宋旭紅 李隆云 崔廣林 丁剛

摘要：【目的】分析不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性，為深入理解植物—微生物互作和挖掘可培養(yǎng)細(xì)菌資源，建立功能細(xì)菌資源庫提供理論支持?！痉椒ā坎捎肐llumina MiSeq高通量測序技術(shù)，對1～3年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序。使用QIIME軟件統(tǒng)計(jì)不同樣本的群落豐富度（Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)）及多樣性（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)），運(yùn)用R軟件計(jì)算各樣本共有OTU數(shù)量，并通過Venn圖呈現(xiàn)各樣本共有和獨(dú)有OTU數(shù)量。同時(shí)，借用熱圖和LEfSe進(jìn)行不同樣本間的差異顯著單元分析，共同闡述不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌種群的多樣性變化規(guī)律。【結(jié)果】不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性存在一定差異。隨著生長年限的增加，桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌的豐富度及群落多樣性持續(xù)降低，桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌特有的OTU數(shù)量持續(xù)減少。1～2年生樣本的優(yōu)勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），3年生桔梗根部以變形菌門、厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門和棲熱鏈球菌門（Deinococcus-Thermus）為優(yōu)勢菌群。變形菌門的相對豐度在3個(gè)樣本中最高，分別為76.35%、82.38%和86.46%。1年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中變形菌門的相對豐度顯著低于2年生和3年生樣本（P<0.05），2年生與3年生桔梗樣本間差異不顯著（P>0.05）。芽孢桿菌屬（Bacillus）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）及Dyella的相對豐度在1年生桔梗中最高，假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度在3年生桔梗樣本中最高。【結(jié)論】桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的多樣性，不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)不同，隨著生長年限的增加，桔梗內(nèi)生細(xì)菌的特有OTU、豐富度和群落多樣性持續(xù)降低。生長年限是造成桔梗內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性變化的因素之一。芽孢桿菌屬、慢生根瘤菌屬、假單孢菌屬及Dyella可作為可培養(yǎng)細(xì)菌資源進(jìn)行深入研究。

關(guān)鍵詞： 桔梗;內(nèi)生細(xì)菌;Illumina MiSeq高通量測序;群落組成;多樣性變化

中圖分類號： S182? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2358-09

Population structure analysis of endophytic bacteria in roots of Platycodon grandiflorum（Jacq）A. DC with different growth years

SONG Xu-hong， LI Long-yun*， CUI Guang-lin， DING Gang

（Chongqing Academy of Chinese Materia Medica/Chongqing Engineering Research Center for Fine Variety Breeding Techniques of Chinese Materia Medica/Chongqing Sub-center of National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Science， Chongqing? 400065， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical support for further understanding of plant microorganism interac-tion，mining culturable bacterial resources，and establishing functional bacterial resource，the population structure and diversity of endophytic bacteria in the roots of Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC with different growth years were analyzed. 【Method】The 16S rDNA sequence V3-V5 region of bacteria was amplified by PCR，and then the products of PCR amplification were sequenced with high throughput based on Illumina MiSeq platform. The community richness（Chao1 index and ACE index） and diversity（Shannon index and Simpson index） were calculated by QIIME software. R software was used to calculate the number of OTUs shared in each sample，and the number of OTUs shared and unique in each sample was showed through Venn diagram. Meanwhile，heat map and LEfSe statistical analysis were also used to estimate the diversity of endophytic bacteria population in roots of P. grandiflorum in different growth years. 【Result】There were some differences in population structure and diversity of endophytic bacteria in root of P. grandiflorum with different growth years. With the increase of growth years，the richness of endophytic bacteria and the diversity of community in the roots of P. grandiflorum continued to decrease. The number of unique OTUs was decreased continuously. The results showed that Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes，Cyanobacteria and Actinobacteria were the dominant microflora in 1-year-old to 2-year-old samples，while Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes，Cyanobacteria and Deinococcus-Thermus were the dominant microflora in 3-year-old sample. The relative abundance of Proteobacteria was the highest in the three samples，76.35%，82.38% and 86.46% respectively. The relative abundance of Proteobacteria in root of 1-year-old was significantly lower than that of 2-year and 3-year-old samples（P<0.05），but there was no significant difference between 2-year-old and 3-year-old samples （P>0.05）. The relative abundances of Bacillus，Bradyrhizobium and Dyella were the highest in 1-year-old samples，and that of Pseudomonas were the highest in 3-year-old samples. 【Conclusion】The endophytic bacteria in the roots of P. grandiflorum has rich diversity. The community structure of endophytic bacteria in the roots of P. grandiflorum is diffe-rent with different growth years. Specific OTUs，richness and community diversity of endophytic bacteria in the roots of P. grandiflorum continue to decrease with the increase of growth years. Plant age may be one ofthe factors causing changes in the population structure and diversity of endophytic bacteria in P. grandiflorum. Bacillus，Bradyrhizobium，Pseudomonas and Dyella can be used as cultivable bacterial resources for further study.

Key words： Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC; endophytic bacteria; Illumina MiSeq high-throughput sequen-cing; community composition;diversity change

Foundation item： National Chinese Medicine Industry Technology System construction Project（CARS-21）; Chong-qing Modern Mountain Characteristic and Efficient Agricultural Technology System construction Project（2019〔5〕）

0 引言

【研究意義】桔梗（Platycodonis Radix）為桔?？平酃僦参锝酃Platycodon grandiflorum（Jacq.） A.DC]的干燥根，是我國傳統(tǒng)大宗中藥材之一，常用于治療咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞及肺癰吐膿（國家藥典委員會，2015）。植物內(nèi)生細(xì)菌是指存在于植物組織內(nèi)部而對植物不產(chǎn)生危害的細(xì)菌（Kobayashi and Palumbo，2000），廣泛存在于各種雙子葉植物和單子葉植物中。植物內(nèi)生細(xì)菌具有多種生物活性，包括促進(jìn)植物種子萌發(fā)和生長發(fā)育（Miliute et al.，2015;Hernández-Soberano et al.，2020），增強(qiáng)宿主抗逆性等生物學(xué)功能（Farrar et al.，2014），還可用于害蟲及植物病原菌的生物防治等（李小杰等，2018;Afzal et al.，2019;Cui et al.，2019;Jiao et al.，2020）。因此，研究桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌多樣性與宿主的關(guān)系，對于探索內(nèi)生細(xì)菌和宿主植物間的互作機(jī)制，發(fā)掘利用有益的內(nèi)生細(xì)菌資源及促進(jìn)桔梗生產(chǎn)具有積極意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】桔梗含有三萜皂苷、多糖、黃酮、聚炔、甾體、酚酸和脂肪酸等類型的化合物（譚玲玲等，2011，2015;田雨弘，2017）。隨著生長年限增加，桔梗根部總皂苷的含量逐年增加，2年生栽培桔梗根部總皂苷含量基本接近或達(dá)到3～5年野生桔梗（李增欣等，2001），2年生栽培桔梗的株高、莖粗、分枝數(shù)等農(nóng)藝性狀高于3年生桔梗（楊盼盼等，2016），因此將2年作為藥用桔梗的最低生長年限。在桔梗內(nèi)生細(xì)菌的研究方面，Islam等（2010）對1年生、3年生和6年生桔梗內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，分離出低G+C含量的革蘭氏陽性菌——地衣形芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和短小芽孢桿菌（B. pumilus），其對辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和終極腐霉（Pythium ultimum）真菌具有較強(qiáng)的抑菌活力，地衣芽孢桿菌僅在3年生和6年生樣本中出現(xiàn)，短小芽孢桿菌僅在6年生樣本中出現(xiàn)，生長年限可能是影響桔梗根部可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性的重要因素;Cui等（2016）采用組織分離法，對桔梗根部內(nèi)生菌進(jìn)行分離，分離出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株15株，其Dyella屬的1株內(nèi)生菌具有高效轉(zhuǎn)化人參根總皂苷和人參單體皂苷為稀有人參皂苷的生物活性。此外，不依賴培養(yǎng)的高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于華重樓（Yang et al.，2015）、牡丹（Yang et al.，2017）、甘肅當(dāng)歸（Ling et al.，2019）、霍山石斛（陳韶通等，2019）、人參（雷鋒杰等，2019）、枸杞（茍琪等，2020）等中藥材內(nèi)生細(xì)菌種群構(gòu)成及群落多樣性的分析。【本研究切入點(diǎn)】目前，采用高通量測序技術(shù)對不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌組成及多樣性進(jìn)行檢測分析的研究尚無報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用Illumina MiSeq高通量測序平臺，對不同生長年限的桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析，為深入理解植物—微生物互作和挖掘可培養(yǎng)細(xì)菌資源，建立功能細(xì)菌資源庫提供理論支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于重慶市開州區(qū)紫水鄉(xiāng)雄鷹村5組（東經(jīng)108°22'，北緯31°27'，海拔1220 m）。試驗(yàn)開始于2015年，在土壤條件均勻一致的地塊，選取9個(gè)小區(qū)（每小區(qū)面積10 m2），按照隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)布置小區(qū)，第一年選取3個(gè)小區(qū)種植桔梗，以后每年種植3個(gè)小區(qū)，按照當(dāng)?shù)卦耘嗔?xí)慣，每年復(fù)合肥（N-P2O5-K2O=15-15-15）用量為150 kg/ha。1～3年生健康桔梗采集于2018年10月31日，桔梗根部樣本分別編號為P.PG.1、P.PG.2和P.PG.3。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 桔梗材料預(yù)處理 取樣結(jié)束后，摘除黏附在桔梗主根的土粒，參考王麗君等（2018）的方法，先用自來水沖洗根部30 min，隨后用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，再用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，最后用無菌水沖洗4次，放進(jìn)超凈工作臺晾干，用最后一次清洗的無菌水100 ?L涂布在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h，觀察無菌落形成后，用無菌鑷子和剪刀剪取不同部位的組織，放入液氮中，以備提取DNA。

1. 2. 2 桔梗內(nèi)生細(xì)菌總DNA提取和細(xì)菌擴(kuò)增 桔梗內(nèi)生細(xì)菌總DNA提?。翰捎肙MEGA磁珠土壤提取試劑盒（OMEGA M5635-02）進(jìn)行DNA提取，使用0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行分子大小判斷，使用NanoDrop 2000對提取DNA的純度和濃度進(jìn)行測定，樣品統(tǒng)一稀釋到20 ng/?L，根據(jù)擴(kuò)增情況進(jìn)行相應(yīng)的稀釋調(diào)整。使用16S rDNA V3～V4區(qū)特異性引物，前引物338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'，后引物806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR反應(yīng)體系25.00 μL，其中，5×反應(yīng)緩沖液5.00 μL，5×GC緩沖液5.00 μL，dNTP（10 mmol/L）2.00 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1.00 μL，NEB Q5 DNA高保真聚合酶0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.00 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s;98 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物（400～450 bp）進(jìn)行回收純化后用上海派森諾生物科技有限公司的Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行上機(jī)測序，并對序列進(jìn)行預(yù)處理及質(zhì)控。

1. 2. 3 數(shù)據(jù)分析 使用QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org/）統(tǒng)計(jì)多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）、豐富度指數(shù)（Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)）;對OTU豐度矩陣中每個(gè)樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機(jī)抽樣，以每個(gè)深度下抽取到的序列數(shù)及其對應(yīng)的OTU數(shù)量繪制稀疏曲線。使用R軟件（Version 3.2.0）計(jì)算各樣本（組）共有OTU的數(shù)量，并通過Venn圖（https：//en.wikipedia.org/wiki/Venn_diagram）直觀呈現(xiàn)各樣本（組）所共有和獨(dú)有OTU所占的比例;使用R軟件對Unweighted UniFrac距離矩陣分別進(jìn)行NMDS分析，通過二維排序圖描述群落樣本的結(jié)構(gòu)分布。50個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌屬的熱圖分析也由R軟件分析和生成。采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌稀釋曲線及其Venn分析

運(yùn)用Illunina MiSeq測序平臺對不同生長年限的桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行高通量測序，過濾嵌合體后，最終用于后續(xù)分析的有效序列共363318條。從圖1可看出，1～3年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌稀釋曲線趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，該方法適用于檢測不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌組成及多樣性。

使用Venn圖對樣本共有OTU進(jìn)行分析，從圖2可看出，1年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌有2170個(gè)OTUs，2年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌有1941個(gè)OTUs，而3年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌有1795個(gè)OTUs，1～3年生樣本特有的OTUs分別為780、474和450個(gè)。

2. 2 不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌α多樣性分析

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用來衡量群落的豐富度，數(shù)值越高，表明樣本豐富度越高;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)常用來衡量樣本種群的多樣性，數(shù)值越高，表明群落多樣性越高。由表1可知，隨著生長年限的增加，桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和群落多樣性持續(xù)降低，但不同生長年限間差異均不顯著（P>0.05，下同）。

2. 3 不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌各分類水平組成分析

根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，獲得每個(gè)樣本在各分類水平（門、綱、目、科、屬）的具體組成，可比較不同樣本在各分類水平所含有的微生物類群數(shù)量。由表2可知，隨著生長年限的增加，樣本中在各分類水平所含有的微生物類群數(shù)量依次降低，其中門和屬分類水平下各樣本間差異不顯著，其他分類水平下樣本間有顯著差異（P<0.05，下同）。

對門分類水平上相對豐度大于0.20%的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由圖3可看出，不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌在門分類水平上的相對豐度差異較大。1年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中，相對豐度依次為：變形菌門（Proteobacteria）76.35%，厚壁菌門（Firmicutes）7.79%，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）6.96%，放線菌門（Actinobacteria）3.56%，棲熱鏈球菌門（Deinococcus-Thermus）1.92%，擬桿菌門（Bacteroidetes）1.33%，綠彎菌門（Chloroflexi）0.63%，酸桿菌門（Acidobacteria）0.35%，浮霉菌門（Planctomycetes）0.29%，WPS-2 0.21%;2年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中，相對豐度依次為：變形菌門82.38%，厚壁菌門7.06%，藍(lán)細(xì)菌門4.19%，放線菌門2.17%，棲熱鏈球菌門1.96%，擬桿菌門1.09%，綠彎菌門0.27%，酸桿菌門0.16%，浮霉菌門0.19%，WPS-2 0.03%;3年生桔梗根內(nèi)部生細(xì)菌中，相對豐度依次為：變形菌門86.46%，厚壁菌門4.22%，藍(lán)細(xì)菌門3.40%，放線菌門1.74%，棲熱鏈球菌門2.17%，擬桿菌門0.77%，綠彎菌門0.47%，酸桿菌門0.23%，浮霉菌門0.25%，WPS-2 0.04%。

方差分析結(jié)果表明，不同生長年限的桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中，厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、浮霉菌門和WPS-2差異不顯著;1年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中變形菌門的相對豐度顯著低于2年生和3年生樣本，2年生與3年生桔梗樣本間差異不顯著;放線菌門的相對豐度在3年生樣本中最高，顯著高于2年生和1年生樣本，2年生樣本顯著高于1年生樣本。

為更好地了解不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌種群的相似度及變異情況，根據(jù)所有樣品在屬分類水平的物種注釋及相對豐度信息，選取豐度排名前50的屬進(jìn)行聚類分析并生成聚類熱圖（圖4）。從圖4可看出，1～3年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌在屬分類水平的分布存在差異，在1年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中，Actinidia_chinensis、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Bre-vundimonas、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、Mycobacterium、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Mese-mbryanthemum_ crystallinum_（common_iceplant）、Fa-ecalibaculum、Phenylobacterium、芽孢桿菌屬（Bacillus）、Shewanella、Stenotrophomonas、Afipia、Sphingo-bium、Novosphingobium、Aquabacterium和Pelomonas明顯高于2年生和3年生桔梗樣本。在2年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中，Lactobacillus、Amycolatopsis、Anoxybacillus、Gossypium_arboreum、Cupriavidus、Roseburia、Caulobacter、Streptococcus、Acinetobacter、Megamonas、Geobacillus、Faecalibacterium、Ochrobactrum和Erythrobacter明顯高于1年生和3年生桔梗樣本;在3年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中，Thermus、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Clostridium_sensu_ stricto_1、Serratia、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、SM1A02、Enterobacter、anaerobic_digester_metagenome、Brevibacterium、Sphingomonas、Pantoea、Escherichia-Shigella、Methylobacterium、Noviherbaspirillum和Delftia明顯高于1年生和2年生桔梗樣本。

通過Galaxy在線分析平臺（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/），提交屬分類水平的相對豐度矩陣進(jìn)行LEfSe分析，結(jié)果見表3。從表3可看出，在屬分類水平上，1年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌具有較多的差異顯著單元，共有22個(gè);其次為2年生樣本，差異顯著單元為7個(gè);3年生樣本的差異顯著單元為6個(gè)。隨著生長年限的增加，桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌在屬分類水平上的差異顯著單元明顯減少。由表3還可看出，1年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌差異顯著單元有9個(gè)分布在變形菌門，其中根瘤菌科（Rhizobiales）2個(gè)，伯克氏菌科（Burkholderiaceae）3個(gè)，黃單胞菌目（Xanthomonadales）3個(gè);9個(gè)分布在放線菌門，其中放線菌綱（Actinobacteria）1個(gè)，綠膿桿菌綱（Coriobacteriia）2個(gè)，雨孢菌科（Sporichthyaceae）2個(gè)，腸桿菌科（Ilumatobacteraceae）2個(gè)，紅蝽?xiàng)U菌目（Coriobacteriales）2個(gè);2個(gè)分布在細(xì)菌門的腐螺旋菌科（Saprospiraceae）;1個(gè)分布在硬壁菌門的Dubosiella;1個(gè)分布在幽微菌門的微孢子菌目（Verrucomicrobiales）。2年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中，7個(gè)差異顯著單元分布在芽單胞菌目（Gemmatimonadales）4個(gè)，中村氏菌科（Nakamurella）2個(gè)，Pleomorphomonadaceae1個(gè)。在3年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌中，6個(gè)差異顯著單元分布在5個(gè)變形菌門和1個(gè)綠彎菌門中，其中變形菌門1個(gè)，藤黃桿菌屬（Luteibacter）1個(gè)，泛菌屬（Pantoea）1個(gè)，腸桿菌目（Enterobacteriales）2個(gè)，熱微菌科（Thermomicrobiaceae）1個(gè)。

2. 4 不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌β多樣性分析

Beta多樣性分析的主要目的是考察不同樣本間群落結(jié)構(gòu)的相似性，本研究采用基于Unweighted Unifrac距離矩陣的NMDS分析及UPGMA聚類分析（圖5和圖6）。NMDS分析不依賴于特征根和特征向量的計(jì)算，而是通過對樣本距離進(jìn)行等級排序，使樣本在低維空間中的排序盡可能符合彼此間的距離關(guān)系（而非確切的距離數(shù)值）。因此，NMDS分析不受樣本距離的數(shù)值影響，僅考慮彼此間的大小關(guān)系，對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的數(shù)據(jù)，排序結(jié)果可能更穩(wěn)定。從圖5可看出，NMDS1把1年生桔梗和2年生、3年生桔梗分離開來，而NMDS2不能把2年生和3年生桔梗分開，UPGMA聚類分析結(jié)果（圖6）也印證了該結(jié)論。從聚類分析及二維排序均可看出，1年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌與2年生和3年生桔梗根部內(nèi)生菌間差異明顯。

3 討論

Illumina高通量測序技術(shù)已廣泛用于甜菜（Shi et al.，2014）、牡丹（Yang et al.，2017）、火龍果（Ren et al.，2018）、桑樹（Ou et al.，2019）、當(dāng)歸（Ling et al.，2019）等多種植物、組織的內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性及種群結(jié)構(gòu)變化研究。本研究基于Illumina MiSeq高通量測序平臺，比較分析不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性特征，稀釋曲線趨向平坦，表明該方法適用于檢測不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌組成及多樣性。α多樣性分析可反映微生物群落的物種豐富度及均勻性，本研究結(jié)果顯示，隨著桔梗生長年限的增加，根部內(nèi)生細(xì)菌的Shannon指數(shù)、OTU數(shù)量及特有OTU數(shù)量持續(xù)下降，與Yang等（2015）對不同生長年限（4年、6年和8年）華重樓根莖中內(nèi)生細(xì)菌變化趨勢的研究結(jié)果基本一致，說明生長年限的增加降低了根部內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。

Yang等（2017）對3種牡丹的根、葉內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行高通量測序，結(jié)果表明，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和放線菌門為優(yōu)勢菌群;也有研究表明，天山北坡甜菜的內(nèi)生細(xì)菌中，變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌和放線菌門為優(yōu)勢菌群（Shi et al.，2014）;變形菌門是番茄根內(nèi)細(xì)菌的主要優(yōu)勢種群（程志強(qiáng)，2018），也是春季和秋季桑樹優(yōu)勢菌群（Ou et al.，2019）。在本研究中，1～2年生桔梗根部的優(yōu)勢菌群為變形菌門、厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門和放線菌門，3年生桔梗根部則以變形菌門、厚壁菌門、藍(lán)細(xì)菌門和棲熱鏈球菌門為優(yōu)勢菌群。變形菌門在不同生長年限樣本中的相對豐度最高，分別為76.35%、82.38%和86.46%，為桔梗內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌群。變形菌門是常見的植物內(nèi)生細(xì)菌門，表明桔梗內(nèi)生細(xì)菌具有一般植物內(nèi)生細(xì)菌的特點(diǎn)。

變形菌門中芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、Dyella、慢生根瘤菌屬等內(nèi)生細(xì)菌為常見的功能菌（屬）。芽孢桿菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌可產(chǎn)生乙烯和生長素等生物調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)植物生長（Hallmann et al.，1997;Ramesh et al.，2009），還因具有產(chǎn)生抗生素及誘導(dǎo)植物對病原菌產(chǎn)生抗性的特性，而廣泛用于病害拮抗菌的篩選（謝關(guān)林等，2003;黃曦等，2010;Berg et al.，2010;Islam et al.，2010）。Dyella屬內(nèi)生細(xì)菌具有高效轉(zhuǎn)化人參根總皂苷和人參單體皂苷為稀有人參皂苷的生物活性（Cui et al.，2016）。在中性及微酸性條件下，慢生根瘤菌屬細(xì)菌是大豆根瘤菌中的優(yōu)勢菌（屬）（Tian et al.，2006），具有固氮促產(chǎn)功能。在本研究中，假單胞菌屬的相對豐度在3年生樣本中最高，芽孢菌屬、慢生根瘤菌屬和Dyella隨著桔梗生長年限的增加顯著降低。Islam等（2010）研究表明，可培養(yǎng)的芽孢桿菌屬細(xì)菌種類隨著桔梗生長年限的增加而降低，而在本研究中，芽孢桿菌屬的相對豐度也隨著生長年限的增加明顯降低。采用不同研究方法得到的結(jié)論一致，表明采用該高通量測序技術(shù)闡釋桔梗內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及多樣性具有較高的可信度。

植物內(nèi)生細(xì)菌的變化受植物基因型（Shi et al.，2014;Yang et al.，2017;吳燕燕等，2018;Bashir et al.，2020）、組織（Yang et al.，2017）、生長階段（Shi et al.，2014）及生長年限（陳韶通等，2019）等自身因素影響。同時(shí)，植物根際土壤（Afzal et al.，2019）、根部滲出物（Karnwal and Dohroo，2018）和氣候狀況（林標(biāo)聲等，2018;Vaishnav et al.，2018;Ling et al.，2019）也會影響植物內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)及種群變化。在本研究中，熱圖聚類分析、NMDS分析及UPGMA聚類分析結(jié)果均表明，2年生及3年生桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌菌群組成較接近，二者與1年生樣本組成差異明顯，不同生長年限桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌的多樣性有明顯差異，與Islam等（2010）通過常規(guī)培養(yǎng)分離研究的結(jié)論相一致，表明桔梗生長年限是影響桔梗根部內(nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)與多樣性變化的因素之一。