸道免疫的穩(wěn)態(tài)平衡，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究已證實(shí)牛奶SM具有較好的降血脂作用[11].

4 結(jié) 論

本研究運(yùn)用LC-MS/MS對(duì)雞蛋黃中的脂質(zhì)分子進(jìn)行了鑒定和定量分析，共鑒定到787種脂質(zhì)分子.相對(duì)定量分析顯示，PC(18∶0/22∶5)、LPC(18∶1/0∶0)、PE(P-18∶0/18∶0)、LPE(0∶0/18∶0)、SM(d18∶1/22∶0)、DG(18∶1/18∶1/0∶0)、TG(14∶0/18∶1/20∶1)、油酸(C18∶1)和油?；鈮A(Oleyl-carnitine)分別是各自脂質(zhì)類別中的代表性脂質(zhì)分子.此外，統(tǒng)計(jì)顯示，DHA和EPA等功能活性脂肪酸主要存在于雞蛋黃磷脂中.本研究提供了雞蛋黃脂質(zhì)分子種類的詳細(xì)信息，為進(jìn)一步探究雞蛋黃脂質(zhì)營(yíng)養(yǎng)功能和加工特性等提供了重要信息和研究方向.