萬心怡， 徐學明， 吳鳳鳳

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

羅伊氏乳桿菌 （Lactobacillus reutrei） 是美國FDA 認證的一種安全和健康的食品補充劑，廣泛地存在于人、豬、家禽和其他動物的胃腸道中[1]。 在甘油溶液中，羅伊氏乳桿菌能轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)的羅伊氏細菌素（Reuterin）。 羅伊氏細菌素是一種由3-羥基丙醛的單體、水合物和環(huán)狀二聚物混合組成的天然廣譜抑菌物質(zhì)，在水溶液中存在動態(tài)平衡[2]。 羅伊氏細菌素能有效抑制革蘭氏陰性菌、陽性菌、酵母菌、霉菌和原生動物的生長[3]，可作為抑菌劑[4-7]、抗感染治療劑[8-10]、生物交聯(lián)劑[11]、新型生物材料[12]等。 目前已知能轉(zhuǎn)化甘油生成羅伊氏細菌素的微生物主要是桿菌屬（Bacillus），克雷伯菌屬（Klebsiella），檸檬菌屬（Citrobacter），腸桿菌屬（Enterobacter），梭菌屬（Clostridium）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）[13-17]。其中Klebsiella pneumonia和L. reuteri具有較高轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)羅伊氏細菌素的能力， 是研究較多的菌株。有研究指出： 在純的甘油溶液中，L. reuteri是已知微生物中產(chǎn)羅伊氏細菌素最強的菌株[3]。

目前利用L.reuteri生產(chǎn)羅伊氏細菌素的產(chǎn)量普遍小于150 mmol/L[8，18-20]。 Lüthi-Peng 等人在厭氧的條件下， 利用L.reuteri細胞轉(zhuǎn)化200 mmol/L 甘油生成170 mmol/L 的羅伊氏細菌素[21]，這是已有報道中較高的產(chǎn)量，但仍然達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求。 由于羅伊氏細菌素對細胞有毒害作用， 限制了體外高濃度的積累。 許多研究者在轉(zhuǎn)化過程中添加氨基脲[22-23]、亞硫酸氫鈉[24-25]，能有效降低這種影響，使羅伊氏細菌素在體外較高濃度積累，但這些方法也增加了產(chǎn)物分離純化的難度。 本研究旨在優(yōu)化L.reuteri生產(chǎn)羅伊氏細菌素的條件，提高羅伊氏細菌素的生產(chǎn)效率和產(chǎn)量，為今后大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

輔酶CoB12和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物（MBTH）：購于Sigma 公司；蛋白胨和酵母粉：購于Oxoid 公司；其他試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。

Shimadzu 高效液相色譜儀（LC-20AT）；DWS 厭氧培養(yǎng)箱； 北京普析紫外/可見分光光度計 （TU-1900）； 上海之信細胞破碎儀 （JYD-990L）；Thermo高速離心機。

1.2 靜息細胞的制備

細胞的制備方法參照Axelsson 等人[4]并有稍許修 改。 羅 伊 氏 乳 桿 菌 （Lactobacillus reuteri）ATCC53608 在MRS 培養(yǎng)基 （蛋白胨1%， 牛肉膏1%，酵母粉0.4%，葡萄糖2%，硫酸鎂0.02%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸三胺0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸錳0.005%，吐溫80 0.1%）中37 ℃靜置過夜培養(yǎng)活化。 活化兩次后的種子液以6%的接種體積分數(shù)接種到MRS 培養(yǎng)基中， 厭氧條件下靜置發(fā)酵培養(yǎng)24 h。發(fā)酵后的菌懸液經(jīng)5 000 r/min 離心10 min，并用磷酸緩沖液（pH 7.0）沖洗一次，以收集濕細胞。

1.3 羅伊氏細菌素的制備

將收集的濕細胞加入到7 mL 已滅菌的甘油溶液（100~500 mmol/L）中，在不同的設定溫度（20~50 ℃）中厭氧靜置培養(yǎng)（0.5~5 h）。 菌懸液經(jīng)10 000 r/min離心5 min，獲得的上清液在4 ℃下保存。

1.4 羅伊氏細菌素的檢測

羅伊氏細菌素的檢測方法參照Circle 等人[26]的方法。 由于羅伊氏細菌素沒有標品，而羅伊氏細菌素在酸性條件下能脫水生成丙烯醛，丙烯醛在濃鹽酸的作用下可與色氨酸進行縮合反應，生成紫色化合物，其最大吸收峰在560 nm 處。 因此可以用比色的方法來檢測羅伊氏細菌素的含量， 并且1 mol 的羅伊氏細菌素反應后生產(chǎn)1 mol 的丙烯醛， 故用丙烯醛標準品配置成0~0.7 mmol/L 的溶液，繪制標準曲線。 樣品檢測時，在10 mL 的離心管中加入1 mL的樣品、0.75 mL 的色氨酸試劑、3 mL 的濃鹽酸混勻，37 ℃下保溫20 min 后檢測在OD560的吸光值。

1.5 甘油脫水酶酶活的檢測

細胞懸浮液置于冰浴中超聲細胞破碎 （功率300 W，破壁1 s，間歇3 s，重復300 次）。 破碎后于4 ℃條件下10 000 r/min 離心5 min，上清液即為粗酶液。 甘油脫水酶活力的檢測方法參照Toraya 等人[27]的3-甲基-2-苯并咪唑腙法。 甘油在甘油脫水酶的作用下生成3-羥基丙醛， 生成的3-羥基丙醛與3-甲基-2-苯并咪唑腙（MBTH）反應生成腙類化合物，因此可以用比色的方法來檢測。 在5 mL 的離心管中加入100 μL 的2 mol/L 1，2-丙二醇，100 μL 的0.5 mol/L KCl，10 μL 的1.5 mmol/L 輔 酶B12，690 μL 的50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），100 μL 的粗酶液，37 ℃保溫10 min。 加入1 mL 的0.1 mol/L檸檬酸鉀緩沖液（pH 3.6）終止反應，再加入0.5 mL的新配0.1%MBTH，37 ℃保溫15 min。 最后加入1 mL 的蒸餾水，混合均勻后在305 nm 處測吸光值。 1個酶活單位定義為： 在37 ℃、pH 7.0 條件下，1 min催化生成1 μmol 丙醛所需的酶量。

粗酶液蛋白質(zhì)含量測定方法參照Bradford 法[28]，以牛血清蛋白為標品。

1.6 甘油濃度的檢測

甘油濃度通過高效液相色譜檢測， 色譜條件為：ZORBAX NH2柱，柱溫30 ℃，流動相乙腈∶水=9∶1（V/V），流速1 mL/min，示差折光檢測器。 樣品檢測前用0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌齡對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響

處于不同菌齡的細胞，它的生理狀態(tài)有一定的差異，這會顯著影響L. reuteri細胞內(nèi)甘油脫水酶的酶活。如圖1 所示，在厭氧發(fā)酵的早期階段，L.reuteri細胞內(nèi)甘油脫水酶的酶活非常低，14 h 后酶活顯著增加。當細胞處于穩(wěn)定期初期（26 h），細胞內(nèi)甘油脫水酶的酶活達到最大2.2 U/mg，之后穩(wěn)定在2 U/mg左右。 因此，使用穩(wěn)定期初期的細胞用于酶轉(zhuǎn)化，有利于提高羅伊氏細菌素的產(chǎn)量，這與Stevens 等人[24]的研究結(jié)果類似。

圖1 菌齡對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of cells age on the reuterin production

2.2 緩沖溶液濃度和pH 對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響

不同離子濃度會影響微生物的生理活性，因此研究不同緩沖溶液濃度對羅伊氏乳桿菌生產(chǎn)羅伊氏細菌素的影響。 如圖2（a）所示，以不同濃度的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀（PBS）作為甘油溶液的緩沖體系，控制pH 穩(wěn)定在6.0。 隨著緩沖溶液濃度的增加，羅伊氏細菌素的產(chǎn)量顯著增加。 當緩沖溶液濃度為0.08 mol/L 時，產(chǎn)量達到峰值。當濃度超過0.2 mol/L 后，羅伊氏細菌素濃度急劇下降。 這是因為當緩沖溶液濃度較低時，緩沖穩(wěn)定性相對較差，甘油溶液pH 不能穩(wěn)定在最適值； 當緩沖溶液濃度超過0.08 mol/L 后，細胞有一定的自我調(diào)節(jié)能力，而超過一定濃度后，溶液中離子強度過高，影響細胞的生理活性，細胞轉(zhuǎn)化能力急劇下降。

pH 值能顯著影響羅伊氏乳桿菌內(nèi)甘油脫水酶的活性， 不同微生物來源的甘油脫水酶的最適pH差異較大。 肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）和弗勞地枸櫞酸桿菌（C.freundiiDSM 30040）來源的甘油脫水酶，其最適pH 為8.5[29-31]。與其他來源的甘油脫水酶相比，L. reuteri來源的甘油脫水酶的最適pH 偏低。 馬會亮等人研究發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌（L. reuteriCG001）中的甘油脫水酶最適pH 在6.2 左右[32]。 因此研究了不同pH 值對L. reuteri生產(chǎn)羅伊氏細菌素的影響， 并比較了用緩沖溶液控制恒定pH 和只調(diào)節(jié)初始pH 的差異。分別利用磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖體系控制甘油溶液保持不同的恒定pH，以及用HCl、NaOH 把甘油溶液配置成不同的初始pH。分別檢測酶轉(zhuǎn)化1 h 后羅伊氏細菌素產(chǎn)量。如圖2（b）所示，在兩種不同的pH 調(diào)節(jié)方式下，當pH 6 時羅伊氏細菌素的產(chǎn)量都表現(xiàn)為最大值。 并且在弱酸的條件下，有利于L.reuteri生產(chǎn)羅伊氏細菌素。

圖2 不同緩沖溶液濃度和pH 對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects ofbuffer concentration and pH on the reuterin production

2.3 甘油濃度對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響

甘油作為催化反應的底物，其濃度對羅伊氏細菌素產(chǎn)量有顯著影響。 作者研究了不同濃度的甘油作為底物，催化1 h 后羅伊氏細菌素的產(chǎn)量，見圖3。甘油濃度低于300 mmol/L 時，羅伊氏細菌素的產(chǎn)量隨著甘油濃度的增加而增加，甘油轉(zhuǎn)化為羅伊氏細菌素的比例（甘油轉(zhuǎn)化率）均在50%以上。 之后隨著甘油濃度再增加，產(chǎn)量逐漸降低。 實驗表明，在一定范圍內(nèi)增加甘油濃度有利于羅伊氏細菌素產(chǎn)量的提高，由于甘油是羅伊氏乳桿菌的自殺底物，過高的甘油濃度會抑制菌體的生長。 因此，靜置培養(yǎng)時，300 mmol/L 的甘油濃度是最適合的底物濃度，同時在實際生產(chǎn)時可以采取流加甘油的形式，使甘油濃度維持在一定范圍，從而降低甘油對菌體的抑制作用。

圖3 甘油濃度對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of glycerol concentration on the reuterin production

2.4 酶轉(zhuǎn)化時間對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響

羅伊氏乳桿菌體內(nèi)存在代謝甘油的還原途徑[3，33]。甘油經(jīng)依賴輔酶B12的甘油脫水酶轉(zhuǎn)化為羅伊氏細菌素[30，34]，再經(jīng)依賴NAD+的1，3-丙二醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇[35-37]。 羅伊氏細菌素是甘油兩步代謝的中間產(chǎn)物，酶轉(zhuǎn)化時間能影響羅伊氏細菌素和副產(chǎn)物1，3-丙二醇的產(chǎn)量。 如圖4 所示，隨著時間的增加，羅伊氏細菌素的產(chǎn)量顯著增加，在1 h 后達到最大值154 mmol/L，之后隨著反應時間的延長產(chǎn)量逐漸降低。 由于甘油轉(zhuǎn)化成羅伊氏細菌素的途徑中，需要依賴輔酶B12的甘油脫水酶的催化，并且在催化的同時，輔酶B12的C-Co 鍵由于底物甘油的作用， 發(fā)生不可逆的斷裂形成5’-脫氧腺苷和烷基鈷氨素類似物，而甘油脫水酶與形成的烷基鈷氨素結(jié)合，致使甘油脫水酶失活[38]。推測隨著發(fā)酵時間的延長，胞內(nèi)的甘油脫水酶由于甘油的自殺抑制作用逐漸失活。 1 h 后大部分的甘油脫水酶失活，這時細胞不再能轉(zhuǎn)化甘油，而胞內(nèi)還殘留有NADH，羅伊氏細菌素經(jīng)依賴NADH 的1，3-丙二醇脫氫酶繼續(xù)轉(zhuǎn)化形成1，3-丙二醇；或是能轉(zhuǎn)化少量甘油，但產(chǎn)生羅伊氏細菌素的量低于羅伊氏細菌素反應生成1，3-丙二醇的量，這都能使得檢測到的羅伊氏細菌素濃度降低。

2.5 接種量對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響

甘油脫水酶作為反應的關(guān)鍵限速酶，其濃度直接決定催化反應速率。 在酶轉(zhuǎn)化過程中，反應速率表現(xiàn)為甘油溶液中的細胞濃度。 如圖5 所示，接種量從20 mg/mL 增加到80 mg/mL 時，羅伊氏細菌素產(chǎn)量呈線性增加； 接種量超過100 mg/mL 之后，隨著接種量的增加， 羅伊氏細菌素的產(chǎn)量反而減少。這可能是因為細胞濃度過高，細胞與甘油的接觸比表面積減小，導致傳質(zhì)阻力增大而酶轉(zhuǎn)化速率下降。

圖4 發(fā)酵時間對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of enzyme conversion time on the reuterin production

圖5 接種量對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect of cell concentration on the reuterin production

2.6 溫度對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響

溫度不僅能影響細胞內(nèi)甘油脫水酶的酶活，還能影響羅伊氏細菌素對細胞的毒害作用[20]，因此設置不同溫度，觀察溫度對細胞產(chǎn)羅伊氏細菌素的影響。圖6 表明，30 ℃時羅伊氏細菌素的產(chǎn)量最大，同時在較低的溫度下（20 ℃），還能保持較高的羅伊氏細菌的產(chǎn)量， 推測低溫有利于羅伊氏細菌素的積累。 此結(jié)果不同于Chen 等人報道的羅伊氏乳桿菌酶轉(zhuǎn)化的最佳溫度為37 ℃， 以及溫度對酶轉(zhuǎn)化影響的規(guī)律[18]，但與Doleyres 等人研究的溫度對羅伊氏乳桿菌ATCC 53608 的影響結(jié)果相似[20]。

圖6 溫度對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響Fig. 6 Effect of temperature on the reuterin production

2.7 正交實驗優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上，采用L16（45）正交表設計實驗，研究了緩沖溶液pH 值、甘油濃度、酶轉(zhuǎn)化時間、接種量、溫度對羅伊氏細菌素產(chǎn)量的影響，實驗安排及結(jié)果見表1-2。

由表2 可以看出，實驗的5 個因素對羅伊氏細菌素的產(chǎn)量都有極顯著影響（P＜0.01），影響羅伊氏細菌素產(chǎn)量因素的主次排序依次是：B（甘油濃度）＞D（接種量）＞C（時間）＞E（溫度）＞A（pH）。根據(jù)多重比較確定各因素的最佳水平組合為B4D4C4E3A4， 其中A3和A4無顯著性差異。 考慮到甘油脫水酶的最適pH 為6.2， 為了節(jié)約在實際應用中控制pH 使用的堿液的量，最佳pH 定為6.2。因此，全細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)羅伊氏細菌素的最佳條件為：甘油濃度400 mmol/L，接種量110 g/L，酶轉(zhuǎn)化時間120 min，溫度30 ℃，發(fā)酵pH 6.2。

對最佳條件進行驗證試驗，6 次獨立重復實驗，羅伊氏細菌素平均產(chǎn)量達到（241.2±3.4） mmol/L，較單因素實驗中最佳產(chǎn)量提高了30%。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factor level of orthogonal design

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance for the orthogonal design

3 結(jié) 語

研究發(fā)現(xiàn)，處于穩(wěn)定期初期的L. reuteri，其細胞內(nèi)甘油脫水酶的酶活最大，有利于轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)羅伊氏細菌素。 通過單因素和正交實驗的優(yōu)化，L.reuteri轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)羅伊氏細菌素的產(chǎn)量達到了（241.2±3.4） mmol/L，生產(chǎn)的效率和產(chǎn)量得到了顯著提高，為今后大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的指導。