譚葉林 杜全能 朱文娟 胡丹 肖思遠 徐茜 陳佳佳 蘭時樂

摘要?為了獲得能降解木質(zhì)素的細菌，采用愈創(chuàng)木酚法和BR亮藍平板法從枯枝落葉自然堆積物中分離漆酶活力較高的菌株，通過形態(tài)學觀察、生理生化試驗，16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建對菌株進行鑒定。以蘆葦秸稈粉為主要原料，采用單因素試驗和正交試驗研究并優(yōu)化了菌株適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。結果表明，菌株H-1鑒定為蠟狀芽孢桿菌H-1（Bacillus cereus H-1）;適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件為蘆葦粉100%，（NH4）2SO4 2.5%，酵母抽提粉0.3%，KH2PO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.5%，CaCl2 0.1%，發(fā)酵溫度35 ℃，固水比1.0∶1.1（g∶mL），初始pH 7.2～7.4，接種量3%，裝量50 g，發(fā)酵時間144 h。在此條件下，漆酶活力達0.992 U/g。

關鍵詞?蘆葦秸稈;蠟狀芽孢桿菌;漆酶;固體發(fā)酵

中圖分類號?S-3?文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）01-0001-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening and Identification of Laccase?producing Bacteria and Study on Solid?state Fermentation Conditions

TAN Ye?lin，DU Quan?neng，ZHU Wen?juan et al

（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128）

Abstract?In order to obtain lignin?degrading bacteria， the strains with high laccase activity were isolated from natural litter by guaiacol and BR brilliant blue plate method which were identified by morphological observation， physiological and biochemical experiments， 16S rRNA sequence analysis and phylogenetic tree construction. The suitable fermentation medium and fermentation conditions of the strain were optimized by single factor and orthogonal experiments with reed straw powder as the main raw material. The results showed that strain H?1 was identified as Bacillus cereus H-1. The suitable fermentation medium and conditions were as follows： reed powder 100%， （NH4）2SO4 2.5%， yeast extract powder 0.3%， KH2PO4 0.15%， MgSO4·7H2O 0.15%， NaCl 0.5%， CaCl2 0.1%， fermentation temperature 35 ℃， solid?water ratio 1.0∶1.1（g∶mL）， initial pH 7.2-7.4， inoculation volume 3%， loading capacity 50 g， fermentation time 144 h. Under those conditions， laccase activity reached 0.992 U/g.

Key words?Reed straw;Bacillus cereus;Laccase;Solid?state fermentation

木質(zhì)素主要存在于木材和各種秸稈中，全世界每年產(chǎn)量約1 500億t，它是一種取之不盡，用之不竭的綠色再生資源[1]。其結構復雜，主要是由5-羥基松柏醇、對香豆醇、芥子醇和松柏醇等組成的酚類聚合物[2]。由于木質(zhì)素與半纖維素、纖維素之間相互混雜和交聯(lián)，且將纖維素包埋其中[3-5]，導致纖維素難以被降解或降解效率低。木質(zhì)素的降解方法主要包括物理法[6-7]、化學法[6，8]、物理化學法[9-10]和微生物法[11-12]。其中微生物法以其反應條件溫和、設備要求和成本低以及對環(huán)境友好等優(yōu)點受到國內(nèi)外許多科研工作者的高度重視。胡笑峰等[13]以堿木質(zhì)素為唯一碳源從落葉覆蓋的土壤中分離1株能夠?qū)⒛举|(zhì)素樣品裂解成細小碎片的細菌Erwinia sp.QL-G3;張鵬飛等[14]從高溫期堆肥中篩選到1株木質(zhì)素降解率為28.47%的嗜熱嗜脂肪芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）;Chen等[15]在竹腐蝕滑塊的流體中培養(yǎng)叢毛單胞菌B-9，發(fā)現(xiàn)該菌能在木質(zhì)素衍生物中生長;李紅亞等[16]分離篩選到1株玉米秸稈木質(zhì)素降解率可達24%的淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。該研究擬從枯枝落葉自然堆積物中分離能高效降解木質(zhì)素的菌株，采用形態(tài)學觀察、生理生化試驗和16S rRNA序列分析對菌株進行鑒定，并研究菌株適宜的漆酶產(chǎn)生條件，以期為高效利用蘆葦纖維素生產(chǎn)生物乙醇提供科學依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?土樣采集。

菌種分離樣品采自長沙市森林植物園枯枝落葉堆積且腐爛嚴重的土樣，用無菌自封袋帶回實驗室立即進行菌種分離。

1.1.2?主要儀器與設備。

MJ-160C細菌培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;SS-325高溫高壓滅菌鍋（TOMY.KOGYO.CO，LTD）;SW-CJ-1B（U）單人單面超凈工作臺（蘇州設備凈化有限公司）;QYC 2112恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）;722型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.1.3?主要試劑。

牛肉膏、可溶性淀粉、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、FeSO4、CaCO3、FeCl3、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、D-甘露糖（AR，國藥集團化學試劑有限公司），KH2PO4（AR，西隴化工股份有限公司），酵母抽提粉（BR，國藥集團化學試劑有限公司），蛋白胨（BR，上海勝思生化科技有限公司）等。

1.1.4?培養(yǎng)基。

1.1.4.1?斜面培養(yǎng)基。牛肉膏0.300%，蛋白胨1.000%，NaCl 0.500%，瓊脂粉2.000%，pH 7.2～7.5。

1.1.4.2?初篩培養(yǎng)基。蛋白胨0.500%，酵母抽提粉1.000%，葡萄糖2.000%，愈創(chuàng)木酚2.500 g/L，NaCl 0.500%，瓊脂粉2.000%，pH 7.2～7.5。

1.1.4.3?RB亮藍培養(yǎng)基。胰蛋白胨1.000%，酵母抽提粉0.500%，NaCl 0.500%，RB亮藍0.003%，瓊脂粉2.000%，pH 7.2～7.5。

1.1.4.4?復篩培養(yǎng)基。木質(zhì)素1.000%，葡萄糖0.200%，（NH4）2SO4 0.500%，酵母抽提粉0.500%，KH2PO4 0.200%，MgSO4·7H2O 0.100%，MnSO4·4H2O 0.002%，CaCl2 0.010%，pH 7.2～7.5。

1.1.4.5

液體種子培養(yǎng)。葡萄糖2.000%，蛋白胨1.000%，酵母抽提粉0.500%，KH2PO4 0.200%，MgSO4·7H2O 0.100%，NaCl 0.500%，pH 7.2～7.5。

1.1.4.6

基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基。蘆葦粉100%，（NH4）2SO4 2.000%，酵母抽提粉0.500%，KH2PO4 0.200%，MgSO4·7H2O 0.100%，NaCl 0.500%，CaCl2 0.100%，固∶水=1∶1（g∶mL），pH 7.2。

1.1.4.7?生理生化試驗培養(yǎng)基。參照文獻[17]提供的培養(yǎng)基配制。

1.2?方法

1.2.1?木質(zhì)素分解菌的篩選。

將樣品按照10倍稀釋法稀釋至10-3～10-6，吸取稀釋液0.1 mL于初篩固體培養(yǎng)基平板中央，置于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出菌落。選擇變成粉紅色變色圈的單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上并編號，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，備用。

1.2.2?漆酶產(chǎn)生菌的篩選。

將分離保存的菌種分別接種于RB亮藍固體培養(yǎng)基平板中央，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，選擇培養(yǎng)基褪色圈大的菌落進行復篩。

1.2.3?漆酶產(chǎn)生菌復篩。

1.2.3.1

液體菌種培養(yǎng)。

將分離且在亮藍培養(yǎng)基上褪色快的菌種分別接種于液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.3.2?菌種復篩。

按2%（V/W）的接種量接入基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，測定漆酶酶活。

1.2.4?菌種鑒定。

1.2.4.1?菌落和菌體形態(tài)特征觀察。將菌株H-1接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，觀察菌落和菌體形態(tài)特征。

1.2.4.2

生理生化特征鑒定。對菌株H-1進行需氧型、糖發(fā)酵、VP、吲哚、淀粉水解、硝酸鹽還原等生理生化試驗鑒定。

1.2.4.3?16S rRNA序列測定。

按SK8255試劑盒提取16S rRNA并測序分析，采用通用引物F27（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′）和R1492（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）對菌株H-1的16S rRNA進行PCR擴增，PCR擴增體系參照文獻[18]提供的方法進行。測序結果利用NCBI提供的BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進行比對，利用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5?培養(yǎng)。

1.2.5.1?斜面培養(yǎng)。將保存于冰箱的斜面種子接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)至成熟，備用。

1.2.5.2?液體種子培養(yǎng)。將培養(yǎng)的斜面菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.5.3?發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)。在300 mL三角瓶中裝入50 g基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接入2%（V/W）的液體種子，37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d，期間每24 h搖勻1次。

1.2.6?產(chǎn)酶條件研究。

分別改變培養(yǎng)基中碳源種類，（NH4）2SO4、酵母抽提粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O添加量以及固水比、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、裝量和發(fā)酵時間等，研究其對漆酶酶活的影響。

1.2.7?發(fā)酵條件優(yōu)化。

在單因素試驗結果基礎上，選擇對漆酶活力影響較大的因素培養(yǎng)溫度、固水比、裝量和發(fā)酵時間進行4因素3水平正交試驗，因素水平設計見表1。

1.2.8?酶活測定。

參照文獻[19]提供的方法進行。

2?結果與分析

2.1?菌種初篩

采用選擇性培養(yǎng)基從所取樣品中分離到能在初篩培養(yǎng)基上變成粉紅色變色圈且菌落形態(tài)特征不同的細菌15株，分別編號為A1、A1-1、A1-2、A2、B1、B3、B3-1、B3-3、B2-1、H1、H-1、H2、H2-1、W1、W2。

2.2?RB亮藍培養(yǎng)基篩選

將分離到的15株細菌分別接種于RB亮藍培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，測量脫色圈直徑，其中脫色圈直徑大于40 mm的菌株有A1、H-1，脫色圈直徑為20～40 mm的有A1-1、B1、B2-1、H2-1、W1和W2，其余7株細菌的脫色圈直徑均小于20 mm（表2）。

2.3?菌種復篩

選取脫色圈直徑大于20 mm的菌株進行復篩，測定固體發(fā)酵培養(yǎng)基中漆酶活力。從表3復篩結果可以看出，菌株H-1的漆酶活力最高，達0.42 U/g。選用菌株H-1進行后續(xù)研究。

48卷1期?譚葉林等?產(chǎn)漆酶細菌篩選鑒定及固體發(fā)酵條件研究

2.4?菌種鑒定

2.4.1?形態(tài)觀察結果。

菌落為圓形或近似圓形、灰白色，不透明，表面較粗糙，菌落大，扁平，不規(guī)則，產(chǎn)芽孢。

2.4.2?生理生化試驗結果。試驗結果見表4。

2.4.3?菌株H-1 16S rRNA序列分析。

2.4.3.1?PCR擴增結果。

對菌株H-1的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。從圖1可以看出，在1 500 bp左右條帶較亮，且無其他雜帶，說明PCR擴增得到了目的片段。

2.4.3.2?菌株H-1系統(tǒng)發(fā)育分析結果。

在GenBank中用BLAST軟件將測定的序列進行同源性比對，根據(jù)圖2比對結果可得知，菌株H-1與Bacillus cereus（登錄號MG228369.1）具有100%相似性。根據(jù)形態(tài)學觀察結果，生理生化試驗結果和16S rRNA序列分析，將菌株H-1鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.5?產(chǎn)酶條件研究

2.5.1?碳源種類對漆酶活力的影響。

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和可溶性淀粉，其他條件不變，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d，測定漆酶酶活。由圖3可知，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加外源碳源后，漆酶活力分別較對照降低23.91%、41.30%、32.61%、73.91%、63.04%，說明在發(fā)酵培養(yǎng)基中不需要添加外源碳源。

2.5.2?（NH4）2SO4添加量對漆酶活力的影響。

分別在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的（NH4）2SO4，其他成分不變，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d，測定漆酶酶活。由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著（NH4）2SO4添加量的增加，漆酶活力隨之增加。當（NH4）2SO4添加量為2.5%時，漆酶活力最高，為0.48U/g，但繼續(xù)增加（NH4）2SO4，酶活力下降。因此，選擇（NH4）2SO4添加量為2.5%進行后續(xù)試驗。

2.5.3?酵母提取粉添加量對漆酶活力的影響。

在上述試驗結果的基礎上，于基礎產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%的酵母抽提粉，其他成分不變，于37 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，測定漆酶酶活。由圖5可知，當酵母提取粉添加量為0.3%時，漆酶活力最大，達0.52 U/g，但隨著酵母提取物添加量的增大，漆酶活力下降。原因為增加氮源含量，改變了培養(yǎng)基的碳氮比，從而導致菌體大量生長而影響微生物代謝。

2.5.4?KH2PO4添加量對漆酶活力的影響。

在上述試驗結果的基礎上，改變基礎產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中KH2PO4添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%），其他成分不變，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d，測定漆酶酶活。磷是微生物生長和代謝過程中不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，是組成核酸和磷脂的成分，也存在于高能磷酸化合物及一些酶的活性基團中，同時還有利于糖代謝，但培養(yǎng)基中磷過量，則會抑制產(chǎn)物的合成。從圖6可以看出，隨著KH2PO4添加量的增加，漆酶活力增加，當KH2PO4添加量為0.15%時，漆酶活力最大，達0.57 U/g。但繼續(xù)增加KH2PO4添加量，漆酶活力顯著下降。因此，選擇KH2PO4添加量為0.15%進行后續(xù)試驗。

2.5.5?MgSO4·7H2O添加量對漆酶活力的影響。

在上述試驗結果的基礎上，在基礎產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的MgSO4·7H2O，其他成分不變，于37 ℃恒溫條件培養(yǎng)5 d，測定漆酶酶活。鎂是細胞中己糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶、羧化酶等的激活劑，可以影響基質(zhì)的氧化和蛋白質(zhì)合成。由圖7可知，MgSO4·7H2O添加量對漆酶活力的變化趨勢與KH2PO4添加量的變化趨勢一致，同樣是隨著MgSO4·7H2O添加量的增加，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當MgSO4·7H2O添加量為0.15%時，漆酶活力最大，為0.61 U/g。因此，選擇MgSO4·7H2O添加量為0.15%進行后續(xù)試驗。

2.5.6?培養(yǎng)溫度對漆酶活力的影響。

在上述試驗結果的基礎上，分別將培養(yǎng)基置于30、32、35、37和40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，其他條件不變，測定漆酶酶活。從圖8可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，培養(yǎng)物料中漆酶活力也提高。當培養(yǎng)溫度為37 ℃時，培養(yǎng)料中漆酶活力最高，達0.733 U/g，但提高培養(yǎng)溫度，漆酶活力下降。溫度是影響細胞中生物大分子物理狀態(tài)的原因之一，低溫可導致細胞膜凝固，使得物質(zhì)運送困難;高溫則可使細胞中蛋白質(zhì)和酶的變性和失活。因此，選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃進行后續(xù)試驗。

2.5.7?固水比對漆酶活力的影響。

用自來水分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的固水比為1.0∶0.8、1.0∶0.9、1.0∶1.0、1.0∶1.1和1.0∶1.2，其他條件不變，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d，測定漆酶酶活。從圖9可以看出，培養(yǎng)基的含水量對漆酶活力有很大影響。隨著含水量的增加，漆酶活力增加，當培養(yǎng)基中的固水比為1.0∶1.1時，酶活達0.783 U/g，但當培養(yǎng)基中的固水比超過1.0∶1.1時，漆酶活力下降。培養(yǎng)基中含水量過多，造成培養(yǎng)基為厭氧環(huán)境，阻礙了菌株生長以及漆酶的合成和分泌，從而導致漆酶活力下降。因此，選擇固水比為1.0∶1.1進行后續(xù)試驗。

2.5.8?初始pH對漆酶活力的影響。

在上述試驗結果的基礎上，用稀酸或稀堿分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6，其他條件不變，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)5 d，測定漆酶活力。pH可以影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的離子化強度，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性以及影響代謝反應中各種酶活性等。由圖10可知，培養(yǎng)基初始pH在7.2～7.4，漆酶活力差異不顯著，分別為0.776和0.783 U/g，但初始pH高于或低于此范圍，漆酶活力均下降。

2.5.9?接種量對漆酶活力的影響。

在上述試驗結果的基礎上，分別接入1%、2%、3%、4%和5%的液體種子，恒溫培養(yǎng)5 d，其他條件不變，測定漆酶活力。從圖11可以看出，在一定范圍內(nèi)，漆酶活力隨接種量的增大而增大，當接種量為3%時，漆酶活力為0.835 U/g。但接種量超過3%，表現(xiàn)為明顯的下降。原因是當接種量過小，延滯期長;而當接種量過大，前期培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗過大，同時從種子液中帶入的副產(chǎn)物也過多，均影響菌體生長和漆酶合成分泌。

2.5.10?裝量對漆酶活力的影響。

在上述試驗結果的基礎上，分別在300 mL三角瓶中裝入30、40、50、60、70 g固體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)5 d，其他條件不變，測定漆酶活力。從圖12可以看出，當裝量為50 g時，漆酶活力最大，為0.826 U/g，裝量增加，漆酶活力降低。主要原因為裝量少，培養(yǎng)過程培養(yǎng)基中的水分容易蒸發(fā)，裝量過多，影響培養(yǎng)基中氧氣的流通，從而影響微生物的生長和代謝。因此，選擇裝量為50 g進行后續(xù)試驗。

2.5.11?發(fā)酵時間對漆酶活力的影響。

在上述試驗結果的基礎上，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后開始第1次取樣，以后每隔24 h取樣1次，直至168 h終止培養(yǎng)，分別考察不同發(fā)酵時間對菌株H-1產(chǎn)漆酶活力的影響。由圖13可知，發(fā)酵時間對漆酶活力影響較大，隨著發(fā)酵時間延長，漆酶活力增加。當發(fā)酵時間為144 h時，漆酶活力最大，為0.976 U/g，但發(fā)酵時間延長，漆酶活力下降。因此，選擇適宜的發(fā)酵時間為144 h。

2.6?發(fā)酵條件優(yōu)化結果

發(fā)酵條件優(yōu)化結果見表5。由極差分析可知，固體發(fā)酵對漆酶活力的影響因素主次為發(fā)酵溫度、固水比、發(fā)酵時間、裝量，即發(fā)酵溫度影響最大，固水比次之，裝量影響最小。由表5可知，最優(yōu)組合為A2B2C2D2，而在試驗組合中漆酶活力最高的組合為A1B2C2D2。對A2B2C2D2和A1B2C2D2這2個組合進行5次驗證試驗。

由上述結果可知，適宜的組合為A1B2C2D2，即發(fā)酵溫度35 ℃，固水比1.0∶1.1，裝量50 g，發(fā)酵時間144 h。在此條件下，漆酶活力為0.992 U/g（表6）。

3?結論

3.1?菌種分離與鑒定

采用選擇性培養(yǎng)基和稀釋平板涂布法從長沙森林公園枯枝落葉堆積物中分離到15株具有漆酶活性的細菌，通過復篩，篩選到1株漆酶活性較高的菌株H-1。采用形態(tài)學觀察、生理生化試驗和16S rRNA序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹構建，將菌株H-1鑒定為蠟狀芽孢桿菌H-1（Bacillus cereus H-1）。

3.2?蠟狀芽孢桿菌H-1產(chǎn)漆酶的發(fā)酵條件

以蘆葦粉為主要原材料，采用單因素試驗法研究了培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件對漆酶活力的影響，在單因素試驗結果的基礎上，采用正交試驗法對影響漆酶活力較大的因素進行優(yōu)化。適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件為蘆葦粉100%，（NH4）2SO4 2.5%，酵母抽提粉0.3%，KH2PO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.5%，CaCl2 0.1%，發(fā)酵溫度35 ℃，固水比1.0∶1.1，初始pH 7.2～7.4，接種量3%，裝量50 g，發(fā)酵時間144 h。在此條件下，漆酶活力為0.992 U/g。

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