韓鵬飛， 閆 珍， 樊振川*

（1. 天津科技大學(xué) 大健康生物技術(shù)研究所 天津300457；2. 天津市大健康生物技術(shù)國際聯(lián)合研究中心 天津300457；3. 天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一種單細(xì)胞真核藻類，它屬于綠藻門（Chlorophyceae），等鞭毛綱 （Isokontae）， 團(tuán)藻目 （Volvocales）， 衣藻屬（Chlamydomonas）。 衣藻屬約100 多種，其中萊茵衣藻在遺傳學(xué)方面研究得較為全面[1]。 其細(xì)胞一側(cè)具有兩條等長的纖毛，賦予萊茵衣藻游動的能力[2]。 纖毛是由細(xì)胞微管為主構(gòu)成的，一種細(xì)胞表面突起的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 纖毛的進(jìn)化非常保守，廣泛分布于原生生物到脊椎動物的真核細(xì)胞的細(xì)胞表面[3]。

“鞭 毛 內(nèi) 運 輸”（intraflagellar transport， 簡 稱IFT）是發(fā)生于纖毛軸絲和纖毛膜之間，由IFT 蛋白顆粒的兩個亞蛋白復(fù)合物IFT-A 和IFT-B，經(jīng)其不同偶聯(lián)的馬達(dá)蛋白作用，從纖毛基部到頂端的一種蛋白質(zhì)復(fù)合體的雙向運輸過程[4-6]。 IFT 對纖毛的組裝、維持和解聚起到?jīng)Q定性作用。 纖毛具有極高的復(fù)雜性，在調(diào)控繁多的細(xì)胞生理活動和復(fù)雜的動物發(fā)育過程中具有重要作用。 纖毛亞基蛋白IFT-A 和IFT-B 的突變， 會引起纖毛運動性的喪失或纖毛的缺陷，從而導(dǎo)致人類出現(xiàn)肥胖、糖尿病、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、多囊腎病、色素性視網(wǎng)膜炎、復(fù)性呼吸道感染、不育癥、智力遲鈍、多趾等癥狀[7]。 因此，研究IFT 蛋白顆粒復(fù)合物相關(guān)作用對纖毛病的發(fā)病機理和預(yù)防顯得尤為重要。

最近，生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)IFT-B 由兩個亞基復(fù)合物IFT-B1 和IFT-B2 構(gòu)成，IFT-B2 中的蛋白IFT57位于IFT-B1 和IFT-B2 之間[8-9]。 IFT57 是與運動有關(guān)的蛋白質(zhì)，IFT57 在鞭毛內(nèi)運輸中起到阻止IFT顆粒復(fù)合物降解的功能，在鞭毛組裝中發(fā)揮著重要作用，它的缺失會導(dǎo)致纖毛的缺陷，影響細(xì)胞的游動[10]。 因此，制備萊茵衣藻IFT57 抗體，為進(jìn)一步研究其維持纖毛長度和功能提供了前提。

原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、 培養(yǎng)成本低、方法簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，利用該系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)、制備抗體已經(jīng)相當(dāng)成熟[11-12]。 作者利用該系統(tǒng)表達(dá)ift57基因中一段編碼親水性氨基酸序列的片段，進(jìn)行蛋白質(zhì)的親和純化和抗原抗體的反應(yīng)，比表達(dá)全基因序列具有快捷、高效、經(jīng)濟的優(yōu)勢，為原核表達(dá)一系列溶解性差、高相對分子質(zhì)量、難純化蛋白質(zhì)提供了一定的借鑒意義。 為深入研究IFT57 在鞭毛內(nèi)運輸中的作用機理，為營養(yǎng)代謝纖毛病的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒大腸桿菌 （Escherichia coli）XL1-blue，BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，pET-28a（+）質(zhì)粒：均為作者所在實驗室保存；萊茵衣藻CC-125 藻種：為作者所在實驗室保存。

1.1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶、TransTaqHiFi DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶和彩色預(yù)染蛋白Marker等：均購自美國Fermentas 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、NC 膜：購自北京索來寶公司；DNA Marker（1000 bp、100 bp）、dNTPs：購自全式金公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow 蛋白質(zhì)純化介質(zhì)以及Protein A SepharoseTMCL-4B 抗體純化介質(zhì)： 均購自美國GE Healthcare 公司；弗式完全佐劑和不完全佐劑：購自美國Sigma 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體：購自美國Cell Signaling 公司。

1.1.3 實驗動物新西蘭大白兔1 只， 兩月齡大，體重1.5 kg，由天津歐陽實驗種兔場提供。

1.2 方法

1.2.1 IFT57 蛋白質(zhì)親水性分析運用DNAMAN軟件對IFT57 表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行親水性分析，見圖1。選取N 端319~469 aa 作為抗原，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)[13]。

圖1 IFT57 表達(dá)蛋白質(zhì)的親水性分析Fig. 1 Hydrophilic analysis the expressed of IFT57 protein

1.2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建作者所在實驗室保存的pET-28a （+） 表達(dá)載體用BamHI、HindIII 進(jìn)行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收；根據(jù)引物設(shè)計原則設(shè)計帶有BamHI 和HindIII 酶切位點的PCR 引物，上游引物5’-TAGGATCCATGGTGAT CAGCA AGGCCTGG-3’，下游引物5’-ACAAGCTT TCA CTA GTCCTCCTCCTCGTCG-3’。 通 過 菌 落PCR 擴增目的片段，利用產(chǎn)物純化試劑盒回收擴增產(chǎn)物。用BamHI、HindIII 進(jìn)行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的基因；將目的基因與載體用T4DNA 連接酶連接后， 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-blue 中，涂到含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 平板上；挑選陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測序驗證。

1.2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)驗證將驗證正確的重組質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，在含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 平板上篩選含pET-28a（+）-ift57質(zhì)粒的陽性菌落；挑取陽性菌落于LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL 卡那霉素）過夜培養(yǎng)，然后按照1∶20 接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)到含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、225 r/min 培養(yǎng)至OD600值到0.6~0.8， 加入終濃度0.2 mmol/L 的IPTG，28 ℃、200 r/min 誘導(dǎo)表達(dá)6 h，同時設(shè)置不加IPTG 對照組。 離心收集菌體并進(jìn)行超聲破碎，分別取未誘導(dǎo)、全蛋白質(zhì)、上清液和沉淀與2×蛋白質(zhì)上樣緩沖液混合煮沸， 用12 g/dL SDS-PAGE 電泳檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

1.2.4 融合蛋白質(zhì)6×His-IFT57 的純化誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體加入15 mL His Bingding buff （20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），超聲破碎菌體細(xì)胞至澄清，離心（4 ℃，12 000 r/min，15 min）收集上清液，經(jīng)過0.45 μm 濾膜過濾后加入到預(yù)先平衡好的Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 純化柱中，經(jīng)過常溫結(jié)合、洗滌和洗脫等步驟得到純化后的目的蛋白質(zhì)。純化條件為：常溫結(jié)合1 h，洗滌緩沖液A（20 mmol/L咪唑，20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），洗脫緩沖液A（500 mmol/L 咪唑，20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），將上述收集的流穿液組分、洗滌組分以及洗脫組分分別用12 g/dL SDS-PAGE檢測分析，利用酶標(biāo)儀，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線測定融合表達(dá)蛋白質(zhì)濃度[14]。 通過不斷優(yōu)化所用溶液的pH、鹽離子濃度、咪唑的含量等條件得到了純度較高的融合蛋白質(zhì)。

1.2.5 多克隆抗體的制備實驗動物是兩月齡大的新西蘭雄性大白兔， 適應(yīng)一周后進(jìn)行第一次免疫。 初次免疫前在耳源靜脈取血，分離血清，在后續(xù)試驗中作為陰性血清[15-16]；取1 mg 純化后的融合蛋白質(zhì)與同劑量弗氏完全佐劑混合后充分乳化，采用頸背部皮下多點注射法免疫實驗動物； 之后每隔10～14 d 取1 mg 6×His-IFT57 蛋白質(zhì)與同劑量的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，加強免疫大白兔，每次加強免疫前進(jìn)行耳源取血，利用間接ELISA 法測定抗血清的效價，當(dāng)效價滿足試驗要求，加強免疫后一周取血分離抗血清，分裝凍存[17-18]。

1.2.6 間接ELISA 法測定抗血清效價本實驗采用間接ELISA 法測定抗血清的效價， 以6×His-IFT57 蛋白質(zhì)作為包被抗原，用5%的脫脂乳粉封閉后，以所得的抗血清為一抗，抗血清和陰性血清設(shè)定稀釋梯度1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000，二抗為HPR 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000），經(jīng)過TMB（3′，3′，5′，5′，-四甲基聯(lián)苯胺）顯色并經(jīng)0.5 mol/L H2SO4終止，測定OD450處的吸光值，對照實驗組血清OD450與陰性組血清OD450的數(shù)值，確定抗血清的效價[19]。

1.2.7 抗血清的純化分離完的抗血清用Protein A SepharoseTM進(jìn)行純化，純化條件為[12]：結(jié)合緩沖液B（12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），洗脫緩沖液B（0.1 mol/L 甘氨酸，pH 2.7）。收集洗脫液，用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）將洗脫液pH 值調(diào)至中性，進(jìn)行后續(xù)Western blotting 檢測。

1.2.8 Western blotting 檢測多克隆抗體的特異性將處理好的萊茵衣藻CC-125 藻種進(jìn)行蛋白質(zhì)定量[20]，取8 μL（20 ng）衣藻上清液加入2 μL 5×上樣緩沖液混勻，進(jìn)行SDS-PAGE 和電轉(zhuǎn)印后，衣藻蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上， 用5%的脫脂奶粉封閉1 h；多克隆抗體稀釋度1∶500，二抗為HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），加入顯色液后曝光照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

PCR 擴增獲得456 bp 片段， 與預(yù)期大小一致，見圖2（a）。 將重組的質(zhì)粒進(jìn)行BamHI 和HindIII 雙酶切驗證， 獲得條帶大小約為450 bp 左右的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖2（b）。 將重組質(zhì)粒送到金唯智公司測序，經(jīng)過測序驗證后序列完全正確，說明表達(dá)載體構(gòu)建成功，表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)正確，并將其命名為pET-28a（+）-ift57。

圖2 ift57 的PCR 擴增和重組表達(dá)載體的雙酶切驗證Fig. 2 PCR amplication of ift57 and identification of recombinant expression plasmid by restriction enzyme digestiond

2.2 融合蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

pET-28a （+）-ift57轉(zhuǎn) 化 到 大 腸 桿 菌BL21（DE3）中，菌體經(jīng)過0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)（同時設(shè)置不含IPTG 的對照組），經(jīng)過SDS-PAGE 在17 200處出現(xiàn)目的條帶， 對照組菌體蛋白質(zhì)沒有此帶，說明目的蛋白質(zhì)6×His-IFT57 成功表達(dá)， 見圖3（a）；將誘導(dǎo)完的菌體經(jīng)過超聲破碎，取全蛋白質(zhì)和上清液以及沉淀，經(jīng)過SDS-PAGE 發(fā)現(xiàn)，目的條帶主要出現(xiàn)在上清液中，而沉淀中則幾乎沒有，說明融合蛋白質(zhì)呈水可溶性，見圖3（b）。

圖3 SDS-PAGE 檢測重組蛋白質(zhì)在E. coli BL21（DE3）中的表達(dá)Fig. 3 SDS -PAGE analysis of the expression of recombinant protein in E. coli BL21（DE3）

2.3 融合蛋白質(zhì)的純化

融合蛋白質(zhì)6×His-IFT57 經(jīng)過His 親和層析純化后，用SDS-PAGE 進(jìn)行分析。結(jié)果表明，融合蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小正確， 且純度達(dá)95%以上，見圖4。

2.4 抗血清效價的測定

用純化得到的6×His-IFT57 融合蛋白質(zhì)作為抗原免疫新西蘭大白兔，第五次免疫后經(jīng)耳緣靜脈少量采血， 室溫靜置1 h 后獲得析出血清， 以間接ELISA 法測定抗血清的效價，利用酶標(biāo)儀測定OD450處的吸光值后計算出抗血清的效價，結(jié)果見圖5?？芍?，新西蘭大白兔抗血清效價大于512 000。

圖4 經(jīng)Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 純化后6×His-IFT57融合蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 檢測Fig. 4 SDS-PAGE analyzed the purified 6×His-IFT57 recombinant protein

圖5 間接ELISA 法測定抗血清的效價Fig. 5 Results of ELISA test of anti-IFT57 polyclonal antiserum

2.5 Western blotting 抗體特性檢測

于第五次免疫后一周取兔子血分離抗血清。 將抗血清首先經(jīng)過Protein A 純化， 再進(jìn)行抗原-抗體膜純化。 用Western blotting 檢測其識別萊茵衣藻中IFT57 蛋白質(zhì)的特異性，經(jīng)過顯色可以在57 000 附近識別出單一條帶，條帶相對分子質(zhì)量大小符合預(yù)期， 見圖6。 即制備的多克隆抗體可以特異性識別IFT57 蛋白質(zhì)，可以直接用于后續(xù)對IFT57 的研究。

3 結(jié) 語

目前對纖毛的結(jié)構(gòu)、組裝機制、功能的研究和對“纖毛相關(guān)疾病”相關(guān)機理的了解主要來自于對萊 茵 衣 藻、 四 膜 蟲 （Tetrahymean）、 錐 體 蟲（Trypanosome）、 線 蟲 （C. elegans）、 斑 馬 魚（Brachydaniorerio）和小鼠（Musmusculus）等各種模式生物的研究。 萊茵衣藻以其特有的細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)勢、實驗系統(tǒng)優(yōu)勢、生化研究優(yōu)勢和經(jīng)典遺傳優(yōu)勢等成為研究最廣的一個[21]。目前，對纖毛的研究起步較晚，我們對“纖毛內(nèi)運輸”調(diào)控機制、馬達(dá)蛋白的活性調(diào)劑，以及纖毛解聚和細(xì)胞周期之間的相互關(guān)系等認(rèn)識有限，對“纖毛相關(guān)疾病”的發(fā)病機理的研究，以及對該類病的預(yù)防、診斷和治療還有一定差距[21-22]。 因此，繼續(xù)對“纖毛內(nèi)運輸”中不同蛋白質(zhì)顆粒的研究，將會給這些問題帶來答案，對“纖毛相關(guān)疾病”機理的研究和預(yù)防治療，帶來一定的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)意義。

本研究的ift57基因，雖然在對纖毛的形成中不起重要作用，但是在阻礙纖毛降解過程中發(fā)揮重要作用，從而避免了纖毛的缺失[10]。為進(jìn)一步研究ift57基因?qū)w毛缺失的影響，我們制備了高特異性和高靈敏度的抗體。 作者利用大腸桿菌，經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ift57部分親水性序列，采用小標(biāo)簽His 純化標(biāo)簽和目的蛋白質(zhì)融合表達(dá)出純度極高（95%以上）的可溶性蛋白質(zhì)，作為抗原免疫動物獲得相應(yīng)抗血清。 該抗體靈敏度強、特異性高，僅經(jīng)過一步純化便可以經(jīng)過ECL 曝光， 充分驗證其特異性和靈敏度。該方法極大的節(jié)省了融合蛋白質(zhì)純化和抗血清純花步驟，帶來了一定經(jīng)濟效益。 該方法為多克隆抗體的制備提供了一種新型手段， 為大相對分子質(zhì)量、水不溶性蛋白質(zhì)的純化提供了借鑒意義。 該抗體的制備為ift57 在纖毛運輸?shù)淖饔脵C制和有關(guān)纖毛病的研究提供了有利的支持。

圖6 Western blotting ECL 曝光法驗證IFT57 抗體特異性Fig. 6 IFT57 antibody specificity was detected by Western blotting through ECL method