甘泉 宋豐順 滕斌 林翠香 倪大虎

摘要?[目的]研究基因型對粳稻花藥培養(yǎng)效率的影響。[方法]利用水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)，對16個農(nóng)藝性狀優(yōu)良的粳稻品種進行了花藥離體培養(yǎng)。根據(jù)其愈傷誘導(dǎo)率和綠苗分化率，篩選花藥培養(yǎng)力強的優(yōu)良粳稻品系。[結(jié)果]17y155適用為花藥培養(yǎng)F1代的親本，在水稻花藥培養(yǎng)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力。[結(jié)論]該研究對水稻花藥培養(yǎng)高效體系的建立以及創(chuàng)制優(yōu)良水稻新品系具有重要意義。

關(guān)鍵詞?粳稻;花藥培養(yǎng);培養(yǎng)力;基因型

中圖分類號?S?511.2+2文獻標(biāo)識碼?A文章編號?0517-6611（2020）01-0039-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.011

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Different Genotypes on Anther Culture Efficiency of Japonica Rice

GAN Quan， SONG Feng?shun， TENG Bin et al

（Rice Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230001）

Abstract?[Objective] To research the effects of different genotypes on anther culture efficiency of Japonica rice. [Method]Cultivation technology of anther culture was adopted to carry out the in vitro cultivation of 16 Japonica rice varieties with good agronomic characters. The high?quality Japonica rice varieties with strong anther culture ability were screened according to the callus induction rate and green plantlet differentiation rate. [Result] 17y155 was suitable to be used as the parent material of anther culture F1 generation， which has great application potential in the field of anther cultivation. [Conclusion] This research is of great importance to the establishment of anther cultivation efficient system and new high?quality rice lines.

Key words?Japonica rice;Anther culture;Culture ability;Genotype

隨著現(xiàn)代生物和農(nóng)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，水稻花藥培養(yǎng)作為植物細(xì)胞工程的主體技術(shù)之一，已經(jīng)在水稻遺傳育種上取得了突破性的進展[1]。自20世紀(jì)70年代以來，我國水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)與傳統(tǒng)育種、轉(zhuǎn)基因、化學(xué)物理誘變等相結(jié)合，成為水稻育種領(lǐng)域一個卓越有效的技術(shù)手段[2]。水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)在縮短育種周期、提高育種選擇效率、混倍體用于植物細(xì)胞遺傳等基礎(chǔ)性研究、獲得具有雙親優(yōu)勢特性的可育遠(yuǎn)緣雜種、提供豐富的染色體變異材料等方面具有的巨大優(yōu)勢[3-5]。

影響水稻花藥培養(yǎng)效率的因素有很多，包括基因型、培養(yǎng)基成分、碳源、激素、接種時期、培養(yǎng)環(huán)境等，其中基因型是影響水稻花藥培養(yǎng)力的最重要因素[6-7]。不同基因型植株的花藥對培養(yǎng)力的反應(yīng)不同，表現(xiàn)在愈傷組織誘導(dǎo)率、分化率、再生植株綠化率等。沈錦驊等[8]比對分析了各種類型的水稻材料，發(fā)現(xiàn)花藥培養(yǎng)力由強至弱依次為糯稻、粳稻、秈粳雜交稻、秈稻，且不同材料之間差異很大。何濤[9]研究表明，愈傷組織的誘導(dǎo)和綠苗分化之間相關(guān)性顯著，均由多基因控制的數(shù)量性狀。分別將控制花藥培養(yǎng)力和綠苗分化率的基因定位于1號染色體和10號染色體上。何平等[10]對110個DH（雙單倍體）系進行花藥培養(yǎng)力的QTL（數(shù)量性狀位點）分析，得到了5個與愈傷組織誘導(dǎo)有關(guān)的QTL，分別位于6、7、8、10、12號染色體上;以及2個與綠苗分化有關(guān)的QTL，分別位于1、9號染色體上。苗立新等[11]研究發(fā)現(xiàn)，水稻雜種F1的愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率介于雙親之間且偏向母本;如果父本和母本的花藥培養(yǎng)力均較強，F(xiàn)1代的培養(yǎng)力也會較強。由此可見，篩選出花藥培養(yǎng)力強且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻品系對水稻育種效率的提高具有十分重要的意義。鑒于此，筆者利用水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)，對16個農(nóng)藝性狀優(yōu)良的粳稻品種進行了花藥離體培養(yǎng)，根據(jù)其愈傷誘導(dǎo)率和綠苗分化率的不同，篩選出了花藥培養(yǎng)力強的優(yōu)良粳稻品系，對水稻花藥培養(yǎng)高效體系的建立以及創(chuàng)制優(yōu)良水稻新品系具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

粳稻雜交F1代材料均采自于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所試驗田。16種粳稻組合包括稻花香/17y153、越光早熟/17y153、越光早熟/17y154、17y155/松5123、17y155/龍粳46、17y155/松粳22、17y155/龍粳16、17y155/綏化18、17y155/稻花香、17y155/東農(nóng)425、17y155/龍澤6號、17y155/越光早熟、17y156/稻花香、17y156/越光早熟、越光早熟/17y191、稻花香/17y191。

1.2?田間取材與低溫處理

不同時期花藥的誘導(dǎo)率有顯著的差異。長期實踐發(fā)現(xiàn)，最佳的取穗時間為08：00—10：00，此時細(xì)胞處于旺盛分裂期。研究表明，處于單核靠邊期的花粉形成愈傷組織的能力最強。田間取穗可根據(jù)器官形態(tài)指標(biāo)判斷花粉發(fā)育時期，具體表現(xiàn)為：穗包大而不破，劍葉葉枕距下葉葉枕一般為5～7 cm;潁殼顏色呈淺綠色，大小接近成熟的潁殼，硬度適中;花絲加花藥長度小于潁殼的1/2、大于1/3。采穗時保留2片葉子，盡量減少水分的散失。剝?nèi)〉挠姿胗?5%乙醇棉球擦拭消毒后，再用濕潤的紗布包好，裝入塑料袋并扎緊把口，以防止水分蒸發(fā)。隨后將待接種幼穗放進8 ℃低溫中處理10 d[12-13]。

1.3?花藥接種

將幼穗以枝梗為單位分開，每15～20支為1束，浸入0.1%升汞中滅菌10 min，隨后在超凈工作臺上用無菌水沖洗5次，并去除上部過嫩的穗及下部過老的穗。用鑷子取出消毒好的幼穗，左手的食指和大拇指持小穗基梗，右手拿預(yù)先消毒好的剪刀剪掉1/2潁殼（不傷及花藥），取出花藥置于含有2，4-D（二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）的N6培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基接種50～60枚花藥。隨后對接種后的花藥進行黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26～28 ℃，相對濕度為78%～80%[12，14-15]。

1.4?分化培養(yǎng)

當(dāng)花藥在N6培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)20～40 d后，花藥會由淡黃色變成褐色，花藥裂開并長出小水泡狀物質(zhì)，當(dāng)愈傷組織直徑發(fā)育至1～2 mm時為最佳的轉(zhuǎn)育時期，此時將愈傷組織轉(zhuǎn)移至附加IAA（吲哚乙酸）、KT（激動素）的MS培養(yǎng)基中進行分化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，相對濕度為60%，2 000 lx光照培養(yǎng)12 h/d[12，16]。

1.5?壯苗培養(yǎng)

分化培養(yǎng)10 d左右，愈傷組織會出現(xiàn)綠色斑點并逐漸長成綠芽、生根，長成綠苗，當(dāng)高度至2～3 cm時，可利用附加IAA的懷特培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25 ℃，相對濕度為60%，2 000 lx光照培養(yǎng)12 h/d。當(dāng)綠苗長至3～4片葉且出現(xiàn)白根時，向培養(yǎng)基表面加少量的無菌水，煉苗3～4 d，隨后移栽進行土培[12，17]。

1.6?數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

出愈率=愈傷組織塊數(shù)/接種花藥數(shù)×100%

綠苗分化率=分化綠苗愈傷組織塊數(shù)/轉(zhuǎn)移愈傷組織塊數(shù)×100%

綠苗產(chǎn)率=出愈率×綠苗分化率×100%[18]

2?結(jié)果與分析

2.1?水稻花藥培養(yǎng)情況

在培養(yǎng)初期，花粉沿著孢子體發(fā)育途徑，經(jīng)多細(xì)胞花粉形成愈傷組織，此時愈傷組織在花藥內(nèi)，為一團分生細(xì)胞組織，代謝旺盛且活力強（圖1A）。隨著愈傷組織的生長，早期出現(xiàn)的管狀分子形成維管組織，隨后逐漸形成厚角、厚壁等機械組織，成片集中分布，形成肉眼可見的愈傷組織（圖1B）。當(dāng)愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基后，經(jīng)過一段時間便開始根、芽原基的分化。水稻花粉愈傷組織分化根與芽的基礎(chǔ)是分生組織。表層分生組織某處活動形成芽原基，散生分生組織活動形成根原基，由根、芽基進一步發(fā)展成根芽（圖1C、D）。

2.2?不同水稻品系花藥培養(yǎng)力的比較

不同水稻品系的花藥培養(yǎng)力有顯著的差異。該研究結(jié)果顯示，粳稻組合17y155/龍澤6號組合表現(xiàn)出了較高的出愈率（24.76%）和綠苗分化率（25.07%）。同時，17y155/龍粳16、17y155/稻花香、17y155/松粳22、17y155/龍粳46都有較好的花藥培養(yǎng)力（表1）。由此可見，17y155適用為花藥培養(yǎng)F1代的親本，在水稻花藥培養(yǎng)領(lǐng)域有著很大的應(yīng)用潛力。

3?結(jié)論與討論

基因型在水稻花藥培養(yǎng)中起到了至關(guān)重要的作用。提高水稻的花藥培養(yǎng)力，最根本的辦法是通過雜交等遺傳改良手段，把高培養(yǎng)力基因?qū)氲絻?yōu)良親本或雜種中，通過改變基因型來提高材料的花藥離體培養(yǎng)能力。目前常用的方法就是在已有的優(yōu)良農(nóng)藝性狀的水稻品系中，篩選出有較高培養(yǎng)力的材料進行花藥培養(yǎng)。該研究發(fā)現(xiàn)，17y155是適合進行水稻花藥培養(yǎng)的優(yōu)良品系。在后續(xù)的研究中，應(yīng)不斷地發(fā)掘新的高培養(yǎng)力的水稻花培材料，從而更好地發(fā)揮花藥培養(yǎng)在育種中的優(yōu)勢。

基因型雖然是影響水稻花藥培養(yǎng)力的關(guān)鍵因素，但培養(yǎng)條件同樣重要。培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中最重要的基質(zhì)和支撐培養(yǎng)物，選擇合適的培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生成功與否起著決定性作用。在水稻花藥培養(yǎng)中，N6培養(yǎng)基對粳稻材料培養(yǎng)效果較好;合5培養(yǎng)基對秈稻具有特殊的培養(yǎng)效果[19-20]。愈傷組織誘導(dǎo)形成后，一般采用MS基本培養(yǎng)基;綠苗形成后，通常采用懷特培養(yǎng)基對再生植物進行壯苗[21]。雖然培養(yǎng)基種類繁多，但由于組織培養(yǎng)對基因型的依賴性，目前還沒有一種花藥培養(yǎng)基被普遍使用。

激素是植物在某特定部位形成的微量物質(zhì)，不但對誘導(dǎo)植物花粉粒細(xì)胞分裂、生長及分化起到十分重要的作用，而且對植物組織培養(yǎng)成功與否也起到關(guān)鍵作用[22]。植物激素一般包括生長素和細(xì)胞分裂素2大類，包括2，4-D、IAA、KT等。這兩類物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分，其組成和配比不但可以影響花粉粒誘導(dǎo)形成愈傷組織，而且對愈傷組織形成來源也起到重要調(diào)控作用[23]。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)，添加各種附加物對許多植物細(xì)胞和花藥組織培養(yǎng)有提高愈傷組織誘導(dǎo)率和再生植株的作用，其中常見的附件物有脯氨酸、活性肽、水解絡(luò)蛋白、丙氨酸、馬鈴薯提取液、椰子汁等，它們對提高水稻培養(yǎng)力也有較明顯的促進作用[24-26]。

花藥培養(yǎng)技術(shù)是目前創(chuàng)造純合基因型和培養(yǎng)豐富變異材料的最有效手段，篩選培養(yǎng)力強的優(yōu)良水稻品系、加強花藥培養(yǎng)中關(guān)鍵技術(shù)和遺傳機理的研究、使花藥培養(yǎng)與基因工程技術(shù)相結(jié)合、減輕對基因型的依賴性將為水稻花藥培養(yǎng)的應(yīng)用開創(chuàng)新局面。

48卷1期甘 泉等?基因型對粳稻花藥培養(yǎng)效率的影響

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