李軍玲 閆雙勇 張融雪 王曉靜 孫玥 蘇京平 孫林靜

摘要?植物β-半乳糖苷酶是一類糖苷水解酶，能夠從β-D-半乳聚糖或寡聚糖支鏈非還原末端切除β-D-半乳糖殘基。β-半乳糖苷酶廣泛分布于各種植物中，通過對(duì)細(xì)胞壁的重塑參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程?？偨Y(jié)了植物β-半乳糖苷酶生化與分子生物學(xué)方面的最新研究進(jìn)展，并就其結(jié)構(gòu)域及催化機(jī)制、生化特性、亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式、生理功能等方面展開詳述。

關(guān)鍵詞?β-半乳糖苷酶;基因家族;生理功能;亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)?Q?946.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）01-0015-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.004

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Research Progress on Plant β?Galactosidase

LI Jun?ling，YAN Shuang?yong，ZHANG Rong?xue et al

（Tianjin Crop Research Institute， Tianjin Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding， Tianjin 300384）

Abstract?Plant β?galactosidase is a kind of glycoside hydrolase， which can remove terminal β?D?galactose residues from the non?reducing end of β?D?galactan or the branched side chain of oligosaccharide. It is widely distributed in various plants and participates in plant growth and development through remodeling cell walls. In this paper， the latest advances in biochemical and molecular biology of plant β?galactosidase were summarized. The structure domain， catalytic mechanism， biochemical characteristics， subcellular localization and expression patterns， physiological functions and so on were described in detail.

Key words?β?galactosidase;Gene family;Physiological function;Subcellular localization

β-半乳糖苷酶（β-galactosidases，BGALs）（EC3.2.1.23）是一類糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs），能夠從β-D-半乳聚糖或寡聚糖支鏈非還原末端切除β-D-半乳糖殘基，廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中。GH1、GH2、GH3、GH35、GH42、GH50和GH59水解酶家族中都發(fā)現(xiàn)了具有BGALs水解酶活性的成員，其中所有的植物源BGALs屬于GH35家族[1]。

BGALs在生物體內(nèi)起著重要作用。例如，人類GH35家族的GLB1基因參與消除溶酶體中神經(jīng)節(jié)苷脂末端半乳糖殘基，GLB1缺失導(dǎo)致毒性神經(jīng)節(jié)苷脂積累進(jìn)而引起神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥[2];人類GH59家族的GALC基因參與消除半乳糖神經(jīng)酰胺半乳糖殘基，基因缺陷后將導(dǎo)致Krabbe疾病[3];分子生物學(xué)中常用的大腸桿菌LacZ基因編碼GH2家族BGAL，是細(xì)菌在葡萄糖饑餓條件下乳糖代謝所必需的[4]。植物源BGALs屬于多基因家族，是一類與細(xì)胞壁多糖代謝相關(guān)的酶，從各種植物中分離得到的BGALs表明其參與多種生理過程，如種子萌發(fā)、花粉發(fā)育、果實(shí)成熟等。極少部分植物BGALs基因已被克隆并進(jìn)行了功能鑒定，如擬南芥AtBGAL6和AtBGAL10基因失活分別導(dǎo)致種子黏液釋放減少和莢果萼片變短[5-6];番茄TBG4的下調(diào)導(dǎo)致果實(shí)硬度增加等[7];但絕大多數(shù)植物BGALs在發(fā)育中的生理功能尚未明確。筆者總結(jié)了目前植物BGALs在細(xì)胞與分子生物學(xué)方面的最新研究進(jìn)展，并就結(jié)構(gòu)域及催化機(jī)制、生化特性、亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式、生理功能等方面展開詳述，同時(shí)，從水稻中克隆了OsBGAL1和OsBGAL6這2個(gè)基因，并分別構(gòu)建了其過表達(dá)和基因敲除轉(zhuǎn)基因株系，為后續(xù)生理功能研究提供了生物材料。

1?植物BGALs家族、結(jié)構(gòu)域及其催化機(jī)制

所有的植物BGALs基因都屬于GH35家族，是多基因家族，不同植物含有不同數(shù)目BGALs基因。擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組含有17個(gè)BGALs基因[8];番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）基因組含中有17個(gè)BGALs基因[9];水稻（Oryza sativa）基因組含中有15個(gè)BGALs基因[10];其他植物如日本梨（Pyrus pyrifolia）[11]、油菜（Brassica campestris ssp.chinensis）[12]、桃（Prunus persica（L.）Batsch）[13]、亞麻（Linum usitatissimum）[14]、蘋果（Malus pumila）[15]中分別含有8、16、17、43、13個(gè)BGALs基因成員。

已發(fā)現(xiàn)的植物BGALs蛋白含有的結(jié)構(gòu)域類型包含N-信號(hào)肽、GH35保守序列、GH2N、BetaGal4_5、PRP_N、Gal-凝集素等。所有GH35家族的BGALs都含有GH35保守活性序列G-G-P-[LIVM]（2）-x（2）-Q-x-E-N-E-[FY];Gal-凝集素和N-信號(hào)肽在BGALs序列中可單獨(dú)存在，也可同時(shí)存在或不存在;其他如GH2N、BetaGal4_5、PRP_N等結(jié)構(gòu)域只存在于少數(shù)特殊的BGALs中。

BGALs催化反應(yīng)遵循Koshland保持機(jī)制，從β-異頭碳構(gòu)象端釋放半乳糖。在CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中，GH35家族屬于GH-A分支，折疊成含有2個(gè)谷氨酸殘基的（α/β）8跨膜桶狀結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)谷氨酸殘基作為質(zhì)子供體，另一谷氨酸殘基作為催化反應(yīng)的親核基團(tuán)，攻擊底物異頭碳形成的糖基-酶復(fù)合物[16]。植物中β-D連接的半乳糖殘基可見于糖脂（如monogalactosyldiacyl -glycerol，MGDG）[17]、蛋白多糖（如arabinogalactan proteins，AGPs）[18]和細(xì)胞壁多糖[如木葡聚糖（xyloglucans）和鼠李半乳糖醛酸聚糖I（rhamnogalacturonan I，RGI）][19]等。

2?植物BGALs生化特性

自1994年以來，研究人員陸續(xù)從擬南芥、番茄、草莓、甜椒、蘋果、蘿卜、水稻、芒果、香蕉、櫻桃、楊桃、柿子、鷹嘴豆、豌豆、蕓豆等植物中分離得到多種活性BGALs，如表1所示。BGALs的pH適應(yīng)范圍較廣，霉菌屬來源的BGALs最適pH為2.5～5.4，酵母和細(xì)菌來源的BGALs最適pH為6.0～7.0[20]，而已發(fā)現(xiàn)的植物BGALs最適pH為2.8～5.0，溫度為37～67 ℃。植物BGALs可催化水解β-（1，2）-、β-（1，3）-、β-（1，4）-、β-（1，6）-等多種類型糖苷鍵[21]，其底物涉及半乳聚糖（galactan）、阿拉伯半乳聚糖（arabino-galactans）、阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins，AGPs）、木葡聚糖（xyloglucans）、半乳糖脂（galactolipids）和糖蛋白（glycoproteins）等多種細(xì)胞壁組分。

3?植物BGALs亞細(xì)胞定位及表達(dá)

擬南芥BGALs已有研究的基因全部定位于細(xì)胞壁。Gantulga等[22]利用免疫金標(biāo)記方法證明AtBGAL1和AtBGAL12蛋白定位于木質(zhì)部細(xì)胞壁;Dean等[5]構(gòu)建AtBGAL6的GFP融合蛋白并在煙草中瞬時(shí)表達(dá)，表明AtBGAL6定位于細(xì)胞壁;Gantulga等[23]利用點(diǎn)雜交的方法發(fā)現(xiàn)擬南芥細(xì)胞壁組分中存在AtBGAL2和AtBGAL5;Wei等[24]利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法同樣在擬南芥細(xì)胞壁檢測(cè)到AtBGAL8。蘋果Mdβ-Gal1、Mdβ-Gal2、Mdβ-Gal5基因的GFP融合表達(dá)載體在洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果證明3個(gè)基因全部定位于細(xì)胞壁[15]。這些BGALs的亞細(xì)胞壁定位結(jié)果表明其在細(xì)胞壁重塑中有重要作用。

擬南芥BGALs基因在不同組織器官中呈現(xiàn)差異化表達(dá)，AtBGAL17主要在莖稈表達(dá)，AtBGAL7、AtBGAL11、AtBGAL13主要在花器官中表達(dá)，AtBGAL12、AtBGAL14、AtBGAL16則在檢測(cè)的組織中很少表達(dá)，其余AtBGALs成員則在多個(gè)組織中均有表達(dá)[9]。同樣地，在水稻、亞麻等其他植物BGALs基因家族成員的表達(dá)都是有組織差異性和特異性。這說明BGALs廣泛參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育過程。

4?植物BGALs的生理功能

植物細(xì)胞壁參與了許多重要生理過程，如維持控制細(xì)胞生長(zhǎng)、物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞、防御反應(yīng)、細(xì)胞黏附及其他應(yīng)激反應(yīng)等[42-43]。植物BGALs的作用底物包含多種細(xì)胞壁組分，表明BGALs是通過對(duì)細(xì)胞壁的重塑而參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的。目前已明確生理功能的BGALs基因匯總見表2，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①參與果實(shí)成熟軟化過程。果實(shí)成熟軟化過程與細(xì)胞壁成分變化息息相關(guān)，主要是果膠多糖結(jié)構(gòu)的改變，如在甲酯酶、果膠裂解酶、半乳糖醛酸酶和BGALs作用下果膠多糖結(jié)構(gòu)改變，從而促進(jìn)果實(shí)軟化成熟;如表2中TBG4、TBG6、FaβGal4、DkGAL1、PpBGAL10、PpBGAL16等基因都與果實(shí)軟化相關(guān)。②參與花器官的發(fā)育。如將矮牽?；ㄖ械?個(gè)BGALs基因同時(shí)敲除后，其花瓣中果膠半乳聚糖含量增加，但花瓣的強(qiáng)度降低[44];AtBGAL10突變體表現(xiàn)出萼片及果莢變短。③參與種子萌發(fā)、胚根伸長(zhǎng)等其他生長(zhǎng)發(fā)育過程。如擬南芥bgal1/bgal3雙突變體花莖和下胚軸變短。

48卷1期李軍玲等?植物β-半乳糖苷酶研究進(jìn)展

5?植物BGALs的應(yīng)用

微生物源BGALs是一種重要的食用生物催化劑，被廣泛應(yīng)用于乳品行業(yè)中的乳糖水解，這些BGALs具有熱穩(wěn)定性或低溫活性。低溫（如4 ℃）BGALs應(yīng)用于食品工業(yè)從熱敏感乳制品中去除乳糖污染[48];高溫（如70 ℃）條件下有最佳水解活性的BGALs，被用于工業(yè)生產(chǎn)無乳糖奶[49]。除了水解酶活性，某些微生物BGALs具有轉(zhuǎn)糖苷活性，可將半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至乳糖形成一種人類益生元膳食β-低聚半乳糖（β-galacto-oligo-saccharides，GOS）[50]，BGALs轉(zhuǎn)糖苷研究逐漸成為近年來功能性低聚糖開發(fā)和技術(shù)應(yīng)用的新熱點(diǎn)。

BGALs雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化，但其應(yīng)用仍受到熱穩(wěn)定、產(chǎn)物抑制、轉(zhuǎn)糖苷活性低等問題的限制，植物BGALs具有數(shù)量多、低成本、易獲得、污染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)勢(shì)，可作為新的酶源，開發(fā)出具有特殊催化功能的BGALs，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。如從豌豆中分離得到的PsBGAL具有高乳糖親和性、高水解效率，并被進(jìn)一步開發(fā)成固定酶類Sephadex-PsBGAL和Chitosan-PsBGAl[51];鷹嘴豆CpGAL也同樣可開發(fā)成為固定化酶[52]。

6?植物BGALs未來研究方向

關(guān)于植物BGALs的生物學(xué)和生化作用研究方興未艾，主要有以下幾個(gè)主要問題有待解決：首先，除了GH35保守序列和信號(hào)肽，BGALs中其他結(jié)構(gòu)域的功能是什么？如前人研究表明一個(gè)水稻BGAL1（LOC_Os03g06940）的凝集素結(jié)構(gòu)域有凝集素活性，可能與BGALs底物特異性識(shí)別有關(guān)[53]。目前“結(jié)構(gòu)-功能”關(guān)系的分子調(diào)控研究滯后，如何將已有的酶學(xué)數(shù)據(jù)與分子結(jié)構(gòu)和功能信息結(jié)合，深入研究催化機(jī)理和調(diào)控機(jī)制是BGALs研究領(lǐng)域的探索方向之一。第二是BGALs時(shí)空表達(dá)問題。作為一個(gè)大的基因家族，要明確每個(gè)BGAL的生化功能首先需要對(duì)BGAL進(jìn)行純化，而某些BGALs難以純化;而且可能存在功能冗余，導(dǎo)致明確其生理功能存在一定難度，如擬南芥AtBGAL1、AtBGAL2、AtBGAL3、AtBGAL4、AtBGAL5、AtBGAL12這6個(gè)基因單基因敲除后，其突變體沒有明顯的表型變化[54]，但bgal1/bgal3雙突變體則表現(xiàn)出花序莖和下胚軸變短等。第三，BGALs的天然底物是什么，釋放的β-半乳糖去向哪里？半乳聚糖、糖脂和蛋白多糖中都存在β-D-半乳糖殘基，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜且是動(dòng)態(tài)變化的，那么植物各種生理過程中BGALs的具體底物會(huì)差異顯著。而BGALs水解釋放的半乳糖殘基可能有3種去向：①作為能量來源;②作為底物用于構(gòu)建新的糖綴合物;③作為信號(hào)分子啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在植物中，糖分子如葡萄糖和蔗糖既可作為能源，也可作為信號(hào)分子。葡萄糖在細(xì)胞凋亡和器官發(fā)育過程中起著重要作用[55];蔗糖可作為信號(hào)分子調(diào)控果聚糖和花青素的生物合成[56]。那么乳糖能否作為信號(hào)分子將是一個(gè)新的研究方向。

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