羅婷，王佳琪，張春玲，范順明，余凌英

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137)

生姜為姜科植物姜(ZingiberofficinaleRoscoe.)的新鮮根莖[1]，是一種藥食經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物，廣泛應(yīng)用在食品加工和食物烹調(diào)中，可去腥除膩，增加鮮味，提高菜肴風(fēng)味[2]。生姜也是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)藥材[3]，其性溫而味辛，主要用于發(fā)散風(fēng)寒，如風(fēng)寒感冒、頭痛鼻塞等癥狀[4]。生姜的活性成分主要是姜辣素與姜精油[5]，揮發(fā)油是生姜中特殊香味的物質(zhì)基礎(chǔ)，在食物加工過程中能起到增味、去腥、添香、護(hù)色、清口等作用[6]。煨姜是生姜的炮制品，煨姜性味辛溫，生姜經(jīng)煨制后，解表作用減弱，藥物中部分揮發(fā)性及刺激性成分減少，使得藥性緩和，主要用于溫中止嘔、腹痛泄瀉[7]?，F(xiàn)代研究表明，在臨床觀察與護(hù)理中，煨姜湯方劑能防治腫瘤患者化療致消化道不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量[8]。煨姜作為常用藥材具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，其臨床治療和用藥安全與原藥材品質(zhì)密切相關(guān)。因此，結(jié)合現(xiàn)代分析手段完善對煨姜的品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以《中國藥典》(2015年版)項(xiàng)下生姜的技術(shù)要求為指導(dǎo)，對煨姜與生姜做質(zhì)量對比研究，分析煨姜的質(zhì)量指標(biāo)，為中醫(yī)臨床合理使用兩藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

LC-2030C島津高效液相色譜儀 日本島津公司；Sartorius BS110S 十萬分之一分析天平 德國賽多利斯公司；KQ-300E 超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海將任實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SRJX-4-13馬弗爐 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH-S8A電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用分析儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 試劑

6-姜辣素對照品(批號(hào)：CHB160901)：購自四川克洛瑪生物科技有限公司；經(jīng)HPLC 檢測純度達(dá)到98%以上；石油醚(60～90 ℃，批號(hào)：2018040301)：成都市科隆化學(xué)品有限公司；無水硫酸鈉(批號(hào)：080106)：成都金山化學(xué)試劑有限公司；其他液體試劑均為分析純。

1.3 材料

1.3.1 生姜

購于成都市溫江區(qū)永康超市，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為姜科植物姜ZingiberofficinaleRoscoe.的新鮮根莖。

1.3.2 煨姜

課題組在前期工作中利用正交設(shè)計(jì)聯(lián)用響應(yīng)面法對煨姜的最佳工藝條件做了研究。研究結(jié)果表明煨姜的最佳制備工藝為粗草紙層數(shù)3層，煨制溫度113.1 ℃，煨制時(shí)間125.25 min。取同批生姜按照此最佳工藝條件制備煨姜。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜的鑒別

按照2015年版《中國藥典》第一部生姜項(xiàng)下薄層色譜鑒別方法，對生姜與最佳工藝炮制出的煨姜進(jìn)行薄層色譜分析。1號(hào)為6-姜辣素對照品，2號(hào)、3號(hào)為生姜樣品，4號(hào)、5號(hào)為煨姜樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，煨姜與生姜在可見光下均顯示5個(gè)斑點(diǎn)，在6-姜辣素對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)。圖譜斑點(diǎn)清晰，特征明顯，見圖1。

圖1 樣品薄層色譜圖Fig.1 TLC of samples

2.2 總灰分的測定

按照2015年版《中國藥典》第四部通則2302“總灰分測定法”測定煨姜與生姜的總灰分，由測定結(jié)果可知煨姜與生姜的總灰分符合藥典要求，但是同質(zhì)量下煨姜的總灰分高于生姜，見表1。

表1 生姜與煨姜總灰分測定結(jié)果Table 1 Determination results of total ash in fresh ginger and simmered ginger %

2.3 揮發(fā)油測定與氣質(zhì)聯(lián)用分析

2.3.1 總揮發(fā)油的提取

按照2015年版《中國藥典》項(xiàng)下?lián)]發(fā)油測定方法，分別取煨姜與生姜80 g，切成1～2 mm的小塊，加蒸餾水 400 mL，采用水蒸氣蒸餾法提取5 h分離出揮發(fā)油，取少量無水硫酸鈉干燥后得到棕黃色揮發(fā)油。比較煨姜與生姜的總揮發(fā)油含量，結(jié)果表明生姜的總揮發(fā)油含量高于煨姜，見表2。

表2 生姜與煨姜總揮發(fā)油測定結(jié)果 Table 2 Determination results of total volatile oil in fresh ginger and simmered ginger mL/g

2.3.2 氣相色譜條件

進(jìn)樣口溫度：325 ℃；載氣：氦氣，載氣體積流量1 mL/min；柱溫：程序升溫60～325 ℃，初始溫度60 ℃，停留3 min，以5 ℃/min 升溫至130 ℃，再以3 ℃/min升溫至180 ℃，然后以10 ℃/min升溫至280 ℃，溶劑延遲3.0 min；進(jìn)樣量1 μL，分流比80∶1。

2.3.3 質(zhì)譜條件

EI電離方式,離子源溫度:230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；倍增電壓：2024 V；發(fā)射電流：34.6 μA;接口溫度：250 ℃；質(zhì)量掃描范圍：50～500 amu；電子能量：70 eV。

2.3.4 氣相色譜分析結(jié)果

按上述實(shí)驗(yàn)條件對生姜和煨姜的揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行GC-MS分析，采用GC-MS工作站直接提供的自動(dòng)積分和質(zhì)譜相似度匹配的方法，檢索相應(yīng)譜庫庫存，盡可能鑒定所有峰，并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照，結(jié)合人工譜圖解析，確認(rèn)揮發(fā)油中的主要化學(xué)成分，用面積歸一化法測得各成分的相對百分含量[9]。煨姜與生姜的揮發(fā)油離子流見圖1。兩種藥物揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS 分析結(jié)果見表3。

表3 生姜與煨姜揮發(fā)油化學(xué)成分GC-MS 分析結(jié)果Table 3 Analysis result of chemical constituents of volatile oils from simmered ginger and fresh ginger by GC-MS

續(xù) 表

由表3可知，生姜檢測出81個(gè)峰，鑒定出42種化學(xué)成分。煨姜檢測出61個(gè)峰，鑒定出35種化學(xué)成分。從鑒定出的化學(xué)成分分析，煨姜有33種化學(xué)成分與生姜相同，但是其相對百分含量各有差異。煨姜中新增的化學(xué)成分有β-蒎烯與萜品油烯，生姜中的β-水芹烯、4-異丙基環(huán)己-2-烯-1-酮、(-)-4-萜品醇、癸醛、香茅醇、反式-2-癸烯醛、(6E,10E)-7,11,15-Trimethyl-3-methylene-1,6,10,14-hexadecatetraene、1-ethenyl-1-methyl-2,4-bis(1-methylethenyl)-(1S,2S,4R)-這8種化學(xué)成分在煨姜中未檢測出。

2.4 姜酚類成分的測定

根據(jù)TU 光譜，發(fā)現(xiàn)姜中7種主要的姜辣素成分分別為6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚和6-姜二酮[10,11]。2015年版《中國藥典》中以6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚作為生姜的含量測定指標(biāo)，故本實(shí)驗(yàn)基于2015年版《中國藥典》一部收載的生姜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項(xiàng)下的一測多評(píng)方法，比較生姜與煨姜的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚成分。

2.4.1 色譜條件

色譜柱SHIMADZU Shim-pack GIST(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫：0～10 min，45%乙腈；10～15 min，45%→48%乙腈；15～17 min，48%→60%乙腈；17～43 min，60%乙腈；43～45 min，60%→67%乙腈；45～48 min，67%→69%乙腈；DAD檢測器；檢測波長282 nm；柱溫25 ℃；體積流量為0.5 mL/min；進(jìn)樣體積為15 μL。

2.4.2 對照品溶液制備

取6-姜辣素對照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，色譜甲醇溶解并定容至刻度，制成濃度0.0504 mg/mL的對照品溶液。對照品、煨姜與生姜色譜圖見圖2。

圖2 煨姜與生姜揮發(fā)油離子流圖Fig.2 Ion flow diagrams of volatile oils of simmered ginger and fresh ginger

2.4.3 供試品溶液制備

將樣品切成1～2 mm的小塊，取約1 g，精密稱定，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，取出放冷后用甲醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

圖3 對照品溶液及樣品HPLC圖Fig.3 High performance liquid chromatograms of reference solution and samples

注：圖中1表示6-姜辣素，2表示8-姜酚，3表示10-姜酚。

2.4.4 線性關(guān)系考察

取2.4.2項(xiàng)下的對照品溶液，分別配制成質(zhì)量濃度為10.08，20.16，40.32，60.48，80.64，100.8 μg/mL的對照品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=2E+07X-13172(r=0.9991)，表明6-姜辣素在10.08～100.8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.4.2項(xiàng)下對照品溶液15 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄6-姜辣素的峰面積。6-姜辣素峰面積的RSD為0.38%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于 0,2,4,6,12,24 h 進(jìn)樣15 μL，測定并記錄6-姜辣素的峰面積。6-姜辣素峰面積的RSD為1.10%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批煨姜炮制品6 份，精密稱定1 g，按2.4.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣15 μL，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測定并記錄6-姜辣素的峰面積，計(jì)算得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為1.92%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知6-姜辣素含量的同一批樣品6份，精密稱定，分別精密加入適量的6-姜辣素對照品，按2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣15 μL，在2.4.1色譜條件下進(jìn)行測定分析，計(jì)算得到6-姜辣素的平均回收率為96.52%。

2.4.9 姜酚類成分含量

按照上述測定條件，測定姜酚類成分含量，分析結(jié)果可知煨姜的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚成分含量均高于生姜，結(jié)果見表4。

表4 姜酚類成分含量Table 4 Content of gingerol components mg/g

3 討論

由于煨姜炮制過程中減少了辛散性，即揮發(fā)油有所減少。所以在相同質(zhì)量條件下，煨姜水蒸氣蒸餾法提取出來的揮發(fā)油總量低于生姜，且鑒別出的煨姜揮發(fā)油成分少于生姜。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，大部分烯烴類成分在煨姜揮發(fā)油中的相對百分含量高于生姜，例如α-蒎烯(α-pinene)、莰烯(camphene)、α-水芹烯(α-phellandrene)、檜烯(sabenene)、姜黃烯(curcumene)、β-蒎烯(β-pinene)、萜品油烯(terpinolene)。而醛類成分在煨姜揮發(fā)油中的相對百分含量低于生姜，部分醛類甚至在煨姜揮發(fā)油中未鑒別出，例如癸醛(decanal)、香茅醇(citronellal)、反式-2-癸烯醛(trans-2-Decenal)。揮發(fā)油中相對百分含量較高的共有成分是α-蒎烯(α-pinene)、莰烯(camphene)、檜烯(sabenene)、順式-檸檬醛(cis-citral)、檸檬醛(citral)、姜黃烯(curcumene)等成分。鑒別出的主要成分的匹配度均在85%以上，可信度高，具有一定的參考價(jià)值[12,13]。

姜酚類成分受熱易發(fā)生逆羥醛縮合降解(retro-aldol degradation)反應(yīng)，生姜在儲(chǔ)存和炮制的過程中，姜酚類成分因其不穩(wěn)定性而有所減少，所以HPLC法是測定姜酚等辣味成分的理想方法[14-16]。本實(shí)驗(yàn)中生姜炮制過后的煨姜姜酚類成分的含量低于生姜，結(jié)果科學(xué)合理。不同品種的生姜有效物質(zhì)的含量不同，這對生姜制品的進(jìn)一步加工具有指導(dǎo)作用[17]。本文對煨姜與生姜的質(zhì)量進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)分析，在2015年版《中國藥典》的基礎(chǔ)上新增了揮發(fā)油含量測定、HPLC和GC圖譜等研究內(nèi)容。為更好地控制煨姜、生姜飲片質(zhì)量提供了有力的依據(jù)。