李瑞勤， 王 瓊， 沈夢燁， 丁重陽*， 顧正華， 張 梁， 石貴陽

（1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國一種傳統(tǒng)的中藥材，其含有多種多樣的活性成分，包括糖類（ 多糖和低聚糖） 、三萜類、蛋白質類、多肽類、生物堿、微量元素等[1]。 靈芝多糖作為靈芝主要的生物活性成分之一，其顯著的藥理作用一直備受關注，如抗氧化、抗癌、抗炎和免疫調節(jié)活性[2-4]。 由于靈芝多糖的廣泛藥理作用，其生產技術已成為當前研究的熱點。 液體深層發(fā)酵技術生產靈芝多糖具有生產周期短、多糖組分和含量相對穩(wěn)定、主要組分和野生靈芝的基本一致等特點，成為獲取靈芝多糖的最有效方法[5]。 然而，傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化手段如培養(yǎng)條件的改變、誘導劑的添加等，已很難提高靈芝多糖的產量。隨著靈芝基因組序列的公布，利用分子生物手段對靈芝多糖合成途徑中的相關基因進行改造，已經成為當前提高多糖產量的有效方法[6-7]。 有研究報道，通過操縱生物合成基因的表達水平可提高胞外多糖產量[8]。

靈芝多糖的生物合成途徑涉及核苷酸糖前體的生物合成、重復單糖單元的裝配和聚合過程[9]。 在多糖生物合成途徑中，磷酸葡萄糖變位酶（PGM）是核苷酸糖前體的生物合成途徑中的關鍵酶。 該酶催化葡萄糖-6-磷酸與葡萄糖-1-磷酸的相互轉化，葡萄糖-6-磷酸進入分解代謝過程以產生能量， 而葡萄糖-1-磷酸是糖核苷酸的前體， 其被細胞用于合成各種多糖。 Tang 等人發(fā)現靈芝中PGM 的活性與胞外多糖（EPS）的產量呈線性關系[10]，然而pgm基因的過表達對多糖生物合成的調節(jié)機理仍有待闡明。 作者研究pgm基因的過表達對靈芝胞外多糖產量及胞內多糖質量分數的影響；通過考察多糖合成過程中相關酶基因轉錄水平的表達量和酶的活性，分析引起多糖產量變化的原因，以期進一步研究多糖生物合成調節(jié)機理并構建更有效的靈芝多糖高產菌株，為以后對靈芝多糖合成途徑中的其他關鍵酶的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

靈芝 （Ganoderma lucidum） 菌株、 大腸桿菌（Escherichia Coli）DH5α 和 農 桿 菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105： 由江南大學糧食發(fā)酵與工藝國家工程實驗室保藏；質粒pCAMBIA1301：購自北京天恩澤基因科技有限公司。

主要試劑：YNB（無氨基酵母）、MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）、AS（乙酰丁香酮，用DMSO 溶解）、Primer STAR 高保真酶 （TaKaRa）、SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒 （TaKaRa）、ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech）等。

1.2 培養(yǎng)基

靈芝種子及發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20 g，胰蛋白胨5 g，YNB （無氨基酵母）5 g，KH2PO44.5 g，MgSO4·7H2O 2 g；pH 6.0。

MM 培養(yǎng)基（1 L）： 葡萄糖10 mmol/L，KH2PO4和K2HPO4各10 mmol/L，NaCl 2.5 mmol/L，CaCl2·2H2O 0.7 mmol/L，FeSO4·7H2O 9 μmol/L，MgSO4·7H2O 2 mmol/L，NH4SO44 mmol/L。

AIM 培養(yǎng)基（1L）：在MM 培養(yǎng)基的基礎上添加丙三醇（甘油）5 g，MES（2-（N-嗎啡啉）乙磺酸）40 mmol/L，甘露醇0.6 mmol/L，用時添加200 μmol/L 的AS（乙酰丁香酮，用DMSO 溶解）。

1.3 方法

1.3.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)將于4 ℃保存的PDA 斜面上的靈芝種子于30 ℃恒溫箱中活化30 min， 從中挑取4 塊0.3 cm×0.3 cm 大小的活化菌種， 加入裝有80 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中， 搗碎，150 r/min、30 ℃培養(yǎng)10 d， 將種子液轉入含有攪拌轉子和玻璃珠的三角瓶中，磁力攪拌20 min。 按菌體濕質量0.5 g 接種量接種到裝有150 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，150 r/min、30 ℃培養(yǎng)，用于制備靈芝原生質體及靈芝原生質體再生的培養(yǎng)基為CYM 培養(yǎng)基[11]。

1.3.2 質粒 PJW -PGM 的構建以質粒pCAMBIA1301 為骨架，對其酶切位點XhoⅠ、PmlⅠ進行雙酶切。 以所提靈芝總DNA（CTAB 法）為模板，PCR 擴 增 各 目 的 基 因， 包 括Pgpd、pgm與MsdhB。其中Pgpd為強啟動子，MsdhB 由sdhB 基因定點突變獲得，可編碼有萎銹靈抗性（cbxr）的蛋白質[12]，因此將其作為篩選標記。表1 為各基因片段引物。 將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，篩選正確轉化子，大量提取質粒PJW-PGM。

1.3.3 農桿菌介導（ATMT）的DNA 轉化靈芝原生質體將構建好的待轉化的重組質粒PJW-PGM 轉化到農桿菌EHA105 后， 進行靈芝原生質體DNA片段的轉化。 靈芝原生質體的制備參考文獻[13]的方法進行，按照Yu 等人[14]的方法將重組質粒PJWPGM 轉到靈芝原生質體， 將轉化子轉移到含有2 μg/mL 萎銹靈的新鮮CYM 培養(yǎng)基， 以獲得穩(wěn)定的轉化體。

表1 各目的基因正反引物Table 1 Forward/Revere primer of target genes

1.3.4 生物量、 還原糖消耗、EPS 產量、IPS 質量分數的分析取發(fā)酵液中菌絲體10 000 r/min 離心10 min，收集菌絲體用蒸餾水洗滌三次，50 ℃干燥至恒質量，干重法測量靈芝生物量。 取發(fā)酵上清液，適當稀釋后，用DNS 法測定還原糖含量。 取發(fā)酵上清液加入4 倍體積95%的乙醇，醇沉過夜，10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，自然晾干，沉淀用蒸餾水溶解。 每個樣品取三個平行，苯酚硫酸法測定發(fā)酵液中的胞外多糖（EPS）產量。 將干燥的菌絲體于1 mol/L NaOH 溶液中沸水浴2 h，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，苯酚硫酸法測定靈芝胞內多糖（IPS）的質量分數。

1.3.5 實時測量pgm、pgi 的表達 （qRT-PCR）利用Trizol（TaKaRa，，Japan）提取靈芝總RNA，根據表1 中的引物， 利用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa）進行qRT-PCR。 由于16S 小核糖體RNA（rns）在靈芝的代謝過程中可穩(wěn)定表達，故選為內參基因[15]。在靈芝重組菌株的發(fā)酵過程中連續(xù)提取不同發(fā)酵時間的總RNA，進行qRT-PCR，將野生型的基因表達量作為對照。 每個樣品的每個基因做3 個重復，利用2-ΔΔCt法對基因的相對表達量進行分析。

1.3.6 PGM、UGPG、PGI 和PMI 比 酶 活 的 測 定UGPG（UDP-葡萄糖焦磷酸化酶）、PGI（磷酸葡萄糖異構酶）分別是磷酸葡萄糖變位酶在糖核苷酸合成和糖酵解途徑的下游關鍵酶，PMI（磷酸甘露糖異構酶）催化果糖6-P 與甘露糖-6-P 的相互轉換，使葡萄糖流入甘露糖走向的分支。 通過對其比酶活的測定，研究pgm基因的過表達對這其自身及相關酶的影響，測定方法按照文獻[16]進行。

2 結果與分析

2.1 靈芝轉化子的篩選

將三個基因片段Pgpd、MsdhB、pgm 以同源重組方式依次連接質粒pCAMBIA1301， 標記為PJWPGM，見圖1。 轉化大腸桿菌感受態(tài)，挑選轉化子菌落PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測，各片段均有清晰條帶，見圖2。選取轉化子搖瓶培養(yǎng)，提取質粒。將上述重組質粒轉化至根癌農桿菌EHA105 感受態(tài)細胞，經菌落PCR 鑒定，將其轉入根癌農桿菌，對靈芝原生質體進行轉化， 并涂布含有抗生素萎銹靈（cbx）的CYM 平板，挑取有cbx 抗性的靈芝菌落，結果見圖3。

圖1 重組質粒結構圖Fig. 1 Structure of the vector PJW-PGM

圖2 各基因片段PCR 擴增產物Fig. 2 PCR amplification products of each gene fragment

圖3 重組靈芝菌株原生質體的再生Fig. 3 Regeneration of transformed G.lucidum protoplasts

2.2 α-PGM 的過表達對靈芝生物量、 還原糖消耗、EPS 產量和IPS 質量分數的影響

目前關于靈芝多糖產量的研究，大多集中于發(fā)酵條件的變化對其產量的影響，例如在添加不同碳源的培養(yǎng)條件下，靈芝多糖的產量不同。 從分子水平對其合成途徑相關酶的基因進行改造的報道很少。 圖4 為以野生型靈芝為對照，重組型菌株PJWPGM 液態(tài)發(fā)酵過程中菌體生物量與還原糖消耗的變化規(guī)律。 結果顯示，靈芝重組菌株的菌體生物量與野生型相比有小幅度的提高，且其還原糖消耗呈對應趨勢，即重組型菌株對還原糖的利用和消耗速率比野生型菌株更快。 在菌體生長方面，重組菌株PJW-PGM 的生物量達到最高值8.1 g/L， 相比野生型的最高值7.1 g/L 高出14%。 在還原糖消耗方面，靈芝重組菌株相比野生型而言其利用速率更快，表現為還原糖的質量濃度下降速度更快，說明pgm的過表達可促進靈芝對碳源的吸收利用，這與菌株生物量的積累相一致。

在WT 和α-PGM 過表達菌株中測定IPS 質量分數和EPS 產量。 PJW-PGM 靈芝菌株中的IPS 質量分數和EPS 產量都明顯高于野生型，見圖5。結果顯示， 重組型菌株PJW-PGM 的EPS 和IPS 在整個發(fā)酵過程中的產量都高于野生型靈芝。 EPS 產量從第3 天開始迅速增加， 與其生物量的積累趨勢一致，在第5 天達到最高值0.71 g/L，比WT 的EPS 最高產量0.51 g/L 高出39%。 IPS 質量分數方面，野生型菌株最高達到19.35 mg/hg 菌體， 重組型菌株PJW-PGM 則達到21.01 mg/hg 菌體，相較于野生型菌株增加了9.1%。此結果表明pgm的過表達對EPS產量和IPS 質量分數的提高具有一致性。

圖4 發(fā)酵過程中WT 與PJW-PGM 靈芝生物量的積累及還原糖的消耗Fig. 4 Kinetic profiles of cell growth and residual sugarin the WT strain and the PJW-PGM strain of G. lucidum

2.3 α-PGM 的過表達對多糖合成途徑中相關酶基因表達量的影響

近年來，有一些關于使用RT-PCR 技術研究靈芝三萜類物質合成途徑中關鍵酶基因表達量的報道[17]，Xu 團隊[18]也有一些關于靈芝多糖合成途徑中關鍵酶基因表達量的報道，這些研究成果有效促進了靈芝及其他大型擔子菌的分子遺傳研究。 實時熒光定量PCR 是研究基因差異表達的一種快速、敏感、 可靠的技術。 用2-ΔΔCt方法對重組靈芝菌株PJW-PGM 與野生型菌株的α-pgm、pgi基因的表達差異進行分析， 研究α-PGM 的過表達對基因轉錄水平的影響。 圖6（a）為內參基因16rns的溶解曲線。 由圖可知，內參基因16rns峰型較好，峰值單一，特異性高。 圖6（b）為重組菌株PJW-PGM 不同發(fā)酵階段目的基因的mRNA 表達量，把野生型菌株基因的表達量作為參考，設為1，重組菌株pgm、pmi基因的相對表達量以增加倍數表示。

圖5 發(fā)酵過程中野生型與PJW-PGM 靈芝的EPS 產量和IPS 質量分數Fig. 5 Kinetic profiles of EPSproduction and IPS contentin the WT strain and the PJW-PGM train of G. Lucidum

結果顯示，發(fā)酵過程中PJW-PGM 菌株pgm基因的表達量最高為野生型的8.2 倍， 且呈現出先升高后降低的趨勢， 推斷其與菌體的生長狀態(tài)相應。由圖6 可知，pgm的過表達在整個發(fā)酵期間引起mRNA 的明顯積累，這與靈芝多糖的積累水平相一致，表明生物合成基因轉錄水平的增加可以增強靈芝菌株中的多糖生產。 PGI 作為糖酵解途徑的關鍵酶， 需要其大量表達使葡萄糖更多流向糖酵解途徑，為菌體生長提供能量。 在發(fā)酵過程的前期，即第2～4 天，兩種基因轉錄水平表達量并無較大差異，而發(fā)酵中期靈芝菌體處于多糖合成的旺盛期，這一階段pgm基因的表達量遠高于pgi，至發(fā)酵后期，由于靈芝菌體的二次生長，pgi基因的轉錄水平則高于pgm。 此結果表明，pgm基因的過表達不僅使其自身的轉錄水平高于野生型， 還可刺激其代謝途徑中pgi基因表達量的增加， 這一結果與重組型菌株PJW-PGM 生物量較野生型有所提高的結果一致。

圖6 PGM 的過表達對pgm、pgi 基因轉錄水平表達量的影響Fig. 6 Transcriptional levels of pgm、pgi gene in the pgm overexpressed strain

2.4 α-PGM 的過表達對多糖合成途徑中相關酶比酶活的影響

多糖的合成需要激活的核苷酸糖供體，葡萄糖是糖合成代謝的中心單糖，在一系列酶的催化作用下，葡萄糖可轉化合成多種核苷酸，再通過糖苷鍵的連接、空間聚合等過程合成多糖，并分泌到胞外[19]。 α-PGM 催化6-磷酸葡萄糖轉化為1-磷酸葡萄糖，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPG）催化PGM 的催化產物1-P-葡萄糖轉化為UDP-葡萄糖，而UDP-葡萄糖是參與多糖合成的重要核苷酸糖供體。PGI 催化6-磷酸葡萄糖與6-磷酸果糖的相互轉換；PMI 負責果糖-6-P 與甘露糖-6-P 的相互轉換，使葡萄糖流入甘露糖走向的分支。從分子水平對pgm、pgi的基因表達量進行了分析， 發(fā)現其表達水平上調，因此有必要通過對相關酶比酶活的分析，從翻譯水平研究pgm基因的過表達對靈芝多糖生物合成的影響。

由表2 可知，pgm過表達靈芝菌株的PGM 比酶活在發(fā)酵前期與野生型無明顯差異，第5 天其比酶活達到最高并高于野生型菌株11%，之后一直高于野生型。 UGPG 在多糖生物合成途徑中直接作用于PGM 的催化產物1-磷酸-葡萄糖，催化糖核苷酸供體的合成，重組菌株中UGPG 的比酶活明顯高于野生型菌株。 發(fā)酵過程中重組菌株PJW-PGM 中PGI的比酶活一直高于野生型，其在多糖合成途徑中的下游酶PMI 的比酶活較野生型也有一定程度提高。這說明發(fā)酵過程中α-PGM 的過表達不僅使其自身的比酶活高于野生型，還可刺激多糖生物合成途徑中其他相關酶比酶活的增加， 這一結果與之前的qRT-PCR 結果相一致。 有研究發(fā)現，靈芝多糖合成途徑中相關酶比酶活的提高與其基因轉錄水平的表達量呈正相關[20]，此結論與本實驗的結果相一致。此結果表明pgm基因的過表達可影響靈芝多糖合成途徑中相關酶基因轉錄水平的表達量和相關酶的活性，從而提高多糖產量。

表2 α-PGM 的過表達對合成途徑中相關酶比酶活的影響Table 2 Effect of the pgmoverexpressed strain of G. Lucidumon related enzymes activities

3 結 語

近年來，靈芝多糖的研究已得到了國內外相關研究者的普遍關注，并展開了大量的藥理學、提取分離和結構鑒定等研究工作，但靈芝多糖的生物合成代謝途徑卻鮮有報道。 在靈芝多糖產量方面，目前的發(fā)酵調控主要以傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化和外源物質的調控為主。 由于靈芝多糖的生物合成信息較少，很大程度限制了代謝工程或途徑工程手段在靈芝多糖發(fā)酵調控中的應用。 作者通過重組構建PGM過表達的靈芝菌株， 研究α-PGM 的過表達對靈芝液體發(fā)酵的影響，發(fā)現其可促進生物合成途徑中相關酶轉錄水平的表達量及比酶活的提高，從而提高靈芝多糖的產量。 這一結論將為今后研究其他關鍵合成酶基因提供參考依據。