黃曉冬， 黃世英， 蔡建秀， 王玲平， 孫 波， 謝秋燕

（1. 泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院， 福建 泉州362000；2. 華僑大學(xué) 福建省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室， 福建 廈門361021；3. 福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點實驗室，福建 泉州362000）

大型海藻資源豐富，自古以來是沿海居民藥食兩用的食材。 分布在我國東南沿海中、高潮帶巖礁的褐藻鐵釘菜（Ishige okamuraiYendo）系北太平洋西部特有的可食海藻，其甲醇提取物具有較高的多酚含量，甲醇提取物的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水等5 個萃取部分均具有一定的抗氧化活性與α-葡萄糖苷酶抑制活性[1-2]，80%甲醇提取物可通過改變肝葡萄糖代謝酶活性、改善胰島素抵抗起到降血糖的作用[3]。 考慮提取成本與應(yīng)用安全性的因素，結(jié)合前期鐵釘菜甲醇提取物水部位有抗氧化與α-葡萄糖苷酶抑制活性的基礎(chǔ)上，作者設(shè)計以水提醇沉法提取獲得鐵釘菜水提醇沉物與水提醇沉上清液部分，在初步比較兩者相關(guān)活性的前提下，選取水提醇沉上清液部分進(jìn)行抗氧化、抗酪氨酸酶活性研究，并進(jìn)行沖劑制備與體內(nèi)外降糖活性檢測，旨為鐵釘菜水提醇沉上清液部分的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鐵釘菜水提醇沉上清液部分的制備

新鮮鐵釘菜藻體采自福建泉州圍頭半島海域中、高潮帶巖礁，藻體剔除異物，清潔海水洗除雜質(zhì)，組織粉碎機(jī)粉碎后，按料液比（1 g∶30 mL）加蒸餾水，90～100 ℃水浴提取兩次，每次2 h，抽濾后取濾液減壓濃縮（-0.09 MPa，65 ℃）至一定體積，加入無水乙醇使體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，4 ℃醇沉24 h 后，4 000 r/min 離心5 min 得上清液與醇沉物。上清液減壓濃縮（-0.09 MPa，65 ℃），凍干后制得鐵釘菜水提醇沉上清液部分 （supernatants from water extracting-alcohol precipitation of Ishige okamurai，以下簡稱SWEAPI）。

1.2 SWEAPI 的抗氧化活性測定

參照劉冬冬等[4]的方法測定DPPH 自由基清除活性，以維生素C 作為陽性對照；參照黃曉冬等[5]的方法測定羥基自由基清除活性，以2，6-二叔丁基對甲酚BHT 為陽性對照。以樣液濃度對清除率擬合回歸方程，求得半數(shù)效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50。

1.3 SWEAPI 的抗酪氨酸酶活性測定

參照石嘉懌[6]的方法略加修改。 具體步驟為：取1.0 mL 樣 液，0.4 mL 100 U/mL 酪 氨 酸 酶 溶 液（50 mmol/L pH 6.8 磷 酸 鹽 緩 沖 液PBS 配 制），2.8 mL 0.5 mmol/L 多巴（L-DOPA）底物溶液，充分混勻后37 ℃水浴保溫10 min， 測波長475 nm 處的吸光度值，實驗重復(fù)3 次，取平均值。

酶活性抑制率的公式：

式中：As為樣液組的吸光度值；A0為空白對照組（以PBS 代替樣液） 的吸光度值；A1為空白對照組背景吸光度值（以PBS 代替樣液與酪氨酸酶溶液）；Ab為樣液背景吸光度值（以PBS 代替酪氨酸酶溶液）。

以樣液質(zhì)量濃度對抑制率擬合回歸方程，求得半數(shù)抑制質(zhì)量濃度IC50。

1.4 鐵釘菜沖劑的制備工藝條件優(yōu)選與質(zhì)量評價

1.4.1 制備工藝SWEAPI 與一定比例的可溶性淀粉、 甜蜜素、β-環(huán)狀糊精混合后， 稍加適量95%乙醇，制成捏可成團(tuán)、壓可散開的軟材，過40 目藥篩制粒，制粒后80 ℃干燥、整粒、紫外滅菌、密封包裝。

1.4.2 正交試驗設(shè)計以SWEAPI 與可溶性淀粉、甜蜜素、β-環(huán)狀糊精的比例用量為因子， 設(shè)置三個水平進(jìn)行按L9（34）正交設(shè)計與實驗，因子水平見表1。 實驗結(jié)果參考全山叢等[7]的評分方法進(jìn)行綜合評價，根據(jù)制粒難易程度、溶化性、溶化后固形物殘留量、味覺、感官性狀等分別等級評分，各項評分按權(quán)重折算求總分， 以此作為正交優(yōu)選的考察指標(biāo)，各項評分指標(biāo)與等級標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 制粒工藝試驗因子水平表Table 1 Granulating process test factors and levels of orthogonal experiment

表2 評分標(biāo)準(zhǔn)與權(quán)重Table 2 Grading standard and proportion

1.4.3 鐵釘菜沖劑產(chǎn)品質(zhì)量的評價稱取0.25 g樣品置于盛有250 mL 生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8 000~10 000 r/min 均質(zhì)2 min， 制成1∶1 000 的樣品勻液，按GB 4789.2-2010 的方法[8]進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)檢查， 微生物限量按保健 （功能） 食品通用標(biāo)準(zhǔn)GB 16740-1997[9]進(jìn)行描述；直接干燥法測定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)[10]；苯酚-硫酸法測定總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[11]，結(jié)果以葡萄糖計；凱式定氮法[12]測定沖劑蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（考馬斯亮藍(lán)法[13]測上清液部分蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；福林酚法測定多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果以沒食子酸計[14]。

1.5 鐵釘菜沖劑對α-葡萄糖苷酶活性抑制的測定

α-葡萄糖苷酶抑制活性測定參照Li T 等[15]的方法。在96 孔酶標(biāo)板上依次加入112 μL 0.1 mol/L PBS （pH 6.8），20 μL 0.2 U/mL α-glucosidase，8 μL樣液 （以二甲亞砜DMSO 配制），37 ℃恒溫15 min后加入2.5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷PNPG 20 μL，經(jīng)反應(yīng)15 min 后加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀405 nm 波長下測吸光度值，重復(fù)實驗3 次，取平均值。

酶活性抑制率的公式：

式中：A1為樣液組的吸光度值；A2為以PBS 代替酶溶液測得的樣液組背景吸光度值；A3為以DMSO 代替樣液測得的空白對照組吸光度值；A4為以DMSO代替樣液與PBS 代替酶溶液測得的空白對照組背景吸光度值。

1.6 鐵釘菜沖劑對四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的的降糖作用

雄性、體質(zhì)量（22±1） g 的SPF 級健康KM 小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供， 許可證號為SCXK（滬）2012-0002）于鼠房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，食量適當(dāng)，飲水充足，保持鼠房溫度18～20 ℃。 3 d后禁食不禁水12 h，按200 mg/kg 劑量腹腔注射2%四氧嘧啶溶液（無菌生理鹽水配制）， 隨機(jī)選取10只小鼠作為正常組（NC）腹腔注射等體積的生理鹽水。1 h 后恢復(fù)正常飲食，3 d 后斷尾取血（取血前小鼠禁食不禁水12 h）， 血糖儀 （三諾安穩(wěn)YZBI 湘004-2012， 長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司）測血糖值，隔天再測一次血糖，以血糖值穩(wěn)定并且大于11.1 mmol/L 且出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象的小鼠視為造模成功。

將建模成功的糖尿病小鼠按體質(zhì)量、血糖值分為5 組，各組動物血糖平均差值不大于0.5 mmol/L，每組10 只，分別記為糖尿病模型對照組（MC）、陽性對照鹽酸二甲雙胍組（MH，500 mg/kg）、鐵釘菜沖劑低劑量組 （LI，350 mg/kg）、 鐵釘菜沖劑中劑量組（MI，700 mg/kg）、 鐵釘菜沖劑高劑量組（HI，1400 mg/kg）。給藥組每天下午5 時按劑量灌胃給藥一次，正常組和模型組每天給予等量的生理鹽水， 連續(xù)14 d。每7 天測一次空腹血糖 （晚餐后禁食不禁水12 h，次日早晨7～8 時測定血糖值）。 實驗?zāi)?，參考陳玲玲等[16]的方法測定糖耐量，即測空腹血糖值后按劑量灌胃1 次，20 min 后灌胃葡萄糖2.0 g/kg，測定給葡萄糖后0.5、1、2 h 的血糖值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SWEAPI 的抗氧化活性

2.1.1 SWEAPI 對DPPH 自由基的清除作用不同質(zhì)量濃度的SWEAPI 樣液對DPPH 自由基的清除作用見圖1。 在質(zhì)量濃度0～2.0 mg/mL 范圍內(nèi)，SWEAPI 對DPPH 自由基清除的量效關(guān)系均隨樣液質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，2.0 mg/mL 時DPPH 自由基清除率可達(dá)（73.66±1.53）%，劑量-效應(yīng)呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān) （P＜0.01）， 滿足線性回歸方程y=36.218x+7.230（R2=0.952 6，P＜0.01）。 由此方程可計算出SWEAPI 清除DPPH 自由基的半效應(yīng)質(zhì)量濃度為EC501.18 mg/mL，與本實驗測得的0.054 mg/mL VC具有等效作用。

圖1 鐵釘菜水提醇沉上清液部分對DPPH 自由基的清除作用Fig. 1 DPPH radical scavenging effect of SWEAPI

2.1.2 SWEAPI 對羥基自由基的清除作用在質(zhì)量濃度0～8.0 mg/mL 范圍內(nèi)，SWEAPI 對羥基自由基的清除能力隨樣液質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，見圖2。量效關(guān)系滿足logistic 方程，經(jīng)擬合并計算出其EC50為5.08 mg/mL，與3.04 mg/mL 的人工合成抗氧化劑2，6-二叔丁基對甲酚BHT 等效。

圖2 鐵釘菜水提醇沉上清液部分對羥基自由基的清除作用Fig. 2 Hydroxy radical scavenging effect of SWEAPI

2.2 SWEAPI 的抗酪氨酸酶活性

SWEAPI 對酪氨酸酶活性的影響見圖3。 圖3顯示，SWEAPI 具有較強(qiáng)的酪氨酸酶活性抑制作用，在質(zhì)量濃度為0.25～6.0 mg/mL 范圍內(nèi)，酶活抑制率為（24.51±2.04）%～（88.37±5.43）%，酶活抑制率隨樣液質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)， 呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)的量效關(guān)系（P＜0.01），經(jīng)非線性方程擬合并計算出其對酪氨酸酶活性的半抑制質(zhì)量濃度IC50為1.27 mg/mL。

2.3 鐵釘菜沖劑的制備工藝與產(chǎn)品質(zhì)量評價

2.3.1 鐵釘菜沖劑的制備工藝優(yōu)化以SWEAPI與可溶性淀粉、 甜蜜素、β-環(huán)狀糊精的比例用量為因子，設(shè)置三個水平進(jìn)行按L9（34）正交設(shè)計與實驗，實驗結(jié)果與綜合評分見表3，方差分析見表4。

圖3 鐵釘菜水提醇沉上清液部分對酪氨酸酶活性的抑制作用Fig. 3 Tyrosinase inhibiting effect of SWEAPI

表3 鐵釘菜沖劑制粒工藝正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment design and results of granulation process of Ishige okamurai granules

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

由表3～4 可以看出， 可溶性淀粉， 甜蜜素與SWEAPI 比例以及β-環(huán)狀糊精的使用量對沖劑制備均有顯著影響，影響大小依次為A＞B＞C，優(yōu)化的工藝條件為A1B1C2，即SWEAPI 與可溶性淀粉比例為1∶2，SWEAPI 與甜蜜素比例為30∶1，β-環(huán)狀糊精∶SWEAPI 比例為25∶100， 也就是SWEAPI∶可溶性淀粉∶甜蜜素∶β-環(huán)狀糊精為30∶60∶1∶7.5 的質(zhì)量配比。按此工藝條件鐵釘菜沖劑制粒容易、 溶化性較好、腥味少、甜味適中，具海藻類特有的氣味。

2.3.2 鐵釘菜沖劑的產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)實驗測得鐵釘菜沖劑的含水量約為6.3 %，水分要求符合GB/T 29602-2013[17]固體飲料不高于7 %的規(guī)定；細(xì)菌總數(shù)≤1 000 cfu/mL，符合保?。üδ埽┦称吠ㄓ脴?biāo)準(zhǔn)GB 16740-1997 規(guī)定的衛(wèi)生要求； 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為18.74%； 凱式定氮法測得蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.60%（考馬斯亮藍(lán)法測得SWEAPI 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.68%）；多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.53%（SWEAPI 多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.30%）。

2.4 鐵釘菜沖劑的α-葡萄糖苷酶抑制活性

鐵釘菜沖劑對α-葡萄糖苷酶活性的影響結(jié)果見圖4。 由圖4 可知，鐵釘菜沖劑對α-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)為較強(qiáng)的抑制作用，樣液質(zhì)量濃度0.50 mg/mL時，酶活抑制率可達(dá)87.95 %，在0.17～0.50 mg/mL的測量質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，量效滿足線性回歸方程y= 269.04x－50.185（R2-0.977，P＜0.01），呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），半抑制質(zhì)量濃度IC50為0.37 mg/mL。

圖4 鐵釘菜沖劑對α-葡萄糖苷酶活性的抑制Fig. 4 Inhibitory activity of Ishige okamurai granules against α-glucosidase

2.5 鐵釘菜沖劑對四氧嘧啶致糖尿病小鼠的的降糖作用

以四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型研究鐵釘菜沖劑的降糖作用，實驗結(jié)果見表5。 由表5 可知，與模型組比較， 釘釘菜沖劑各劑量組在觀測時程7 d 與14 d 內(nèi)均有一定的降血糖作用，差異具有極顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并且各劑量組降糖作用與鹽酸二甲雙胍組的降糖作用差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），14 d 時各劑量組間降糖作用差異也不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明鐵釘菜沖劑350 mg/kg的使用劑量已能有效發(fā)揮降血糖效果。

表5 鐵釘菜沖劑對四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型血糖值的影響（n=10）Table 5 Effect of Ishige okamurai granules on blood glucose value in alloxan-induced diabetic mice

一般來講， 在口服葡萄糖后，0.5～1 h 時血清葡萄糖水平升高達(dá)峰值，2 h 后恢復(fù)至空腹血糖值。 由表6 可看出，鐵釘菜沖劑各劑量組小鼠在口服葡萄糖后的血糖值在每一個時間點均顯著低于模型對照組（MC）血糖值（P＜0.01），說明鐵釘菜沖劑可以在短時間內(nèi)降低餐后血糖，并且其降糖效果與陽性藥物二甲雙胍相近（P＞0.05）。

表6 鐵釘菜沖劑對四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型糖耐量的影響（n=10）Table 6 Effect of Ishige okamurai granules on glucose tolerance in alloxan-induced diabetic mice

3 結(jié) 語

水提醇沉法（水醇法）系指在樣品的水提濃縮液中加入乙醇使達(dá)不同含醇量， 使得某些化學(xué)成分在醇溶液中溶解度降低而析出沉淀， 固液分離后分別獲得水提醇沉物與水提醇沉上清液部分， 該法可避免毒性較大有機(jī)溶劑的應(yīng)用，降低后續(xù)處理的成本，是精制水提液的簡單方法。 作者采用水醇法制得鐵釘菜水提醇沉物（EWEAPI） 與水提醇沉上清液部分（SWEAPI）， 經(jīng)DPPH 自由基清除反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，SWEAPI較之EWEAPI 具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，半效應(yīng)質(zhì)量濃度EC50為1.19 mg/mL； 清除羥基自由基的EC50為5.08 mg/mL，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。研究指出，海藻由于生境的特殊性使其具有與陸岸植物差異較大的化學(xué)組成，存在著多糖、多酚等各種抗氧化活性成分， 是天然抗氧化劑開發(fā)的潛在資源[18]。SWEAPI 的抗氧化活性可能與其較高的多酚含量（8.30%）有關(guān)。 多酚的酚羥基結(jié)構(gòu)往往使其具有較強(qiáng)的還原性和自由基捕捉活性，這種活性以及絡(luò)合酪氨酸酶分子中Cu2+的可能性還可使之具有抑制該酶活力的作用[19]。 我們的前期研究已經(jīng)證實鐵釘菜甲醇提取物具有較高的多酚含量與明顯的酪氨酸酶抑制作用[1]，本實驗中SWEAPI 亦表現(xiàn)出較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性，半抑制質(zhì)量濃度IC50為1.27 mg/mL。酪氨酸酶過量表達(dá)與人體雀斑、黃褐斑與老年班等色素沉著性疾病有關(guān)，SWEAPI 的抗氧化、 抗酪氨酸酶活性有望使之成為開發(fā)海藻源抗氧化型、美白護(hù)膚品的良好基料。

海藻在降血糖方面亦有獨特的功效，羊棲菜多糖[20]、多管藻總酚[21]、海帶多糖[22]、泡葉藻多糖與多酚組分[23]等均表現(xiàn)出降血糖活性。本實驗發(fā)現(xiàn)SWEAPI具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性， 提示其作為α-葡萄糖苷酶抑制劑開發(fā)的可行性。 研究指出α-葡萄糖苷酶抑制劑可延緩或阻礙碳水化合物的消化，延遲葡萄糖的吸收，其作用過程溫和持久、毒副作用小，為降餐后血糖的首選藥物[2]。 因此，我們選擇SWEAPI 與可溶性淀粉、 甜蜜素以及β-環(huán)狀糊精按比例進(jìn)行沖劑制備，經(jīng)正交設(shè)計與實驗優(yōu)化出SWEAPI∶可溶性淀粉∶甜蜜素∶β-環(huán)狀糊精為質(zhì)量比30∶60∶1∶7.5 的鐵釘菜沖劑制備工藝， 按此工藝條件制粒容易、溶化性較好、腥味降低、甜味適中。 該沖劑的體外α-葡萄糖苷酶半抑制質(zhì)量濃度IC50為0.37 mg/mL，350 mg/kg 灌胃給藥14 d 對四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的降糖作用與鹽酸二甲雙胍組（500 mg/kg）的降糖作用差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），并且能短時間內(nèi)降低餐后血糖，這說明鐵釘菜沖劑在長時間和短時間內(nèi)均能發(fā)揮一定的降血糖效果，其原因是否與α-葡萄糖苷酶抑制、清除自由基、激活胰島素分泌相關(guān)仍需深入的研究。