郁 莉， 付海田， 彭夢霞， 鄧 超， 陳敬華*

（1. 江南大學 工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122；3. 江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫214122）

微生物胞外多糖是自然界中來源比較豐富的一類生物大分子，因其獨特的理化性質和生物活性而被廣泛的應用于食品和非食品工業(yè)以及醫(yī)藥領域[1]。 近年來，隨著糖化學和糖生物學研究的深入，越來越多的新型微生物多糖相繼被發(fā)現(xiàn)。 盡管如此，真正接近工業(yè)化生產(chǎn)的卻僅有十幾種，其中提取純化工藝是微生物多糖工業(yè)化生產(chǎn)的制約因素之一[2]，微生物胞外多糖提取工藝直接影響多糖的質量以及生產(chǎn)成本。 因此，經(jīng)濟可行的提取工藝對提高多糖的市場競爭力和拓展多糖的應用領域具有現(xiàn)實意義。

膠質芽孢桿菌胞外多糖（BMPS）是膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）在微氮培養(yǎng)基中產(chǎn)生的一類類葡甘聚糖的酸性雜多糖[3]，因其具有良好的保水性、生物相容性、毒性低以及環(huán)境友好等優(yōu)點，廣泛應用于醫(yī)藥、化妝品、食品和環(huán)保等領域[4-6]，具有極大的開發(fā)價值和廣闊的市場前景。 隨著膠質芽孢桿菌胞外多糖在更多新領域的應用，其相關研究也越來越受到人們的關注。 目前，膠質芽胞桿菌胞外多糖的生產(chǎn)基本采用液體發(fā)酵工藝，其發(fā)酵液含有少量蛋白質且無色素產(chǎn)生， 但多糖含量較高，粘度較大，發(fā)酵液與菌體難以分離，給后續(xù)的分離純化帶來較大困難，從而導致產(chǎn)品收率低，生產(chǎn)成本高，對其推廣應用極為不利。

作者所在實驗室對B.mucilaginosusSM-01 發(fā)酵得到的發(fā)酵液進行預處理，利用稀釋和加入NaCl的方法降低粘度，同時加入適當?shù)墓柙逋磷鳛轭A吸附劑；在布氏漏斗中加入載片，預涂一定量的硅藻土作為自制的抽濾裝置，采用抽濾的方法可以通過一步法去除菌體和雜蛋白質。 對得到的濾液采用超濾濃縮提取胞外多糖，建立了一條高效可行且經(jīng)濟的胞外多糖提取純化工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）SM-01：保藏于中國菌種保藏中心，保藏號5766。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，尿素0.1，輕質CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.2，NaCl 0.2，瓊脂20；pH 7.0~7.2。

2）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，尿素0.1，輕質CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO40.2，NaCl 0.2；pH 7.0~7.2。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖60，尿素0.3，輕質CaCO33.0，MgSO4·7H2O 0.6，K2HPO40.2，NaCl 0.4；pH 7.0~7.2。

1.2 儀器與設備

UV-2550 型分光光度計： 日本島津公司；HeraeusMultifuge X3R 高速冷凍離心機： 美國Thermo 公司；THZ-C 型恒溫振蕩器：江蘇太倉市實驗設備廠；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海市躍進醫(yī)療器械一廠；硅藻土抽濾裝置：自制；真空冷凍干燥機：美國Labconco 公司；磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；SevenEasy 精 密pH 計： 上 海Mettler-ToLedo 公司；NDJ-1 型旋轉粘度計： 上海恒平科學儀器有限公司；Labscale TFF System 小型切向超濾系統(tǒng)： 美國Millipore 公司；BiomaxPolythersulfone 小型超濾膜包 （膜面積50 cm2， 截留相對分子質量10 000、200 000、500 000）：美國Millipore 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠質芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵將斜面保藏的菌種于平板上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h， 活化兩次，將活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h， 再將此種子液按4%的接種體積分數(shù)接入到30 L 的罐中，30 ℃、600 r/min、2 vvm發(fā)酵培養(yǎng)72 h 獲得發(fā)酵液。

1.3.2 發(fā)酵液的預處理發(fā)酵液于80 ℃下攪拌加熱20 min 進行菌體滅活， 同時加入6 mol/L 鹽酸適量除去發(fā)酵液中殘留的CaCO3， 由于發(fā)酵液中多糖含量較高而導致粘度較大，給后續(xù)的分離純化帶來一定困難， 降低發(fā)酵液的粘度有利于實現(xiàn)菌液分離。 通常對于含有聚電解質的發(fā)酵液可以通過添加鹽、稀釋體積、改變pH 值以及升高溫度的方式降低粘度。

1）無機鹽質量分數(shù)的選擇：鑒于BMPS 為陰離子聚電解質，無機鹽的加入對其分子鏈上的電荷具有屏蔽效應而使得分子鏈收縮，粘度降低。 考慮到培養(yǎng)基中無機鹽含量較低，加入適當?shù)臒o機鹽將有效降低發(fā)酵液的粘度。 取等體積發(fā)酵液，分別加入質量分數(shù)1%~5%的NaCl，攪拌均勻后在25 ℃下測定其粘度。

2）稀釋體積的選擇：將發(fā)酵液加入不同體積去離子水稀釋， 依次稀釋到原體積的1、2、3、4、5 倍，分別測量稀釋后發(fā)酵液粘度，將稀釋后的發(fā)酵液進行離心和抽濾，比較離心和抽濾兩種方法對去除菌體和蛋白質的影響。

3）pH 的選擇：發(fā)酵液的pH 對其粘度也有一定的影響， 但是pH 過高或過低都會破壞多糖的分子結構， 因此將發(fā)酵液的pH 調節(jié)為1、3、5、7、9、11，分別測試不同pH 條件下發(fā)酵液的粘度。

4）硅藻土添加量的確定：在等體積發(fā)酵液中分別加入10、20、30 g/L 硅藻土，充分攪拌，在相同條件下抽濾，比較硅藻土添加量對去除菌體和蛋白質的影響以及對多糖回收率的影響。

1.3.3 超濾條件的確定通常對濾液中多糖的提取可以采用醇沉法，但對于較大體積濾液的醇沉易造成醇類的損耗，增加成本，且在醇沉過程中很多小分子物質如鹽類也會隨之沉淀出來。 膜超濾分離技術作為一種提純和濃縮的技術， 具有設備簡單、對樣品無破壞、安全等優(yōu)點，易于工業(yè)放大，該技術應用在多糖的制備中已有不少報道[7-9]。

1）超濾膜的選擇：在25 ℃、0.1 MPa 條件下，采用三種超濾膜（10 000、200 000、500 000）對1 000 mL 濾液進行超濾濃縮， 考察膜通量隨超濾時間的變化，比較不同超濾膜的多糖截留率。

2）操作壓力的選擇：在25 ℃下，采用200 000超濾膜對濾液在不同操作壓力下（0.05、0.1、0.15 MPa）對1 000 mL 濾液進行超濾濃縮，考察不同操作壓力下膜通量隨時間的變化。

1.3.4 方法測定

1）發(fā)酵液粘度的測定：由于BMPS 發(fā)酵液粘度較高，因此選用4#轉子進行粘度檢測。 量取固定體積樣品倒入100 mL 燒杯中，置于數(shù)顯粘度計下，放入4#轉子，旋轉檢測粘度。

2）菌體量測定：發(fā)酵液經(jīng)去離子水稀釋一定倍數(shù)后，660 nm 下測定吸光度。

3）多糖質量濃度測定：總糖質量濃度測定采用苯酚硫酸法[10]；還原糖質量濃度測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[11]。

多糖質量濃度=總糖質量濃度-還原糖質量濃度

4）蛋白質質量濃度的測定：按照Bradford 方法[12]，牛血清白蛋白作為對照品。

5）多糖截留率計算：

式中，Vu指超濾濃縮體積；cu指超濾濃縮液中多糖濃度；Vi指料液體積；ci指料液中多糖濃度。

6）除菌率計算：

式中，F(xiàn)a指初始發(fā)酵液中菌體量；Fb指處理后發(fā)酵液中菌體量。

7）除蛋白質率：

式中，Pa指初始發(fā)酵液中蛋白質質量濃度；Pb指處理后發(fā)酵液中蛋白質質量濃度。

8）多糖回收率：

式中，Ma指濾液中多糖質量濃度；Mb指初始發(fā)酵液中多糖質量濃度。

9）熱原含量：熱原的測定采用鱟試劑法[13]，脂多糖作為陽性對照。

10）紫外光譜：配制適宜濃度的多糖水溶液，進行紫外全波長掃描。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵液預處理

2.1.1 無機鹽、溫度、pH 和稀釋倍數(shù)對發(fā)酵液粘度的影響經(jīng)過72 h 發(fā)酵得到白色粘稠初始發(fā)酵液，pH 約為6.5，多糖質量濃度較高（32.51 g/L），為提高菌體和發(fā)酵液的分離效果， 需要降低發(fā)酵液粘度。由圖1 可以看出，NaCl 的添加量、 溫度、pH 以及稀釋倍數(shù)均對發(fā)酵液粘度有影響，其中稀釋倍數(shù)對發(fā)酵液粘度的影響最為顯著（圖1（d）），隨著稀釋倍數(shù)的增大，粘度急劇下降，當稀釋倍數(shù)為5 倍時，粘度由6.95 Pa·s 降低為0.16 Pa·s。 這是由于在初始發(fā)酵液中多糖質量濃度較高，分子鏈較長，多糖分子互相纏結導致粘度增大， 隨著稀釋倍數(shù)的增大，多糖鏈間距變大，分子纏結減小，粘度下降。 其次對發(fā)酵液粘度有較大影響的是NaCl 的添加量 （圖1（a）），當發(fā)酵液中加入1%NaCl 時，發(fā)酵液粘度出現(xiàn)一定程度的降低；繼續(xù)添加時，粘度變化逐漸減??；當添加量大于3%時，粘度基本不再變化，發(fā)酵液顯示一定的抗鹽性。 由圖1（b）可以發(fā)現(xiàn)，溫度對粘度的影響并不顯著，當溫度升至50 ℃時，發(fā)酵液粘度僅降低到4.9 Pa·s，雖然升溫可以降低粘度，但是高溫易造成分子鏈的斷裂和構象的改變，通常提取純化時應盡量避免高溫條件。 圖1（c）顯示，酸性環(huán)境和堿性環(huán)境下發(fā)酵液粘度都有一定程度的降低，相比較酸性環(huán)境，堿性環(huán)境的粘度降幅更大，當pH 為11 時，粘度降為4.4 Pa·s。 考慮到過酸或過堿的環(huán)境都將造成多糖鏈上官能團的丟失以及多糖的降解，在純化過程中應選擇相對溫和的pH 條件。

圖1 不同因素對發(fā)酵液粘度的影響Fig. 1 Influence of different factors on the viscosity of the fermentation broth for B. mucilaginosus SM-01

可以發(fā)現(xiàn)， 通過升溫和改變pH 的方式對發(fā)酵液的粘度影響均不大，且發(fā)酵液具有一定的耐鹽性和耐酸堿性， 與黃原膠的耐酸堿和耐鹽性比較相似，在黃原膠發(fā)酵液的預處理過程中，稀釋法是常采用的降低粘度的方法。 考慮到向發(fā)酵液中添加NaCl 和稀釋發(fā)酵液均能降低發(fā)酵液粘度且不會影響多糖的化學結構， 且過量NaCl 的添加對粘度影響不大，因此采用3 g/dLNaCl 添加量，稀釋不同體積，考察不同稀釋倍數(shù)下，離心和硅藻土過濾這兩種方法對發(fā)酵液中除菌和除蛋白質的影響。

2.1.2 離心和抽濾對除菌率和蛋白質的影響在去除CaCO3的發(fā)酵液中加入3 g/dLNaCl，在不同的稀釋倍數(shù)下分別考察離心和抽濾兩種方式對發(fā)酵液除菌和除蛋白質的影響，結果見圖2。當采用抽濾的方法時， 稀釋倍數(shù)對除菌率的影響并不顯著，除菌率在80%左右，這是由于硅藻土涂層能夠有效截留以及吸附發(fā)酵液中的菌體， 即使稀釋倍數(shù)較小時，通過抽濾可以除去發(fā)酵液中大部分菌體；與之相反，稀釋對離心除菌效果影響比較明顯，當發(fā)酵液不稀釋或稀釋倍數(shù)比較小時， 盡管有鹽的存在，發(fā)酵液粘度依舊較大，菌體被多糖緊密包裹，除菌效果不理想，隨著稀釋倍數(shù)的增大，除菌率逐漸增大，當稀釋倍數(shù)達到5 倍時，離心和抽濾的除菌效果比較接近。 稀釋倍數(shù)對離心和抽濾的除蛋白質率影響皆不明顯，隨著稀釋倍數(shù)的增大，除蛋白質率略微增大，但離心并不能有效除去發(fā)酵液中的蛋白質，除蛋白質率基本維持在6%左右；而對于預涂了硅藻土的抽濾裝置來說，硅藻土涂層能較好的吸附蛋白質，達到除蛋白質的目的，除蛋白質率基本達到70%以上。 且離心的方法對設備的要求較高，較難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因此利用吸附性過濾介質對發(fā)酵液進行除菌和除蛋白質是一個經(jīng)濟簡便的方法。

盡管稀釋倍數(shù)對離心和抽濾的除菌率和除蛋白質率影響皆不顯著，但是其對抽濾通量和多糖回收率卻有較大影響。 由表1 可知，當稀釋倍數(shù)較小時，發(fā)酵液較為粘稠，在濾餅上容易形成凝膠層，因此，過濾通量較小，多糖回收率較低。 隨著稀釋倍數(shù)的增大，過濾通量和回收率逐漸增大，當稀釋倍數(shù)高于3 倍時， 多糖回收率基本維持在恒定水平，約達90%。 然而過高的稀釋倍數(shù)將會給后續(xù)濃縮帶來麻煩，因此抽濾時采用3 倍體積稀釋。

表1 稀釋倍數(shù)對濾液的菌體量、抽濾通量及多糖回收率的影響Table 1 Influence ofdilution ratio on filtration of fermentation broth

2.1.3 發(fā)酵液中硅藻土的添加量對發(fā)酵液的影響硅藻土除了作為過濾介質， 還是一種理想的吸附劑，能夠有效吸附菌體和雜蛋白質，且在發(fā)酵液中預先添加硅藻土還可以起到助濾劑的作用，抽濾效果更為理想，但過高的添加量通常會造成抽濾效率的下降和多糖的損失，因此應對硅藻土的添加量進行考察。 初始發(fā)酵液去除多余CaCO3， 加入3%NaCl，稀釋3 倍后，再加入一定量的硅藻土，充分攪拌后再進行抽濾。 由表2 可知，無硅藻土添加時濾液中蛋白質質量濃度已經(jīng)比較低（0.025 g/L），通過硅藻土抽濾基本可以去除發(fā)酵液中的少量蛋白質。當加入10 g/L 硅藻土后，濾液中菌體和蛋白質的質量濃度都有一定程度的降低，繼續(xù)加入硅藻土對去除菌體和蛋白質并沒有顯著的影響，但是過量硅藻土則會同時吸附多糖，使濾液中多糖的質量濃度下降，多糖損失增加。 因此采用10 g/L 的硅藻土預吸附， 再進行抽濾可以有效除去大部分菌體和蛋白質，經(jīng)過反復抽濾三次后，通過對濾液進行鏡檢可以發(fā)現(xiàn)無菌體存在， 說明菌體已經(jīng)被完全去除，經(jīng)檢測蛋白質質量濃度接近零， 多糖回收率可達76.4%。

2.2 超濾條件的確定

經(jīng)過抽濾所得發(fā)酵液仍含有無機鹽，殘?zhí)且约耙恍┛扇苄缘男》肿樱?且稀釋造成發(fā)酵液體積過大，采用醇沉法易造成乙醇的損失，增加成本，因此采用超濾的方法代替醇沉法對濾液進行濃縮提取。

表2 硅藻土的用量對發(fā)酵液抽濾的影響Table 2 Influence of different concentrations of diatomite onfiltration

2.2.1 不同截留相對分子質量膜的膜通量比較在0.1 MPa、25 ℃下用不同截留相對分子質量的超濾膜對抽濾得到的濾液進行超濾濃縮，比較膜通量的差異，實驗結果見圖3。 由圖3（a）可知，相同條件下，不同截留相對分子質量的膜對膜通量有較大的影響。 隨著截留相對分子質量的增大，膜通量增大，膜通量達到穩(wěn)定值的時間則越短，截留相對分子質量為500 000 的超濾膜在超濾20 min 后，膜通量迅速降低且趨于穩(wěn)定， 這可能是由于500 000 截留相對分子質量的濾膜膜孔較大，發(fā)酵液中的多糖分子進入膜孔的幾率較高，導致膜孔堵塞從而造成膜通量快速下降； 而對于截留相對分子質量為200 000和10 000 的超濾膜，由于膜孔小，大部分大分子被截留在外，膜堵塞的幾率小，故膜通量下降緩慢。

圖3 不同截留相對分子質量的膜對超濾的影響Fig. 3 Effect of membranes with different relative molecular weights cut-off on ultrafiltration

測定最終截留液中多糖質量濃度可以發(fā)現(xiàn)，截留相對分子質量為10 000 和200 000 超濾膜的多糖截留率接近，分別為96.4%和95.8%（圖3（b）），而500 000 的則略有降低（82.2%），對前兩者超濾后的濾液進行多糖質量濃度檢測，發(fā)現(xiàn)質量濃度基本接近于0， 即10 000 和200 000 的超濾膜能將發(fā)酵液中多糖組分基本截留。 而500 000 超濾膜由于截留相對分子質量較大，損失部分多糖。 因此，選取200 000的超濾膜進行超濾。

2.2.2 超濾壓力對膜通量的影響超濾壓力增大可以提高膜通量，加快超濾速度，同時也會加速某些組分在膜孔的沉積， 造成膜孔較小甚至堵塞，使膜通量下降，能耗增大，故選擇合適的超濾壓力對超濾過程至關重要。 由圖4 可以看出，壓力越大，初始膜通量越大，隨著超濾時間的延長，膜通量衰減的越快，當超過30 min 時，0.15 MPa 的膜通量接近0.1 MPa 的膜通量，相同的超濾時間內，0.05 MPa 膜通量衰減的最慢。 為了使超濾系統(tǒng)在較高的通量下運行且考慮到能耗和成本， 選取0.1 MPa 作為超濾壓力較合適。 在此條件下對濾液進行超濾，直至濾液中糖質量濃度為零且電導率不再變化，最終多糖回收率可達73.2%。

圖4 超濾壓力對超濾通量的影響Fig. 4 Effect of pressure on ultrafiltration flux

2.3 胞外多糖理化性質

將濃縮液透析凍干得到胞外多糖，其性狀為白色絮狀固體，無臭無味，易溶于水，難溶于大部分有機溶劑。 其將多糖溶于純水，經(jīng)紫外掃描見圖5。 僅在200 和230 nm 有吸收峰，在260 和280 nm 及附近沒有吸收峰，表明多糖中幾乎不含核酸和蛋白質等雜質。 同時對多糖進行熱源檢查，發(fā)現(xiàn)其內毒素含量低于標準限度0.25 EU/mL。

圖5 多糖水溶液的紫外掃描Fig. 5 UV spectrum of exopolysaccharide in pure water

3 結 語

膠質芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵液粘度較大，菌液分離困難，通過考察NaCl 的添加量、pH、溫度、稀釋倍數(shù)對發(fā)酵液粘度的影響， 發(fā)現(xiàn)將發(fā)酵液加入3%的NaCl 后稀釋3 倍可以有效降低發(fā)酵液粘度，通過在發(fā)酵液中加入10 g/L 的硅藻土作為預吸附劑，采用硅藻土吸附-抽濾的預處理方式代替離心能夠有效去除菌體和雜蛋白質， 經(jīng)過反復抽濾3 次后，經(jīng)鏡檢無菌體存在， 蛋白質質量濃度接近于零，多糖回收率達76.4%。選用截留相對分子質量為200 000的中空纖維膜在0.1 MPa 的操作壓力下進行超濾濃縮，基本能夠截留所有多糖組分，通過不斷濃縮除鹽得到最終產(chǎn)品，胞外多糖總回收率達73.2%，樣品中內毒素含量低于0.25 EU/mL。 因此通過硅藻土預吸附-抽濾方式可以一步除去發(fā)酵液中的菌體和蛋白質，同時通過超濾濃縮的方法代替醇沉提取胞外多糖，極大地節(jié)約了成本，此方法簡便經(jīng)濟，且適合工業(yè)化生產(chǎn)。