鄭佩華 汪蕾 張秀霞 李軍濤 張澤龍 王冬梅 冼健安 王安利

摘要：【目的】明確凡納濱對蝦微粒體谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶3（LvMGST3）在機體抗逆境脅迫與抵御病原體侵染過程中的功能作用，為有效提高對蝦的抗脅迫能力和抗病力提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肦ACE克隆LvMGST3基因cDNA序列，以EditSeq、ExPASy、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、Clustal X和MEGA 6.0等在線軟件進行生物信息學(xué)分析，再應(yīng)用半定量PCR進行組織表達量分析。凡納濱對蝦分別進行氨氮脅迫（20.00 mg/L）及脂多糖（LPS，8 μg/g）刺激后，采用實時熒光定量PCR檢測分析LvMGST3基因的表達響應(yīng)情況?！窘Y(jié)果】LvMGST3基因cDNA序列全長826 bp，包含85 bp的5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）、321 bp的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）和420 bp的開放閱讀框（ORF），在ploy（A）尾前端15個核苷酸處存在加尾信號AATAAA。LvMGST3基因編碼139個氨基酸殘基，包含MGST3亞家族共有的保守結(jié)構(gòu)域FNCX1QRX2H，此序列為FNCYQRAH。LvMGST3蛋白分子量為15.53 kD，理論等電點（pI）為9.38，具有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，但不存在信號肽。LvMGST3氨基酸序列與軟甲綱普通卷甲蟲（Armadillidium vulgare）的MGST3氨基酸序列（RXG56258.1）相似性最高，為71.22%;基于MGST3氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，LvMGST3與節(jié)肢動物門和軟體動物門的MGST3親緣關(guān)系較近。LvMGST3基因在凡納濱對蝦肝胰腺、鰓組織和眼柄中的基礎(chǔ)表達量較高;經(jīng)氨氮脅迫后，肝胰腺中的LvMGST3基因相對表達量分別在脅迫6和24 h時極顯著上調(diào)（P<0.01，下同），鰓組織中的LvMGST3基因相對表達量在脅迫12 h時顯著上調(diào)（P<0.05，下同）、脅迫48 h時極顯著上調(diào);肝胰腺中的LvMGST3基因在LPS刺激前期表達受抑制，至刺激12 h時極顯著上調(diào)，鰓組織中的LvMGST3基因分別在LPS刺激3和48 h時出現(xiàn)2個表達峰值，其相對表達量均極顯著高于對照組，分別是對照組的4.39和6.45倍?！窘Y(jié)論】LvMGST3基因具有典型的MGST3亞家族結(jié)構(gòu)特征，主要在凡納濱對蝦的肝胰腺、鰓組織和眼柄中表達，且氨氮脅迫和LPS刺激可明顯誘導(dǎo)凡納濱對蝦肝胰腺和鰓組織中LvMGST3基因的表達水平，即MGST3在對蝦抗逆境脅迫及抵御病原菌感染的調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對蝦;谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶3（MGST3）;基因克隆;氨氮脅迫;脂多糖（LPS）刺激

中圖分類號： S945.49? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2311-10

Cloning and function analysis of microsomal glutathione transferase 3 gene（MGST3） from Litopenaeus vannamei

ZHENG Pei-hua1，2， WANG Lei1， ZHANG Xiu-xia2，3， LI Jun-tao2，3， ZHANG Ze-long2，3，WANG Dong-mei2，3， XIAN Jian-an2，3*， WANG An-li1*

（1School of Life Sciences， South China Normal University/Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture/Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring/Key Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education， Guangzhou? 510631， China; 2Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-resources， Haikou? 571101， China; 3Hainan Institute of Tropical Agricultural Resources， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou? 571101， China）

Abstract：【Objective】The purpose of this study was to clarify the function of the microsomal glutathione thitransfera-se 3（LvMGST3） in the process of resisting stress and pathogen infection， and to provide theoretical basis for effectively improving the stress resistance and disease resistance of Litopenaeus vannamei. 【Method】RACE was used to clone the cDNA sequence of LvMGST3 gene， and online softwares such as Editseq， Expasy， SignalP-5.0， TMHMM 2.0， Clustal X and MEGA 6.0 was used for bioinformation analysis， and then semi-quantitative PCR was used for tissue expression ana-lysis. Shrimp were stimulated by ammonia nitrogen stress（20.00 mg/L） and lipopolysaccharide（LPS， 8 μg/g） injection respectively， and the expression responses of LvMGST3 were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】LvMGST3 was 826 bp in length， including 85 bp 5' non-coding region（5'-UTR）， 321 bp 3'-UTR and 420 bp open reading frame（ORF）， and the polyadenylate signal AATAAA presented at 15 nucleotides in front of ploy（A）. LvMGST3 encoded 139 amino acids， including the unique structural sequence FNCX1QRX2H of MGST3 subfamily， this sequence was FNCYQRAH. The molecular weight of LvMGST3 protein was 15.53 kD， and the theoretical isoelectric point（pI） was 9.38. It had three transmembrane domains， but there was no signal peptide. The amino acid sequence of LvMGST3 had the highest similarity to MGST3 amino acid of Malacostraca Armadillidium vulgare（RXG56258.1）， which was 71.22%. Phylogenetic trees based on the similarity of MGST3 amino acid sequence showed that LvMGST3 was closely related to MGST3 of Arthropoda and Mollusca. The basal expression of LvMGST3 was high in hepatopancreas， gills and eyestalk. After ammonia-nitrogen stress， expressions of LvMGST3 in hepatopancreas were extremely significantly up-regulated at 6 h and 24 h of stress （P<0.01， the same below）， and expressions of LvMGST3 in gills were significantly up-regulated at 12 h of stress（P<0.05， the same below） and extremely significantly up-regulated at 48 h of stress. Under LPS stimulation， expression of LvMGST3 in hepatopancreas was inhibited in the early stage， and then it was extremely significantly up-regulated at 12 h. There were two expression peaks of LvMGST3 in gills at LPS stimulation for 3 h and 48 h， and their relative expression levels were significantly higher than those in control group， which were 4.39 times and 6.45 times of control， respectively. 【Conclusion】LvMGST3 has typical structural characteristics of MGST3 family， and is mainly expressed in hepatopancreas， gills and eyestalk. The expression levels of LvMGST3 in the hepatopancreas and gill of L. vannamei are significantly induced by ammonia nitrogen stress and LPS stimulation， indicating that LvMGST3 plays an important role in the defense mechanism of shrimp against environmental stress and pathogenic bacteria infection.

Key words： Litopenaeus vannamei; microsomal glutathione transferase 3（MGST3）; gene cloning; ammonia nitrogen stress; lipopolysaccharide（LPS）

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（319QN306）; Guangdong Natural Science Foundation （2017A0 30313194）; Basic Research Project of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630052019013，1630052016 011）

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，是節(jié)肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacea）十足目（Decapoda）對蝦科（Penaeidae）中的重要人工養(yǎng)殖物種之一。近年來，在市場需求量的刺激下，凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到快速發(fā)展，但在高密度集約化養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖水質(zhì)惡化、病害頻發(fā)等一系列嚴峻問題隨之涌現(xiàn)，而造成蝦類免疫功能受損及抗應(yīng)激能力下降（麥康森等，2004;蔣葛等，2019）。因此，明確凡納濱對蝦抗逆境脅迫及抗病相關(guān)免疫調(diào)節(jié)機制是解決以上問題的重要理論依據(jù)，也是制定疾病防控策略的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M展】谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（Gluthione S-transferases，GSTs）是一種由多個基因編碼，在生物體各種組織和細胞間發(fā)揮多種生理功能的小分子蛋白酶（來有鵬等，2008;達愛斯等，2014）。依據(jù)GSTs在細胞中分布位置的不同，可將其分為三大類（Hayes et al.，2005）：第一類是研究最廣、功能性較強且具有普遍存在性的胞質(zhì)GSTs（Cytosolic GSTs）;第二類是主要位于哺乳動物線粒體和過氧化物酶體中的線粒體GSTs（Mitochondrial GSTs）（Sheehan et al.，2001;Morris et al.，2011）;第三類是微粒體GSTs（Microsomal GSTs，MGSTs），也稱為膜結(jié)合GSTs，已列入花生四烯酸和谷胱甘肽代謝膜關(guān)聯(lián)蛋白（Membrane associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism，MAPEG）超家族（Jakobsson et al.，1999a;Konishi et al.，2005）。真核生物的MAPEG超家族主要參與催化花生四烯酸和谷胱甘肽代謝，在細胞解毒和內(nèi)外源性脂類新陳代謝中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)作用（Jakobsson et al.，1996，1999b）;而MGSTs型蛋白因具有GST特性，還介入體內(nèi)抗親電基團和氧自由基攻擊等重要生理過程（羊紅玉，2011）。至今，有關(guān)MGSTs基因的研究主要集中于脊椎動物，包括大鼠（Rattus norvegicus）（Fetissov et al.，2002）、食蟹獼猴（Macaca fascicularis）（Uno et al.，2013）、人類（曾寶真等，2017）及鯉（Cyprinus carpio）（Fu and Xie，2006）、暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）（Kim et al.，2009）和松江鱸（Trachidermus fasciatus）（張秋霞，2013）等魚類，以及甲藻（Prorocentrum minimum）、條斑紫菜（Pyropia yezoensis）、褐藻（Laminaria japonica）和牽?；╗Pharbitis nil （L.） Choisy]等植物（Nebert and Vasiliou，2004;de Franco et al.，2008;佟少明等，2017），而針對無脊椎動物的研究甚少，僅涉及珍珠牡蠣（Pinctada martensii）（Chen et al.，2011）、飛蝗（Locusta migratoria）（Zhang et al.，2014）及橈足類動物（Roncalli et al.，2015）。上述研究結(jié)果均表明，MGSTs不僅具有解毒代謝功能，還在機體抗氧化應(yīng)激時發(fā)揮保護作用?！颈狙芯壳腥朦c】抗氧化和解毒是凡納濱對蝦有效抵抗和防御不良環(huán)境的關(guān)鍵方式，MGSTs是抗氧化和解毒途徑中的重要因子，但至今鮮見有關(guān)凡納濱對蝦MGSTs基因（LvMGSTs）的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用RACE克隆LvMGST3基因cDNA序列，進行生物信息學(xué)分析，并探討其在氨氮脅迫和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激下的表達響應(yīng)，明確LvMGST3在凡納濱對蝦抗逆境脅迫與抵御病原體侵染過程中的功能作用，為有效提高對蝦的抗脅迫能力和抗病力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 供試凡納濱對蝦

試驗所用凡納濱對蝦均購自海南省?？谑心仇B(yǎng)殖基地，總數(shù)量約450尾，其生長狀況良好，體重8～11 g/尾。試驗前1周將凡納濱對蝦置于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中以適應(yīng)新環(huán)境，水溫24～25 ℃，鹽度20‰，pH 7.8～8.0，持續(xù)曝氣增氧，并進行循環(huán)過濾處理。

1. 2 凡納濱對蝦總RNA提取及cDNA合成

隨機剖取3尾健康凡納濱對蝦的肝胰腺組織置于液氮中進行研磨，按TRIzol法抽提組織總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific，USA）估算其純度及濃度，再以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。將質(zhì)量較好的總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser （TaKaRa）說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 LvMGST3基因cDNA序列克隆

依據(jù)從凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得的LvMGST3基因表達序列標簽（EST）序列，設(shè)計中間片段的擴增引物MGST3-F1和MGST3-R1（表1）。然后進行第一輪PCR擴增，以凡納濱對蝦肝胰腺cDNA為模板，擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。PCR凝膠條帶采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]進行回收純化，連接至pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細胞（TaKaRa）。陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR鑒定后，送至深圳華大基因股份有限公司測序。

LvMGST3基因5'末端擴增根據(jù)SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒（TaKaRa）說明進行操作，采用Primer Premier 6.0設(shè)計的基因下游引物MGST3-5'-R1和Universal Primer Mix（UPM）進行配對擴增，擴增程序：94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，進行30個循環(huán)。LvMGST3基因3'末端擴增使用3'-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase試劑盒（Clontech，USA），根據(jù)確定的中間片段序列設(shè)計基因上游引物MGST3-3'-F1，然后與3'-RACE Outer Primer進行PCR擴增，擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。5'-RACE和3'-RACE擴增產(chǎn)物進行膠回收純化，并與克隆載體連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，然后挑選陽性克隆進行測序。將LvMGST3基因5'末端和3'末端測序結(jié)果聯(lián)合中間片段進行拼接，以獲得LvMGST3基因cDNA序列。

1. 4 LvMGST3基因序列分析

通過EditSeq分析LvMGST3基因開放閱讀框（ORF）及其推導(dǎo)氨基酸序列，采用NCBI網(wǎng)站上的BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）程序查找LvMGST3基因同源核苷酸序列及其氨基酸序列。利用ExPASy（http：//au.expasy.org/tools/）預(yù)測LvMGST3蛋白理化特性，以SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測其信號肽，運用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析LvMGST3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，利用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測其氨基酸疏水區(qū)域;再通過NCBI的保守結(jié)構(gòu)域（CDD）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測其保守結(jié)構(gòu)域和特殊位點;運用Clustal X和MEGA 6.0對不同物種的MGST3蛋白序列進行多重比對及聚類分析，并以鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Bootstrap=1000）。

1. 5 LvMGST3基因組織分布特征分析

隨機選取15尾凡納濱對蝦，平均分為3組，分別解剖采集其血細胞、眼柄、鰓組織、肝胰腺、腸道和肌肉，凍存于液氮中或直接用于提取總RNA。以凡納濱對蝦的β-Actin F/β-Actin R為引物、各組織cDNA為模板進行半定量PCR檢測，擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束擴增。獲得的擴增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。根據(jù)條帶亮度調(diào)整各組織cDNA模板用量，使β-Actin引物擴增的片段亮度基本一致，最終確定各組織cDNA用量。在相同狀態(tài)下，以MGST3-RT-F和MGST3-RT-R為引物擴增LvMGST3基因片段，并通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 6 氨氮脅迫及LPS刺激后LvMGST3基因表達差異分析

選取規(guī)格一致的健康凡納濱對蝦共150尾，平均分為氨氮脅迫組和對照組，每組3個平行。根據(jù)Lin和Chen（2001）、Liu和Chen（2004）的研究結(jié)果設(shè)氨氮脅迫濃度為20.00 mg/L（實測值20.26±0.51 mg/L），試驗期間每隔24 h更換1次海水，換水量為總水量的1/3，并以氯化銨（分析純）調(diào)整氨氮濃度，使其與設(shè)置的氨氮脅迫濃度保持一致。LPS注射試驗也設(shè)2個處理組（LPS剌激組和對照組），每組3個平行，每個平行25尾凡納濱對蝦。LPS溶液是將LPS（2 mg/mL，E.coli L2880）溶解于0.8%生理鹽水配置而成，終濃度為2 μg/μL。根據(jù)Xian等（2016）的研究結(jié)果，LPS刺激組按8 μg/g的劑量注射LPS溶液，對照組注射等量的無菌生理鹽水。于氨氮脅迫或LPS刺激后0、3、6、12、24和48 h分別取樣，從各處理組中隨機采集9尾凡納濱對蝦（每個平行3尾）的肝胰腺和鰓組織，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于實時熒光定量PCR檢測。根據(jù)已驗證的LvMGST3基因cDNA序列及β-Actin內(nèi)參基因，分別設(shè)計引物（MGST3-RT-F和MGST3-RT-R、β-Actin F和β-Actin R）。運用Stratagene Mx3005P儀（Agilent，USA）進行實時熒光定量PCR檢測，擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)。獲得的數(shù)據(jù)采用2–ΔΔCt法進行換算，并以SPSS 19.0進行t檢驗，分析氨氮脅迫和LPS刺激下LvMGST3基因在凡納濱對蝦肝胰腺及鰓組織中的表達變化情況。

2 結(jié)果與分析

2. 1 LvMGST3基因cDNA序列分析結(jié)果

以MGST3-F1和MGST3-R1為引物進行PCR擴增，獲得381 bp的LvMGST3基因中間片段;通過此片段設(shè)計5'-RACE和3'-RACE的特異性引物，分別擴增獲得538和603 bp的基因片段。將所有片段進行拼接得到LvMGST3基因cDNA序列全長為826 bp，包括85 bp的5'端非編碼區(qū)（5'-UTR）、321 bp的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）和420 bp的開放閱讀框（ORF），且在ploy（A）尾前端15個核苷酸處存在加尾信號AATAAA。LvMGST3基因編碼139個氨基酸殘基，其蛋白分子量為15.53 kD，理論等電點（pI）為9.38，富含纈氨酸殘基（Val）和甘氨酸殘基（Gly），均占11.51%。LvMGST3氨基酸序列中包含MGST3亞家族共有的保守結(jié)構(gòu)域FNCX1QRX2H（Chen et al.，2011），此序列為FNCYQRAH（圖1）。

2. 2 LvMGST3蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

MGST3是一類膜結(jié)合蛋白，理論上存在1個及1個以上的跨膜結(jié)構(gòu)域。TMHMM 2.0預(yù)測分析結(jié)果表明，LvMGST3蛋白具有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于第4～26位氨基酸殘基、第70～92位氨基酸殘基和第112～134位氨基酸殘基。其中，第1～3位氨基酸殘基和第93～111位氨基酸殘基位于膜外側(cè)，第27～69位氨基酸殘基和第135～139位氨基酸位殘基于膜內(nèi)側(cè)（圖2-A）。膜蛋白的跨膜區(qū)域通常為疏水區(qū)域，由20個左右的疏水性氨基酸殘基構(gòu)成。經(jīng)ProtScale在線預(yù)測分析得知，LvMGST3蛋白存在3個明顯的高峰值（正值）區(qū)域，即疏水區(qū)域（圖2-B），與TMHMM 2.0預(yù)測蛋白跨膜區(qū)的氨基酸殘基位置基本吻合，說明跨膜結(jié)構(gòu)域與疏水區(qū)域間能相互驗證。此外，SignalP 5.0預(yù)測結(jié)果顯示LvMGST3蛋白不存在信號肽。

2. 3 LvMGST3基因同源性及系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果

擴增獲得的LvMGST3基因與凡納濱對蝦基因組對應(yīng)核苷酸序列（GenBank登錄號XM_027382177.1）的相似性達100.0%，但在5'-UTR和ploy（A）尾共有74個核苷酸堿基不同，其覆蓋率為98%。LvMGST3氨基酸序列與軟甲綱普通卷甲蟲（Armadillidium vulgare）的MGST3氨基酸序列（RXG56258.1）相似性最高，為71.22%;與軟甲綱三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）（MPC14949.1）的相似性次之，為68.35%;與瓣鰓綱3種牡蠣[Crassostrea gigas（MPC14949.1）、C. virginica（XP_022294415.1）和C. brasiliana（APJ38 067.1）]的相似性分別為64.57%、59.70%和59.26%;與雙殼綱日本扇貝（Mizuhopecten yessoensis）（XP_021369437.1）、劍尾綱美洲鱟（Limulus polyphemu）（XP_013784372.1）、彈尾綱白符蟲兆（Folsomia candida）（XP_021966114.1）、蛛形綱隆頭蛛（Stegodyphus mimosarum）（KFM81199.1）的相似性分別為58.99%、58.70%、57.89%和55.80%。

多重序列比對分析結(jié)果（圖3）顯示，LvMGST3蛋白包含對MGST蛋白基本結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義的保守結(jié)構(gòu)域FNCYQRAH，其活性位點FNCX1QRAH也高度保守，且所有氨基酸殘基均位于相同的位點，疏水性氨基酸殘基占主要部分（圖中紅色標注部分）。說明不同物種的MGST3蛋白存在數(shù)量不等的疏水區(qū)域，與ProtScale預(yù)測LvMGST3蛋白存在疏水區(qū)域的結(jié)論一致。基于MGST3氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4）顯示，軟體動物門雙殼綱日本扇貝和瓣鰓綱3種牡蠣聚為一支，節(jié)肢動物門甲殼綱凡納濱對蝦和彈尾綱跳蟲白符蟲兆聚為一支，而劍尾綱美洲鱟和蛛形綱隆頭蛛聚為另一分支。

2. 4 LvMGST3基因在凡納濱對蝦各組織中的表達分析結(jié)果

以β-Actin為內(nèi)參基因進行半定量PCR擴增，結(jié)果（圖5）顯示，LvMGST3基因在凡納濱對蝦的血細胞、眼柄、鰓組織、肝胰腺、腸道及肌肉等6個組織中均有表達，但表達量在不同組織間存在一定差異。其中，在肝胰腺、鰓組織和眼柄中的表達水平較高，在血細胞和腸道中次之，而在肌肉中的表達水平相對較低。

2. 5 氨氮脅迫下LvMGST3基因的表達變化特征

由圖6可看出，氨氮脅迫下凡納濱對蝦肝胰腺中的LvMGST3基因相對表達量在脅迫6 h時極顯著上升（P<0.01，下同），且達最高表達水平，是對照組的1.48倍;至脅迫12 h時出現(xiàn)急劇下降趨勢，但在脅迫24 h時又有所回升;脅迫48 h時其相對表達量降至對照組水平以下，且極顯著低于對照組。凡納濱對蝦鰓組織中的LvMGST3基因相對表達量在脅迫12 h時顯著高于對照組（P<0.05，下同），至脅迫48 h時其相對表達量達峰值，是對照組的3.12倍;其他脅迫時間點的LvMGST3基因相對表達量與對照組間均無顯著差異（P>0.05，下同）。

2. 6 LPS刺激后LvMGST3基因的表達變化特征

由圖7可看出，凡納濱對蝦肝胰腺中的LvMGST3基因相對表達量在LPS刺激3 h后極顯著低于對照組，隨后急劇回升，但至刺激6 h時仍顯著低于對照組;LPS刺激12 h后LvMGST3基因的表達量達峰值，其相對表達量是對照組的1.57倍。在LPS刺激下，LvMGST3基因在凡納濱對蝦鰓組織中的表達模式與在肝胰腺中的恰好相反，分別在LPS刺激3和48 h時出現(xiàn)2個表達峰值，其相對表達量均極顯著高于對照組，分別是對照組的4.39和6.45倍;在刺激12 h時LvMGST3基因相對表達量達最低值，但與對照組間無顯著差異。

3 討論

MGST3是一種具有GST活性的微粒體膜結(jié)合蛋白，作為MAPEG超家族的主要組成之一，其在生物體抗氧化脅迫及細胞解毒過程中發(fā)揮著不可或缺的生物學(xué)作用（Jakobsson et al.，1999a）。目前，關(guān)于MGST3的研究主要集中在哺乳動物（Fetissov et al.，2002;Nebert and Vasiliou，2004）、魚類（Fu and Xie，2006;張秋霞，2013）及某些植物（de Franco et al.，2008;佟少明等，2017）上，針對節(jié)肢動物甲殼綱的研究甚少（Roncalli et al.，2015）。本研究從凡納濱對蝦肝胰腺中克隆獲得LvMGST3基因cDNA全長序列，經(jīng)蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測及BLAST比對分析確定LvMGST3蛋白屬于MAPEG超家族，其氨基酸序列中包含F(xiàn)NCX1QRX2H保守結(jié)構(gòu)域，與其他物種的MGST3氨基酸序列高度同源。LvMGST3基因與凡納濱對蝦基因組對應(yīng)核苷酸序列（XM_027382177.1）進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者具有98%的覆蓋率;綜合LvMGST3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、疏水區(qū)域及多序列比對分析結(jié)果可知，LvMGST3與節(jié)肢動物門和軟體動物門的MGST3親緣關(guān)系較近，是存在于微粒體中的膜結(jié)合蛋白，而疏水跨膜區(qū)的存在可能更有利于其穩(wěn)定停留在細胞膜中。

MGST3基因在暗紋東方鲀（Kim et al.，2009）、珍珠牡蠣（Chen et al.，2011）、松江鱸（張秋霞，2013）和飛蝗（Zhang et al.，2014）等多種物種中廣泛存在，但其表達量在不同組織間具有明顯差異。在哺乳動物的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，MGST3基因的組織分布主要集中在肝臟、大腦和心臟（Gessner et al.，2013;Uno et al.，2013;Ashbrook et al.，2014）;在水生動物中除上述3種組織外，在胃、腎臟、腸道及鰓組織中也有較高的表達量（Chen et al.，2011;張秋霞，2013）。本研究首次檢測MGST3基因在甲殼動物組織中的表達分布情況，結(jié)果顯示，LvMGST3基因在凡納濱對蝦各組織中均有表達，存在基礎(chǔ)的表達量，暗示其發(fā)揮著廣泛性的生物學(xué)功能作用。其中，LvMGST3基因在凡納濱對蝦肝胰腺和鰓組織中的表達量較高，與Chen等（2011）在研究珍珠牡蠣時得出的結(jié)論相似，推測MGST3在凡納濱對蝦和珍珠牡蠣2種動物中具有相似的生物學(xué)功能。MGST3在多數(shù)物種間的高度保守性和組織分布特異性均表明其具有重要的生物學(xué)功能。小鼠MGST3基因在其胚胎腦組織中廣泛分布，主要參與氧化應(yīng)激過程中的解毒和神經(jīng)保護作用（Fetissov et al.，2002）;在小鼠體內(nèi)外的肝臟發(fā)育過程均能檢測到MGST3基因的不同表達模式，說明其不僅參與肝臟形態(tài)發(fā)育過程，還與肝臟功能的成熟完善有關(guān)（Zhu et al.，2008;Cui et al.，2010）;MGST3基因表達模式還與小鼠海馬體的體積相關(guān)，當其調(diào)節(jié)失控后會對一系列神經(jīng)退行性疾病如帕金森病及阿爾茨海默病等造成影響（Ashbrook et al.，2014）。此外，珍珠牡蠣MGST3基因表達水平在鎘誘導(dǎo)和細菌刺激下呈明顯的時間依賴性增長趨勢，且具有谷胱甘肽（GSH）依賴的過氧化物酶活性，表明MGST3在鎘和細菌引起的氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要防御作用（Chen et al.，2011）;甲藻受重金屬銅脅迫后，其體內(nèi)的MGST3基因轉(zhuǎn)錄水平提高，GSH水平降低，也揭示MGST3基因在甲藻體內(nèi)發(fā)揮氧化調(diào)控和抗氧化防御作用（Guo et al.，2014）。為此，本研究探討LvMGST3基因在氨氮脅迫和LPS刺激下的表達響應(yīng)，旨在揭示MGST3在對蝦抗環(huán)境脅迫和病原菌感染防御過程中的功能作用。

氨氮作為水產(chǎn)經(jīng)濟動物養(yǎng)殖水體中普遍存在的環(huán)境脅迫因子之一，主要通過水生動物氮代謝廢物排放及飼料殘餌分解途徑產(chǎn)生（徐楊等;2015;常興濤等，2018;劉亞娟等，2018）。氨氮對水生動物尤其是甲殼動物具有明顯的毒害作用（Lin and Chen，2001;Miranda-Filho et al.，2009）。氨氮脅迫不僅會影響對蝦的形態(tài)發(fā)育和生理生化狀態(tài)，損傷機體的器官組織結(jié)構(gòu)，還降低其免疫系統(tǒng)功能及抗氧化能力，致使對蝦對環(huán)境的耐受力和抵抗力下降，而對病原體的敏感性升高，最終引起對蝦病害頻發(fā)甚至大批量死亡（蘆光宇等，2014;冼健安等，2014）。此外，氨氮脅迫會誘導(dǎo)有毒的活性氧（ROS）/活性氮（RNS）過量產(chǎn)生，機體為應(yīng)對氧化脅迫而激活抗氧化防御相關(guān)基因的表達。本研究結(jié)果表明，經(jīng)氨氮脅迫后LvMGST3基因相對表達量在凡納濱對蝦肝胰腺和鰓組織中均有不同程度的上調(diào)表達，即LvMGST3參與氨氮脅迫的防御過程，且通過氧化還原調(diào)節(jié)和抗氧化防御途徑發(fā)揮作用。凡納濱對蝦肝胰腺和鰓組織中的LvMGST3基因均表現(xiàn)出上調(diào)的表達模式，但在鰓組織中的相對表達量整體上高于肝胰腺，在肝胰腺中的相對表達峰值是對照組的1.48倍，在鰓組織中的相對表達峰值則是對照組的3.12倍，說明鰓組織中LvMGST3基因?qū)Π钡{迫的表達響應(yīng)更強烈。這可能是由于鰓組織作為水生動物氧氣交換的重要器官，對其生命維持至關(guān)重要，且鰓組織是水生動物與水體環(huán)境直接接觸的器官，氨氮和亞硝酸鹽等環(huán)境脅迫因子主要經(jīng)鰓組織進入蝦類等水生動物體內(nèi)，因此在環(huán)境脅迫過程中鰓組織更易受到脅迫損傷。

革蘭氏陰性菌是造成對蝦病害暴發(fā)的主要病原，其細胞壁外膜上具有特征性結(jié)構(gòu)成分——LPS，宿主一般通過識別革蘭氏陰性菌外膜上的LPS而引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)（Rodríguez-Ramos et al.，2008）。LPS自身帶有細胞毒性和免疫學(xué)活性，在毒理學(xué)上被認為是促炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子，能刺激各種免疫因子表達，并誘導(dǎo)超氧化物自由基及其他活性氧物質(zhì)釋放，從而引起機體的氧化應(yīng)激（Saluk-Jusczak and Wachowicz，2005）。已有研究表明，LPS刺激會導(dǎo)致蝦類血細胞中產(chǎn)生大量ROS和NO，激發(fā)Ca2+介導(dǎo)的血細胞凋亡通路，降低蝦體血細胞總數(shù)，導(dǎo)致其免疫力下降（Xian et al.，2017）。凡納濱對蝦受LPS刺激后，其不同組織中的谷氧還蛋白2（Grx2）和細胞色素P450（CYP370C2）呈不同程度的上調(diào)表達趨勢，表明抗氧化與解毒相關(guān)基因參與了抗病原菌感染的免疫防御過程（Zheng et al.，2019）。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激后凡納濱對蝦鰓組織中的LvMGST3基因表達在反應(yīng)時間和反應(yīng)強度上均較肝胰腺中的LvMGST3基因更敏感。在鰓組織中LvMGST3基因的表達水平在前期（刺激3 h）即呈顯著上升趨勢，且相對表達量是對照組的5.00倍以上;在肝胰腺中LvMGST3基因的表達在前期受到抑制，至刺激12 h時才呈顯著上調(diào)趨勢?？梢?，在氨氮脅迫和LPS刺激下，LvMGST3基因在凡納濱對蝦鰓組織中均呈現(xiàn)出更強烈的表達響應(yīng)，推測LvMGST3主要在凡納濱對蝦鰓組織中發(fā)揮防御功能作用。

冼健安，錢坤，郭慧，苗玉濤，王安利，王冬梅. 2014. 氨氮對蝦類毒性影響的研究進展[J]. 飼料工業(yè)，35（22）：52-58. [Xian J A，Qian K，Guo H，Miao Y T，Wang A L，Wang D M. 2014. Research progress in toxic effects of ammonia-N on shrimp[J]. Feed Industry，35（22）：52-58.]

徐楊，肖煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，韓玨，楊弘. 2015. 慢性氨氮脅迫對尼羅羅非魚幼魚生長及生理功能的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，46（2）：327-331. [Xu Y，Xiao W，Li D Y，Zou Z Y，Zhu J L，Han J，Yang H. 2015. Effects of chronic ammonia stress on growth and physiological function of juvenile Nile tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Journal of Southern Agriculture，46（2）：327-331.]

羊紅玉. 2011. MAPEG致炎信號通路激活與馬兜鈴酸I腎毒性相關(guān)性[D]. 杭州：浙江大學(xué). [Yang H Y. 2011. MAPEG activated inflammatory signaling pathway is involved in aristolochic acid I induced nephrotoxicity[D]. Hangzhou：Zhejiang University.]

曾寶真，葛春蕾，付橋粉，張志偉，宋鑫，黃文華. 2017. 穩(wěn)定過表達人MGST1基因抑制肺腺癌細胞SPC-A-1的凋亡[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，24（6）：608-614. [Zeng B Z，Ge C L，F(xiàn)u Q F，Zhang Z W，Song X，Huang W H. 2017. Stable overexpression of human MGST1 gene inhibits apoptosis of lung adenocarcinoma cell line SPC-A-1[J]. Chinese Journal of Cancer Biotherapy，24（6）：608-614.]

張秋霞. 2013. 松江鱸（Trachidermus fasciatus）谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、表達與功能分析[D]. 威海：山東大學(xué). [Zhang Q X. 2013. Cloning，expression and functional analysis of glutathione S-transferase genes in roughskin sculpin（Trachidermus fasciatus）[D]. Weihai：Shandong University.]

Ashbrook D G，Williams R W，Lu L，Stein J L，Hibar D P，Nichols T E，Medland S E，Thompson P M，Hager R. 2014. Joint genetic analysis of hippocampal size in mouse and human identifies a novel gene linked to neurodege-nerative disease[J]. BMC Genomics，15（1）：850-859.

Chen J H，Xiao S，Deng Y W，Du X D，Yu Z N. 2011. Clo-ning of a novel glutathione S-transferase 3（GST3） gene and expressionanalysis in pearl oyster，Pinctada martensii[J]. Fish & Shellfish Immunology，31（6）：823-830.

Cui J Y，Choudhuri S，Knight T R，Klaassen C D. 2010. Genetic and epigenetic regulation and expression signatures of glutathione S-transferases in developing mouse liver[J]. Toxicological Sciences，116（1）：32-43.

Fetissov S O，Schr?der O，Jakobsson P J，Samuelsson B，Haeggstr?m J Z，H?kfelt T. 2002. Expression of microsomal glutathione S-transferase type 3 mRNA in the rat nervous system[J]. Neuroscience，115（3）：891-897.

de Franco P O，Rousvoal S，Tonon T，Boyen C. 2008. Whole genome survey of the glutathione transferase family in the brown algal model Ectocarpus siliculosus[J]. Marine Genomics，1（3-4）：135-148.

Fu J，Xie P. 2006. The acute effects of microcystin LR on the transcription of nine glutathione S-transferase genes in common carp Cyprinus carpio L[J]. Aquatic Toxicology，80（3）：261-266.

Gessner D K，Schlegel G，Keller J，Schwarz F J，Ringseis R，Eder K. 2013. Expression of target genes of nuclear factor E2-related factor 2 in the liver of dairy cows in the transition period and at different stages of lactation[J]. Journal of Dairy Science，96（2）：1038-1043.

Guo R Y，Ebenezer V，Ki J S. 2014. PmMGST3，a novel microsomal glutathione S-transferase gene in the dinoflagellate Prorocentrum minimum，is a potential biomarker of oxidative stress[J]. Gene，546（2）：378-385.

Hayes J D，F(xiàn)lanagan J U，Jowsey I R. 2005. Glutathione transferases[J]. Annual Review of Pharmacology and Toxi-cology，45：51-88.

Jakobsson P J，Mancini J A，F(xiàn)ord-Hutchinson A W. 1996. Identification and characterization of a novel human microsomal glutathione S-transferase with leukotriene C4 synthase activity and significant sequence identity to 5-lipoxygenase-activating protein and leukotriene C4 synthase[J]. The Journal of Biological Chemistry，271（36）：22203-22210.

Jakobsson P J，Morgenstern R，Mancini J，F(xiàn)ord-Hutchinson A，Persson B. 1999a. Common structural features of MAPEG—A widespread superfamily of membrane associated proteins with highly divergent functions in eicosanoid and glutathione metabolism[J]. Protein Science，8（3）：689-692.

Jakobsson P J，Thorén S，Morgenstern R，Samuelsson B. 1999b. Identification of human prostaglandin E synthase：A microsomal，glutathione-dependent，inducible enzyme，constituting a potential novel drug target[J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，96（13）：7220-7225.

Kim J H，Raisuddin S，Rhee J S，Lee Y M，Han K N，Lee J S. 2009. Molecular cloning，phylogenetic analysis and expression of a MAPEG superfamily gene from the pufferfish Takifugu obscurus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，149（3）：358-362.

Konishi T，Kato K，Araki T，Shiraki K，Takagi M，Tamaru Y. 2005. A new class of glutathione S-transferase from the hepatopancreas of the red sea bream Pagrus major[J]. The Biochemical Joumal，388（1）：299-307.

Lin Y C，Chen J C. 2001. Acute toxicity of ammonia on Litopenaeus vannamei Boone juveniles at different salinity levels[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，259（1）：109-119.

Liu C H，Chen J C. 2004. Effect of ammonia on the immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus[J]. Fish & Shellfish Immunolgy，16（3）：321-334.

Miranda-Filho K C，Pinho G L L，Wasielesky Jr W，Bianchini A. 2009. Long-term ammonia toxicity to the pink-shrimp Farfantepenaeus paulensis[J]. Comparative Biochemistry & Physiology，150（3）：377-382.

Morris M J，Liu D，Weaver L M，Board P G，Casarotto M G. 2011. A structural basis for cellular uptake of GST-fold proteins[J]. PLoS One，6（3）：e17864.

Nebert D W，Vasiliou V. 2004. Analysis of the glutathione S-transferase（GST） gene family[J]. Human Genomics，1（6）：460-464.

Rodríguez-Ramos T，Espinosa G，Hernández-López J，Gollas-Galván T，Marrero J，Borrell Y，Alonso M E，Bécquer U，Alonso M. 2008. Effects of Echerichia coli lipopolysaccharides and dissolved ammonia on immune response in southern white shrimp Litopenaeus schmitti[J]. Aquaculture，274（1）：118-125.

Roncalli V，Cieslak M C，Passamaneck Y，Christie A E，Lenz P H. 2015. Glutathione S-transferase（GST） gene diversity in the crustacean Calanus finmarchicus—Contributors to cellular detoxification[J]. PLoS One，10（5）：e0123322.

Saluk-Jusczak J，Wachowicz B. 2005. The proinflammatory activity of lipopolysaccharide[J]. Postepy Biochemii，51（3）：280-287.

Sheehan D，Meade G，F(xiàn)oley V M，Dowd C A. 2001. Structure，function and evolution of glutathione transferases：Implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily[J]. The Biochemi-cal Journal，360（1）：1-16.

Uno Y，Murayama N，Kunori M，Yamazaki H. 2013. Characteri-zation of microsomal glutathione S-transferases MGST1，MGST2 and MGST3 in Cynomolgus macaque[J]. Drug Metabolism and Disposition，41（9）：1621-1625.

Xian J A，Zhang X X，Guo H，Wang D M，Wang A L. 2016. Cellular responses of the tiger shrimp Penaeus monodon haemocytes after lipopolysaccharide injection[J]. Fish and Shellfish Immunolgy，54：385-390.

Xian J A，Zhang X X，Wang D M，Li J T，Zheng P H，Lu Y P. 2017. Various cellular responses of different shrimp haemocyte subpopulations to lipopolysaccharide stimulation[J]. Fish & Shellfish Immunology，69：195-199.

Zhang X Y，Wang J X，Zhang M，Qin G H，Li D Q，Zhu K Y，Ma E B，Zhang J Z. 2014. Molecular cloning，characteri-zation and positively selected sites of the glutathione S-transferase family from Locusta migratoria[J]. PLoS One，9（12）：e114776.

Zheng P H，Wang L，Wang A L，Zhang X X，Ye J M，Wang D M，Sun J F，Li J T，Lu Y P，Xian J A. 2019. cDNA clo-ning and expression analysis of glutaredoxin（Grx） 2 in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei[J]. Fish & Shellfish Immunology，86：662-671.

Zhu D Y，Du Y，Huang X，Guo M Y，Ma K F，Yu Y P，Lou Y J. 2008. MAPEG expression in mouse embryonic stem cell-derived hepatic tissue system[J]. Stem Cells and Development，17（4）：775-783.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）