王怡 馮麗貞 張清華 陳全助 吳暉

摘要?為了利用iTRAQ技術(shù)研究受桉樹枝癭姬小蜂危害后桉樹葉片的差異蛋白，選擇被姬小蜂危害后第24 h的桉樹葉，采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展研究，在uniprot_Quercus中共鑒定到蛋白質(zhì)1 687個(gè)。按照表達(dá)倍數(shù)變化1.2倍以上（上調(diào)大于1.2倍或者下調(diào)小于0.83倍）且P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)。其中，C_vs_T組的上調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)有110個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)92個(gè)。經(jīng)過KEGG富集分析，篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集于苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、核糖體（ribosome）、單菌素生物合成（monobactam biosynthesis）、有機(jī)含硒化合物代謝（selenocompound metabolism）、丙酮酸鹽代謝（pyruvate metabolism）、脂肪酸延長代謝（fatty acid elongation）、丙酸代謝（propanoate metabolism）7條通路。

關(guān)鍵詞?桉樹枝癭姬小蜂;蛋白質(zhì)組學(xué);iTRAQ

中圖分類號(hào)?S?763.43文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）01-0154-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.046

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Proteomics Analysis of Resistance of Eucalyptus to Leptocybe invasa Based on iTRAQ Technique

WANG Yi， FENG Li?zhen， ZHANG Qing?hua et al

（ForestryCollege， Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou， Fujian 350002）

Abstract?In order to explore serum differential proteins in Eucalyptus leaves after Leptocybe invasa infestation using iTRAQ technology.Eucalyptus leaves of 24 h after being harmed by Leptocybe invasa were selected，and the iTRAQ quantitative proteomics technique was used to study the subject.A total of 1 687 proteins were identified in uniprot_Quercus.The differentially expressed proteins were screened according to the standard of expression fold change of 1.2 times or more （upregulation of more than 1.2 times or down-regulation of less than 0.83 times）and P< 0.05.Among them，there were 110 differentially expressed proteins in the C_vs_T group and 92 differentially expressed proteins.After KEGG enrichment analysis，the differentially expressed proteins were enriched in seven pathways：Phenylpropanoid biosynthesis， Ribosome，Monobactam biosynthesis，Selenocompound metabolism， Pyruvate metabolism， Fatty acid elongation， and Propanoate metabolism.

Key words?Leptocybe invasa Fisher et La Salle;Proteomics;iTRAQ

桉樹（Eucalyptus robusta Smith）是終年常綠植物，為姚金娘桉屬。桉樹有900多個(gè)品種，原產(chǎn)地大多在大洋洲，少數(shù)品種原產(chǎn)于東南亞[1]。桉樹易培育栽種，四季常青，具有藥用、醫(yī)用價(jià)值[2]，生長速度超過了大多數(shù)闊葉林[3]，19世紀(jì)時(shí)被引種到世界各地[4]。桉樹是在1890年由意大利引入，起初我國境內(nèi)種植不多，直到1984年，我國與澳大利亞進(jìn)行桉樹引種與栽培合作，先后從澳大利亞引進(jìn)184個(gè)桉樹樹種，自此我國開始大規(guī)模培育桉樹林[5]。到2017年，我國種植桉樹總面積達(dá)450萬hm2，木材年產(chǎn)量超過3 000萬m3，接近全國木材產(chǎn)量的30%[2]。

桉樹枝癭姬小蜂（Leptocybe invasa）屬膜翅目（Hymenoptera）姬小蜂科（Eulophidae）姬小蜂屬（Leptocybe），是危害桉樹的重要害蟲[6-7]。桉樹枝癭姬小蜂在桉樹的嫩枝、梢頭、嫩芽、葉片、葉柄、葉脈等處產(chǎn)卵[8]，受害桉樹產(chǎn)卵處畸形腫大，有些桉樹無性系在姬小蜂產(chǎn)卵部位會(huì)形成蟲癭[9]。桉樹遭受危害后頂梢生長受阻，枝葉萎縮，樹形逐漸成叢生狀[10]。1年生及以下桉樹林受危害最嚴(yán)重，受害后木材產(chǎn)量大量減少。

長期以來，對(duì)桉樹抗性的研究備受關(guān)注，主要集中在桉樹抗性、被姬小蜂感染后體內(nèi)次生物質(zhì)變化方面，但對(duì)于姬小蜂危害誘導(dǎo)防御蛋白少有研究。

筆者利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)對(duì)姬小蜂危害桉樹酶活最大的階段進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[11]，應(yīng)用生物信息學(xué)分析手段，分析桉樹被危害前后的差異蛋白，揭示桉樹被危害時(shí)桉樹響應(yīng)的相關(guān)代謝途徑，探究姬小蜂誘導(dǎo)桉樹形成蟲癭的機(jī)制，對(duì)姬小蜂進(jìn)行有效的控制以及有利于后續(xù)培育優(yōu)質(zhì)桉樹無性系。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)桉樹抗蟲無性系DH32-29：2017年10月，在漳州長泰巖溪林場(chǎng)，對(duì)桉樹無性系DH32-29上10～15 cm并有2對(duì)綠葉的半木質(zhì)化萌芽條進(jìn)行采穗，同時(shí)將葉片剪去1/2。將土質(zhì)疏松且不含草根等雜質(zhì)的黃心土裝在9 cm×11 cm的無紡布育苗袋中。扦插前將泥袋完全淋濕，然后澆上0.3%的高錳酸鉀溶液進(jìn)行消毒。在扦插前將穗條基部蘸上生根粉，垂直插入育苗袋中，插入深度為2～3 cm，再次淋透泥土，用網(wǎng)紗隔離穗條。把育苗袋置于遮陰處，每天適當(dāng)淋水。30 d生根后則移至光照充足處，同時(shí)去除已死植株，并適當(dāng)增加淋水量。待桉樹苗根莖木質(zhì)化，葉片濃綠，根系發(fā)達(dá)后移出育苗袋，移栽于直徑20 cm的花盆。

試驗(yàn)蟲源：2018年3—4月于桉樹枝癭姬小蜂羽化期，剪去被小蜂危害有較多蟲癭的枝條，枝條斷口處包有濕棉花，把枝條分別放入8個(gè)養(yǎng)蟲籠中，每日保持基部濕潤，用昆蟲采集管采集每日羽化的桉樹枝癭姬小蜂。

樣品采集：試驗(yàn)分為2組，每組桉樹各20盆，一組對(duì)照組未被桉樹枝癭姬小蜂危害，一組試驗(yàn)組已被桉樹枝癭姬小蜂危害，取樣時(shí)間分別為危害后24 h。每次在姬小蜂危害的樣株上戴一次性手套隨機(jī)取葉片，每棵樹取一片葉子，同時(shí)在未受姬小蜂危害的桉樹相同高度與角度上取葉片。把采集的樣品放入密封袋中，排盡袋內(nèi)所有空氣，把密封袋封好，立即在密封袋上貼上標(biāo)簽，再迅速置于液氮中，冷凍3～5 min，取出后轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。試驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)。把6個(gè)樣品標(biāo)記為C1、C2、C3、T1、T2、T3。其中C1、C2、C3為未被姬小蜂危害的桉樹DH-3229葉片樣本，T1、T2、T3為已被被姬小蜂危害的桉樹DH-3229葉片樣本。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?樣品制備。

采用TCA/丙酮沉淀+SDT裂解法提取蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行樣品蛋白定量[11]。定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，各樣品取蛋白質(zhì)20 μg分別加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，進(jìn)行12.5%SDS-PAGE電泳[12]（恒流14 mA，90 min），考馬斯亮藍(lán)染色。用FASP的方法進(jìn)行酶解[13]。各樣品分別取100 μg肽段，按照AB SCIEX公司iTRAQ標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記。

1.2.2?LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集。

標(biāo)記后，將每組的肽段混合，并使用AKTA Purifier 100進(jìn)行分級(jí)[14]。每份分級(jí)樣品采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱以95%的A液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100，100 μm×2 cm，nanoViper C18），經(jīng)過分析柱（Thermo scientific EASY column，10 cm，ID 75 μm，3 μm，C18-A2）分離，流速為300 nL/min[15]。

將樣品進(jìn)行色譜分離，并使用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測(cè)方式為正離子，母離子掃描范圍300～1 800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70，000 at 200 m/z，AGC（Automatic gain control）target為1e6，Maximum IT為50 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間（Dynamic exclusion）為60.0 s[16]。按下述方法采集多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比：每次全掃描（full scan）后采集20個(gè)碎片圖譜（MS2 scan），MS2 Activation Type為HCD，Isolation window為2 m/z，二級(jí)質(zhì)譜分辨率17，500 at 200 m/z，Normalized Collision Energy為30 eV，Underfill為0.1%。

1.2.3?KEGG通路注釋。

利用KAAS （KEGG Automatic Annotation Server）軟件，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行KEGG通路注釋。

2?結(jié)果與分析

2.1?蛋白質(zhì)檢測(cè)

由表1可知，蛋白濃度均超過5 μg/μL，蛋白總量均超過1 500 μg。由圖1可知，圖譜條帶清晰，大小集中在18.4～66.2 kD，說明樣品蛋白提取良好，樣品的濃度以及總量已達(dá)到進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的要求[17]。

2.2?差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選

以倍數(shù)變化大于1.2倍（上調(diào)大于1.2倍或者下調(diào)小于0.83倍）且Pvalue小于0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)[18]。各比較組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目：所有差異表達(dá)蛋白質(zhì)為202個(gè)，上調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)為110個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)為92個(gè)。

2.3?差異蛋白的KEGG代謝途徑富集分析

對(duì)被桉樹枝癭姬小蜂危害后的桉樹葉差異蛋白pathway進(jìn)行分析[14]，由表2可知，危害后202個(gè)差異蛋白富集在161條通路中，其中顯著富集的通路為7條（顯著富集為P小于0.05），包括苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、核糖體（ribosome）、單菌素生物合成（monobactam biosynthesis）、有機(jī)含硒化合物代謝（selenocompound metabolism）、丙酮酸鹽代謝（pyruvate metabolism）、脂肪酸延長代謝（fatty acid elongation）、丙酸代謝（propanoate metabolism）這7條通路。圖2中縱坐標(biāo)表示顯著富集的KEGG通路;橫坐標(biāo)表示每條KEGG通路中包含的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目;條形圖顏色表示富集KEGG通路的顯著性即基于Fisher精確檢驗(yàn)（Fishers Exact Test）計(jì)算P值，顏色梯度代表P值的大小，顏色由橘色至紅色漸變，越接近紅色代表P值越小，對(duì)應(yīng)KEGG通路富集度的顯著性水平越高;條形圖上方標(biāo)簽顯示富集因子（richFator<=1），富集因子表示參與某KEGG通路的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目占所有鑒定的蛋白質(zhì)中參與該條通路的蛋白質(zhì)數(shù)目的比例[19-20]。

3?結(jié)論與討論

該試驗(yàn)共檢測(cè)到蛋白質(zhì)1 687個(gè)，與對(duì)照組相比桉樹枝癭姬小蜂危害脅迫下的桉樹葉中有202個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白為110個(gè)，下調(diào)蛋白為92個(gè)。

對(duì)差異蛋白pathway進(jìn)行分析，結(jié)果顯示差異蛋白顯著富集于7條通路，包括苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、核糖體（ribosome）、單菌素生物合成（monobactam biosynthesis）、有機(jī)含硒化合物代謝（selenocompound metabolism）、丙酮酸鹽代謝（pyruvate metabolism）、脂肪酸延長代謝（fatty acid elongation）、丙酸代謝（propanoate metabolism）這7條通路。其中最富集的通路為苯丙烷生物合成這條通路。

植物響應(yīng)蟲害誘導(dǎo)植物抗蟲性的過程均極為復(fù)雜，筆者以桉樹抗蟲無性系DH32-29為材料，研究了桉樹枝癭姬小蜂危害脅迫下桉樹葉片的差異蛋白質(zhì)，但目前尚不能確定這些差異蛋白在寄主抗蟲防御過程中的作用，還需進(jìn)一步的基因功能分析。在今后的研究中，將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法對(duì)桉

樹在桉樹枝癭姬小蜂危害脅迫下的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，對(duì)桉樹枝癭姬小蜂危害脅迫下桉樹的應(yīng)答過程進(jìn)行系統(tǒng)研究。該試驗(yàn)僅研究了桉樹被危害后桉樹葉片的蛋白差異表達(dá)，還不清楚姬小蜂危害桉樹產(chǎn)生蟲癭動(dòng)態(tài)過程中蛋白表達(dá)，今后可以繼續(xù)在這方面進(jìn)行研究，以期更全面、深入地揭示桉樹抗姬小蜂機(jī)制。

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