蔡燕飛， 徐棟生， 陳 蘊， 金 堅

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇無錫，214122）

目前我國感染乙型肝炎病毒的人口基數(shù)巨大，發(fā)展至肝纖維化的比例也在逐年升高。 早期肝纖維化可通過干預(yù)治療緩解或治愈，然而早期肝纖維化往往沒有臨床癥狀，容易錯失治療的最佳機會，患者在不知情的情況下長期不改變生活狀態(tài)， 從而造成肝纖維化的程度緩慢加重， 最終發(fā)展至代償性肝硬化[1]。到目前為止，除了肝臟移植，終末期肝硬化幾乎沒有更有效的治療方式[2]。 因此尋找緩解、治療肝纖維化的藥物，避免肝纖維化發(fā)展為肝硬化具有重要意義。

肝 細 胞 生 長 因 子 （hepatocyte growth factor，HGF）是一種主要由肝臟非實質(zhì)細胞分泌的多功能細胞因子，HGF 在體內(nèi)以單鏈前體被合成和分泌，其單鏈前體不具有任何生物學(xué)活性，需要通過絲氨酸蛋白水解酶水解，然后在二硫鍵作用下形成雙鏈分子才具有生物學(xué)活性[3]。 成熟的HGF 可以刺激多種組織器官修復(fù)，在多種疾病的研究中均具有一定的治療潛力，包括：肝纖維化、急性腎衰竭、慢性皮膚潰爛、肌萎縮側(cè)索硬化癥等。 已有研究顯示，HGF能促進肝臟再生以及抗肝纖維化，是具有治療作用的潛力藥物分子[3-4]。 有報道顯示，HGF 在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性較差，其藥物半衰期只有3～5 min，因此提高HGF 在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性是研究其應(yīng)用潛力的重要部分[5]。

作者所在研究室前期針對成熟HGF 的氨基酸分子結(jié)構(gòu)特點，對其酶水解部位進行了重新設(shè)計和定位改造， 即采用融合PCR 的方法將人HGF的第494 位的精氨酸R 定點突變成谷氨酸E， 改造后的蛋白質(zhì)不經(jīng)過活化過程就能保持活性，并在此基礎(chǔ)上利用融合蛋白技術(shù)將改造后的HGF 分子與人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）基因融合，獲得了長效重組基因HSA-HGF（R494E），通過CHO表達系統(tǒng)可獲得純度超過90%的HSA-HGF（R494E）蛋白及HSA 單體對照品[6-8]。 本研究中所用的HSA-HGF融合蛋白即研究室前期制備的HSAHGF（R494E）蛋白。通過對該融合蛋白的體內(nèi)抗肝纖維化分析，以期找到更佳穩(wěn)定的抗肝纖維化藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF 級BALB/c 小鼠：雄性，體質(zhì)量（25±2） g，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號為SCXK （蘇）2012-0004；SPF 級C57BL/6 小鼠：體質(zhì)量（20±2） g，購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號為SCXK（蘇）2012-0004。 動物倫理審查號為：JN.No20170106-20170315[19]

按照每籠5 只將小鼠分籠，在室溫25 ℃、光照12 h/d、濕度55 %的條件下飼養(yǎng)，喂食普通飼料與白開水，小鼠自由攝取食物。 小鼠處死均在麻醉狀態(tài)下操作。

1.1.2 主要試劑四氯化碳（CCl4）、玉米油：購自上海騰翌生物科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測試盒、蘇木素-伊紅（H-E）染液、Masson 染液： 均購自南京建成生物工程研究所； Eu3+標記時間分辨熒光檢測試劑盒：購自PE 公司；人HGF 對照品：購自R&D 公司；HSA 抗體：購自abcam 公司；水飛薊素：購自Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立以及給藥根據(jù)大量的文獻調(diào)研[9-10]，選擇合適的給藥方式設(shè)定實驗分組，具體分組及給藥方式如下：

BALB/c 小鼠隨機分為6 組，每組6 只。

1）正常組：按照2 μL/g 腹腔注射玉米油，每周給藥2 次，共6 周；

2） 模型組： 按照2 μL/g 腹腔注射體積比為25% 的CCl4玉米油溶液，每周給藥2 次，共6 周；

3） 陽性組： 按照2 μL/g 腹腔注射體積比為25% 的CCl4玉米油溶液構(gòu)建肝纖維化模型，同時按照100 μg/g 灌胃給予保肝藥水飛薊素， 每天給藥1次，共6 周。

4）HSA 組： 按照2 μL/g 腹腔注射體積比為25%的CCl4玉米油溶液6 周后，按照50 pmol/g 尾靜脈注射CHO 表達的HSA，每三天給藥1 次，共2 周；

5）HGF 組： 按照2 μL/g 腹腔注射體積比為25% 的CCl4玉米油溶液6 周后， 按照250 pmol/g尾靜脈注射HGF 對照品，每天給藥1 次，共2 周；

6）HSA-HGF 組： 按照2 μL/g 腹腔注射體積比為25% 的CCl4玉米油溶液6 周后， 按照250 pmol/g尾靜脈注射CHO 表達的HSA-HGF， 每三天給藥1次，共2 周。 HGF 與HSA-HGF 的濃度保持一致。

1.2.2 肝組織石蠟切片的制備肝組織用PFA 固定， 然后依次經(jīng)體積比為75%、85%、95%、100%、100%的酒精梯度進行組織脫水，脫水后浸入二甲苯透明，隨后浸蠟包埋，將包埋好的蠟塊切片，于45 ℃烘箱中烘干備用。

1.2.3 肝組織切片的HE 染色蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色是組織學(xué)技術(shù)的常規(guī)染色方法，能很好地反映正常組織與病變組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)差異，其具體操作步驟參照說明書。

1.2.4 肝組織切片的Masson 染色Masson 染色是顯示組織中纖維以及炎性因子的染色方法之一，膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，具體操作步驟參照說明書。

1.2.5 血清中肝功能指標的測定應(yīng)用商業(yè)化試劑盒檢測各組小鼠血清中的肝功能指標，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT 以及谷草轉(zhuǎn)氨酶AST，具體操作步驟參照說明書。

1.2.6 肝組織中α-SMA 和COLⅠ基因轉(zhuǎn)錄水平測定將肝組織剪碎后加入液氮速凍并充分研磨，然后加入Trizol 裂解液裂解， 提取總RNA 后進行qRTPCR，所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 Primer sequences for real-time RT-PCR

1.3 融合蛋白HSA-HGF 的體內(nèi)半衰期分析

1）融合蛋白HSA-HGF 標記Eu3+離子：將0.5 mg HSA-HGF 蛋白脫鹽換液至50 mmol/L 后備用。 按照Eu3+標記盒說明書， 將上述制備的0.5 mg HSA-HGF蛋白溶液與0.1 mg Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸（Eu3+-DTTA）溶液在30 ℃下攪拌反應(yīng)20 h。 反應(yīng)液經(jīng)過SepharoseCL-6B 柱層析后收集， 紫外可見分光光度計在280 nm 條件下檢測收集的蛋白質(zhì)峰，稀釋后分裝備用。

2）Eu3+離子標記融合蛋白HSA-HGF 的穩(wěn)定性檢測：標記Eu3+后的融合蛋白質(zhì)量濃度為200 mg/L，將蛋白質(zhì)稀釋10 倍后分成兩組，分別置于37 ℃與4 ℃保持72 h，Western blot 檢測樣品中蛋白質(zhì)的完整性，其中一抗為抗HSA 抗體（1：1000 稀釋）。

3）標記蛋白質(zhì)上Eu3+離子穩(wěn)定性檢測：標記Eu3+后的融合蛋白質(zhì)量濃度為200 mg/L，將蛋白質(zhì)稀釋10 倍后分成兩組， 分別置于37 ℃與4 ℃保持72 h。隨后樣品經(jīng)10 000 的超濾濃縮管濃縮；濾出液再次經(jīng)3 500 的超濾濃縮濃縮。 在濾出液中加入等體積的苯酚： 氯仿=1：1 混合液，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，重復(fù)抽提兩遍以去除蛋白質(zhì)。 運用時間分辨熒光法檢測去除蛋白質(zhì)樣品的吸收值，設(shè)置PBS 為陰性對照，設(shè)置20 mg/L 標記的融合蛋白為陽性對照。

4）融合蛋白HSA-HGF 的體內(nèi)半衰期檢測：將C57BL/6 小鼠分為三籠，每籠6 只，每籠小鼠分別按照200、100、20 ng/g 尾 靜 脈 注 射Eu3+離 子 標 記HSA-HGF。 在0.5、1、2、4、8、12、24、36、48 h 用斷尾的方式收集小鼠血液， 室溫靜置15 min，330 r/min離心20 min， 每只小鼠每個時間點可取10～20 μL血清，血清樣品進行時間分辨熒光免疫檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 融合蛋白HSA-HGF 的體內(nèi)抗肝纖維化分析

2.1.1 小鼠生長情況及肝臟觀察

1）生長情況：正常組小鼠生長正常，無死亡現(xiàn)象；模型組小鼠前兩周因CCl4毒性作用有約15%的死亡率，兩周后不再繼續(xù)死亡，但小鼠普遍精神不振，毛色暗淡，體質(zhì)重下降，建模后期，小鼠整體狀態(tài)有所回升。 HSA 組小鼠生長狀況與模型組相似，陽性組、HGF 組和融合蛋白HSA-HGF 組小鼠在給藥后生長狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，各項指標均有所回升。

2）肝臟表觀觀察：各組小鼠的肝臟表觀見圖1。正常組小鼠肝臟質(zhì)地柔軟，表面光滑，形態(tài)規(guī)整，呈健康的鮮紅色；模型組小鼠肝臟腫脹，表面呈明顯的顆粒狀，質(zhì)地變硬，無光澤；HSA 組小鼠肝臟與模型組類似，沒有明顯的表觀差異；陽性組、HGF 組和融合蛋白HSA-HGF 組小鼠肝臟顏色恢復(fù)鮮紅色，質(zhì)地變軟，表面變光滑，與模型組相比差異明顯，表明和陽性藥物水飛薊素一樣， HGF 和融合蛋白HSA-HGF 均具有一定的肝臟保護功效。

圖1 各組小鼠肝臟外觀Fig. 1 The liver appearance of each group

3）檢測各組小鼠的肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)：結(jié)果見表2。與正常組相比，模型組小鼠肝臟質(zhì)量顯著增加，肝臟指數(shù)也顯著升高，表明模型組小鼠肝臟處于代償性增生階段； 陽性組、HGF 組和HSA-HGF組經(jīng)過藥物干預(yù)作用后，小鼠肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)有著不同程度的下降， 與模型組相比有顯著性差異，表明藥物作用后，小鼠的肝臟出現(xiàn)了不同程度的恢復(fù)。 HSA 組與模型組相比，其肝質(zhì)量和肝臟指數(shù)均沒有顯著性差異。

表2 各組小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟指數(shù)Table 2 Liver weight and liver index of mice in each group（b±s）

2.1.2 肝臟病理學(xué)觀察各組小鼠肝臟石蠟切片經(jīng)HE 染色后結(jié)果見圖2。 正常組小鼠肝細胞形態(tài)正常、排列整齊、多個肝細胞有雙核現(xiàn)象，表明有絲分裂旺盛， 肝臟再生能力強；CCl4模型組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞間隙變大，呈絲狀，肝臟組織呈空泡樣變，大量的中性粒細胞聚集在血管周圍，表明炎癥嚴重；HSA 組小鼠肝臟與模型組類似， 肝細胞數(shù)目明顯減少，表明HSA 并沒有改善肝纖維化的效果； 與陽性組小鼠肝臟相比，CCl4模型組有較大改善， 趨近于正常組小鼠肝臟； HGF 組與HSA-HGF組小鼠肝臟與陽性組類似，肝臟再生能力強。

綜上表明，CCl4損傷肝臟一段時期后， 肝臟細胞被嚴重損壞，保肝藥水飛薊素可以明顯改善肝臟狀態(tài)。通過尾靜脈注射HGF 或其融合蛋白HSA-HGF都可以明顯促進CCl4損傷小鼠的肝臟恢復(fù)。本研究選用的每天注射250 pmol/g 人HGF 與每三天注射等摩爾的HSA-HGF 引起的治療效果類似， 該結(jié)果從側(cè)面證明了與單體藥物HGF 相比， 融合蛋白HSA-HGF 在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性有很大的提高。

圖2 各組小鼠的HE 染色Fig. 2 Effect of HE staining on each group

Masson 染色結(jié)果見圖3。 Masson 染色肝臟結(jié)構(gòu)與HE 染色的類似，Masson 染色主要用于觀察膠原沉積效果。 正常組的肝臟內(nèi)部幾乎沒有膠原沉積，肝臟狀態(tài)良好； 模型組小鼠肝臟細胞大量壞死，膠原堆積， 纖維化程度高， 與正常組相比差異明顯；HSA 組小鼠肝臟與模型組相似， 表明HSA 組沒有明顯的抗肝纖維化效果；陽性組的小鼠肝臟結(jié)構(gòu)恢復(fù)比較理想，壞死細胞減少，但是細胞間隙還存在較多膠原，表明水飛薊素對肝臟纖維化有一定的緩解作用；單體HGF 與融合蛋白HSA-HGF 組都有一定的緩解肝纖維化效果，肝臟整體結(jié)構(gòu)良好。

圖3 各組小鼠的Masson 染色Fig. 3 Effect of Masson staining on each group

2.1.3 肝功能指標檢測經(jīng)過CCl4持續(xù)損傷后，小鼠肝細胞出現(xiàn)大量壞死， 血液中的AST 和ALT 含量開始急劇升高。 與正常組相比，CCl4模型組的AST 和ALT 活性明顯提高。 而陽性組、HGF 組以及HSA-HGF 組肝功能指標比模型組下降， 具有顯著性差異， 而HSA 組與模型組相比無顯著性差異，表明融合蛋白HSA-HGF 具有良好的肝臟保護作用，見表3。

表3 血清肝功能檢測Table 3 Detection of blood liver function indexes（x±s）

2.1.4 肝纖維化標志物α-SMA 和COLⅠ的轉(zhuǎn)錄水平變化肝纖維化在發(fā)展過程中，會引起其標志物α-SMA 和COLⅠ的表達水平逐漸上升， 結(jié)果見圖4。兩種標志物的mRNA 水平在模型組中明顯升高，HSA 組與模型組表現(xiàn)相似， 而陽性組、HGF 組和HSA-HGF 組的結(jié)果表明三者均可以明顯下調(diào)α-SMA 和COLⅠ的轉(zhuǎn)錄水平，提示有較好的抗肝纖維化能力。

圖4 α-SMA 和COLⅠ的mRNA 水平檢測Fig. 4 mRNA level of α-SMA and COL

2.2 HSA-HGF 的體內(nèi)半衰期檢測

通過Eu3+離子鰲和標記蛋白HSA-HGF， 將標記后的融合蛋白以尾靜脈注射小鼠體內(nèi)后，通過檢測血清中Eu3+離子的含量來確定其體內(nèi)半衰期。 首先對該方法學(xué)的可靠性進行驗證，將標記后的蛋白質(zhì)稀釋10 倍， 分成2 組后分別置于37 ℃與4 ℃保持72 h，通過Western blot 檢測，結(jié)果顯示沒有任何降解片段，檢測到的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為130 000，與融合蛋白質(zhì)實際相對分子質(zhì)量相符，見圖5。說明Eu3+離子標記后沒有明顯影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

圖5 Eu3+離子標記蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的Western blot 檢測Fig. 5 Stability detection of Eu3 + labeled protein by western blot

將標記后的蛋白質(zhì)樣品稀釋10 倍， 然后分成兩組， 分別置于37 ℃與4 ℃保持72 h， 經(jīng)10 000與3 500 的超濾和蛋白質(zhì)抽提，去除蛋白質(zhì)，檢測溶液里殘留的Eu3+離子，見圖6。 結(jié)果顯示，待檢測溶液中的Eu3+離子非常少， 表明用此方法標記的Eu3+離子一旦標記到蛋白質(zhì)上就不容易產(chǎn)生脫離。

圖6 標記蛋白質(zhì)上Eu3+離子穩(wěn)定性的檢測Fig. 6 Stability detection of Eu3+on labeled protein.x±s,n=3.

實驗設(shè)置了200、100、20 ng/g 三個濃度梯度，通過一次性尾靜脈注射Eu3+離子標記的HSA-HGF蛋白， 分別在0.5、1、2、4、8、12、24、36、48 h 收集小鼠血液， 以血液中Eu3+標記的HSA-HGF 含量變化體現(xiàn)其體內(nèi)半衰期，結(jié)果見圖7。 HSA-HGF 融合蛋白的半衰期延長到3 h 左右。已有研究顯示HGF 單體分子的半衰期僅僅在3 min 左右[8-9]，相比較而言，融合蛋白HSA-HGF 的半衰期有顯著提高， 體現(xiàn)了優(yōu)越的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 語

本研究是在課題組前期研究基礎(chǔ)上，通過對融合蛋白的體內(nèi)抗肝纖維化及其體內(nèi)半衰期進行分析， 進一步評價了新型融合蛋白HSA-HGF 的穩(wěn)定性，挖掘其應(yīng)用潛能。 小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，融合蛋白可以明顯促進小鼠的肝臟恢復(fù)。 其中HGF 治療組用藥頻率為每天用藥， 而相應(yīng)的融合蛋白HSA-HGF 治療組為三天給一次藥， 兩者的抗肝纖維化效果相當，表明在低注射頻率下融合蛋白具有明顯提高肝功能以及抗肝纖維化的效果。 同時，小鼠體內(nèi)半衰期實驗進一步證明了融合蛋白的體內(nèi)半衰期顯著長于單體。 綜上表明， 融合蛋白HSAHGF 具有成為抗肝纖維化藥物的潛力。本研究也存在一些不足之處，如動物實驗設(shè)置的組別可進一步完善， 最好設(shè)置所有組別的低頻給藥和高頻給藥組；由于HGF 單體蛋白質(zhì)藥物價格昂貴，本實驗在檢測藥物半衰期時，未設(shè)置HGF 單體對照組，后期考慮通過CHO 表達系統(tǒng)制備HGF 單體蛋白質(zhì)藥物，從而進一步證明融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定優(yōu)勢；HSAHGF 想要真正成為抗肝纖維化藥物依然任重道遠，如該產(chǎn)品的肝特異性、無肝細胞毒性、安全性等均需要進一步的評估。