柴玲 陳明生 袁健童 馮軍 劉布鳴

摘?要：該文在前期研究的基礎(chǔ)上，以擬草果的甲醇粗提液為原料，研究擬草果總黃酮成分的純化方法以及考察擬草果總黃酮的抗炎活性。結(jié)果表明：通過(guò)靜態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)，篩選出HP-20為純化擬草果總黃酮的最佳大孔吸附樹(shù)脂;以吸附率、解吸率等參數(shù)為指標(biāo)，考察上樣液和洗脫液的質(zhì)量濃度、體積、流速等因素對(duì)純化工藝的影響，確定最佳工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度0.5 mg·mL-1、上樣體積流量4 mL·min-1、上樣體積15 BV、洗脫劑乙醇濃度70%、洗脫流速2 mL·min-1、洗脫劑用量10 BV，在此條件下純化的總黃酮保留率為65.48%;通過(guò)檢測(cè)獲得的擬草果總黃酮對(duì)脂多糖刺激的小膠質(zhì)BV2細(xì)胞中白介素（IL）-6水平的影響，發(fā)現(xiàn)其可顯著下調(diào)炎癥因子IL-6的表達(dá)，具有一定的抗炎活性。

關(guān)鍵詞：擬草果， 總黃酮， 大孔吸附樹(shù)脂， 純化工藝， 抗炎活性

中圖分類號(hào)：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）12-1706-06

Abstract：This article aimed to develop a separation and purification method for the total flavonoids of the methanol extraction from Amomum paratsao-ko， and the anti-inflammatory activity of total flavonoids from A. paratsao-ko was also investigated. The static adsorption-elution test screened out the HP-20 as the best macroporous adsorption resin for purifying the total flavonoids of A. paratsao-ko. The comprehensive scores of adsorption and desorption rates were used as the indexes to determine the optimal purification process parameters as follows：the concentration of the upper column sample solution 0.5 mg·mL-1， the sample flow rate 4 mL·min-1， and the upper column volume?15 BV， 70% ethanol 10 BV for elution， the elution flow rate 2 mL·min-1. The obtained total flavonoids of A. paratsao-ko were evaluated for the anti-inflammatory activity via examination of the effect on IL-6 in LPS-stimulated BV2 microglial cells. The results showed that the total flavonoids of A. paratsao-ko significantly inhibit IL-6 expression in the LPS-stimulated BV2 microglial cells.

Key words：Amomum paratsao-ko， total flavonoids， macroporous adsorption resin， purification process， anti-inflammatory activity

擬草果又稱白草果或廣西草果，是壯藥中的一個(gè)常用品種，為姜科豆蔻屬植物擬草果（Amomum paratsao-ko）的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于亞熱帶氣候的廣西、云南等?。▍^(qū)），在廣西主產(chǎn)地為那坡縣壯族集居地，靖西、隆林等地也有零散分布（廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，1984;中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1992）。擬草果收載于廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第3卷）（廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，2017），壯民將其作為草果的代用品用于烹飪提香或者民間藥用，用以治療反胃嘔吐、脘腹脹滿冷痛、痰飲、積食、瘧疾等癥。擬草果雖然在廣西有著長(zhǎng)期的民間使用基礎(chǔ)和廣闊的種植面積，但目前針對(duì)其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)方面的研究卻較少（覃蘭芳等，2014;黃云峰等，2014），對(duì)擬草果的開(kāi)發(fā)利用也相對(duì)滯后。

本課題組前期藥理活性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，擬草果具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用（柴玲等，2017，2018）。其后通過(guò)化學(xué)成分研究，從擬草果中分離得到以鼠李檸檬素為代表的、較大量系列的黃酮醇類化合物（柴玲等，2018）。因此，推測(cè)擬草果中的主要抗炎活性成分為黃酮類化合物。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，研究擬草果黃酮類成分的純化工藝，并采用體外試驗(yàn)，探討擬草果總黃酮的體外抗炎活性，以期為擬草果的綜合開(kāi)發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器：UV2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津儀器公司）;KQ-5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;RE-5210A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;HH-S恒溫水浴鍋（常州萬(wàn)科儀器科技有限公司）。試劑：鼠李檸檬素對(duì)照品（試驗(yàn)室前期制備獲得，純度≥98%）;AB-8、D101型大孔吸附樹(shù)脂（北京慧德易科技責(zé)任有限公司）;HP-20型大孔吸附樹(shù)脂（北京綠百草科技發(fā)展有限公司）;水為超純水;甲醇、無(wú)水乙醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司）;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（美國(guó)GBICO公司）;BDTM Cytometric Bead Array （CBA） Human Inflammation Kit、BDTM Cytometric Bead Array （CBA） Mouse Inflammation Kit試劑盒（美國(guó)BD公司）。

擬草果果實(shí)于2017年9月采集于廣西那坡縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所黃云峰副研究員鑒定為姜科豆蔻屬植物擬草果（Amomum paratsao-ko S. Q. Tong et Y. M. Xia）。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備?取擬草果粗粉200.3 g，加入2 000 mL甲醇搖勻，水浴回流60 min后過(guò)濾，濾液減壓蒸干并用適量甲醇溶解定容至1 000 mL，作為母液，4 ℃下保存?zhèn)溆?。取母? mL用甲醇稀釋至50 mL，作為供試品溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制?精密稱取鼠李檸檬素對(duì)照品1.26 g，置10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。用移液管依次移取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，并用甲醇分別稀釋至10 mL，制成5.04、10.08、15.12、20.16、25.20、30.24 mg·mL-1濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取上述系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在紫外359 nm處按濃度由低到高依次測(cè)定吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定?取供試品溶液，按照1.2.2的方法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.2.4 樹(shù)脂預(yù)處理?先取三種不同型號(hào)（HP-20、AB-8、D101）的大孔樹(shù)脂，加入適量95%乙醇浸泡，攪拌使分散均勻后靜置24 h;再按傅春燕等（2015）對(duì)大孔樹(shù)脂的處理方法進(jìn)行預(yù)處理;最后用95%乙醇浸泡儲(chǔ)存，試驗(yàn)使用前用蒸餾水洗至無(wú)醇味。

1.2.5 大孔樹(shù)脂純化擬草果總黃酮的工藝優(yōu)化?以不同類型樹(shù)脂對(duì)擬草果總黃酮的吸附率和解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)篩選出最適合擬草果總黃酮純化的樹(shù)脂類型，并采用單因素試驗(yàn)考察不同的上樣條件和洗脫條件，對(duì)擬草果總黃酮的純化工藝進(jìn)行優(yōu)選。

1.2.5.1 靜態(tài)吸附和解吸附試驗(yàn)篩選最優(yōu)大孔樹(shù)脂?取按1.2.4項(xiàng)下預(yù)處理好的三種大孔樹(shù)脂，分別以蒸餾水洗去乙醇，抽濾并吸干其表面水分后各稱取3.0 g，精密稱定，分別置于3個(gè)250 mL錐形瓶中;另取1.2.1項(xiàng)下適量母液蒸干，用水溶解混勻，配制成0.975 mg·mL-1、60 mL的上樣液各3份，加入上述裝有三種樹(shù)脂的錐形瓶中，置全溫振蕩培養(yǎng)箱中，30 ℃、120 r·min-1震蕩吸附24 h，待大孔樹(shù)脂吸附飽和后，過(guò)濾并吸取一定體積的上清液，按1.2.3項(xiàng)方法測(cè)定其總黃酮濃度，以此推算樹(shù)脂對(duì)總黃酮的吸附率;過(guò)濾后大孔樹(shù)脂放入250 mL錐形瓶中，加入50 mL 95%乙醇溶液進(jìn)行解吸附，于24 h后吸取一定體積的乙醇溶液，測(cè)定其中的總黃酮含量，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)總黃酮的解吸率。

1.2.5.2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響?按每份35 mL的濕體積量取HP-20型大孔樹(shù)脂共6份，濕法裝柱;按1.2.5.1項(xiàng)分別配制濃度為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg·mL-1的上樣液100 mL，以1 mL·min-1的流速上樣。分別收集流出液，蒸干后用甲醇溶解并定容至50 mL，測(cè)定流出液的總黃酮濃度，計(jì)算不同濃度上樣液中總黃酮在HP-20樹(shù)脂中的吸附率。

1.2.5.3 上樣流速對(duì)總黃酮吸附率的影響?按每份35 mL濕體積量取HP-20型大孔樹(shù)脂共4份，分別裝柱，按1.2.5.1項(xiàng)配制4份濃度均為0.5 mg·mL-1、100 mL的上樣液，分別以1、2、3、4 mL·min-1的流速上樣，按1.2.5.2項(xiàng)收集流出液并測(cè)定其總黃酮濃度，考察不同上樣流速對(duì)總黃酮在HP-20樹(shù)脂中吸附率的影響。

1.2.5.4 上樣體積的考察?量取35 mL濕體積的HP-20樹(shù)脂裝柱;按1.2.5.1項(xiàng)配制0.5 mg·mL-1的上樣液700 mL （20 BV），以4 mL·min-1的流速連續(xù)上樣，按2～3 BV的柱體積收集流出液共9份，測(cè)定每份流出液中的總黃酮濃度，計(jì)算泄露百分?jǐn)?shù)。

1.2.5.5 洗脫液濃度對(duì)樹(shù)脂解吸率的影響?量取35 mL濕體積的HP-20樹(shù)脂4份，分別裝柱;按1.2.5.1項(xiàng)配制0.5 mg·mL-1的上樣液525 mL，以4 mL·min-1流速上樣，上樣完成后先用350 mL（10 BV）蒸餾水洗脫，再以2 mL·min-1的洗脫流速用濃度分別為30%、50%、70%、90%的乙醇依次洗脫10 BV。分別收集不同濃度乙醇洗脫下來(lái)的流出液，濃縮后測(cè)定其總黃酮含量并計(jì)算解吸率。

1.2.5.6 洗脫液流速對(duì)樹(shù)脂吸附率的影響?量取35 mL的HP-20樹(shù)脂4份，分別裝柱;取0.5 mg·mL-1的上樣液525 mL，以4 mL·min-1流速上樣，上樣完成后先用10 BV蒸餾水洗脫，再用70%乙醇10 BV分別以1、2、3、4 mL·min-1的流速洗脫，分別收集不同洗脫流速下的洗脫液，測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算解吸率。

1.2.5.7 洗脫液用量的工藝考察?量取35 mL濕體積的HP-20樹(shù)脂，濕法裝柱;取0.5 mg·mL-1的上樣液525 mL，以4 mL·min-1流速上樣，蒸餾水洗脫后，以525 mL、70%乙醇和2 mL·min-1的洗脫流速連續(xù)洗脫，分批收集洗脫液，每35 mL（1 BV）為1份。以洗脫體積（BV）為橫坐標(biāo)，每份洗脫液中的總黃酮含量（mg·mL-1）為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

1.2.5.8 驗(yàn)證試驗(yàn)?根據(jù)1.2.5.2～1.2.5.7單因素試驗(yàn)確定的最佳上樣和洗脫條件，以樹(shù)脂對(duì)擬草果總黃酮的保留率為考察指標(biāo)進(jìn)行平行試驗(yàn)（n=3），驗(yàn)證試驗(yàn)的可重復(fù)性。

1.2.6 抗炎活性試驗(yàn)?鼠源神經(jīng)小膠質(zhì)BV2細(xì)胞，采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10% FBS，1%青霉素和1%鏈霉素），于37 ℃，含5% CO2，飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液，以0.25%胰酶消化傳代，試驗(yàn)前將細(xì)胞接種于12孔板，接種細(xì)胞數(shù)每1 mL為106個(gè)，孵育6～9 h后換液加入LPS或DMSO，2 h后加入10 μmol·L-1濃度的化合物孵育24 h，收集細(xì)胞上清進(jìn)行CBA檢測(cè)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2?結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附和解析附試驗(yàn)篩選最優(yōu)大孔樹(shù)脂

表1展示三種不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)擬草果總黃酮吸附及解吸附試驗(yàn)的篩選結(jié)果。從表1可以看出，HP-20型大孔樹(shù)脂對(duì)總黃酮的吸附率在三種樹(shù)脂中屬中等水平，但其解吸率在三者中最高。因此，在后續(xù)研究中以HP-20型大孔樹(shù)脂為最優(yōu)樹(shù)脂進(jìn)行工藝考察。

2.2 HP-20型大孔樹(shù)脂對(duì)擬草果總黃酮純化工藝的單因素考察

2.2.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響?表2展示上樣不同濃度的上樣液后流出液中總黃酮濃度的變化。從表2可以看出，隨著上樣液中總黃酮濃度的增加，HP-20樹(shù)脂對(duì)其吸附率也逐漸增加，上樣濃度為0.5 mg·mL-1時(shí)，吸附率達(dá)到最大值98.30%。上樣液濃度再次增加時(shí)，吸附率開(kāi)始下降，可能是由于水液飽和，上樣液呈絮狀沉淀較多，樹(shù)脂無(wú)法吸附，從而導(dǎo)致水洗時(shí)沉淀顆粒隨水洗液洗出，吸附率下降。因此，確定最佳上樣濃度為0.5 mg·mL-1。

2.2.2 上樣流速對(duì)總黃酮吸附率的影響?表3展示不同的上樣流速對(duì)總黃酮在HP-20樹(shù)脂中吸附率的影響。從表3可以看出，上樣流速為2.0～4.0 mL·min-1時(shí)，隨著上樣流速增大吸附率逐漸增大。上樣流速為1.0 mL·min-1時(shí)，吸附率較高的原因可能是由于流速慢吸附時(shí)間長(zhǎng)，或是流速慢水液停留時(shí)間長(zhǎng)，在樹(shù)脂上表面形成沉淀和大顆粒沉淀物，水洗不完全。綜合考慮認(rèn)為，縮短上樣時(shí)間，提高上樣效率，確定4.0 mL·min-1為最佳上樣流速。

2.2.3 上樣體積對(duì)流出液總黃酮濃度的影響?由圖1可知，隨著上樣量的增加泄露百分?jǐn)?shù)呈增大趨勢(shì)，其中上樣體積為15 BV時(shí)泄露百分?jǐn)?shù)趨于平穩(wěn)，上樣體積達(dá)17 BV時(shí)泄露百分?jǐn)?shù)逐漸下降，但仍未達(dá)到泄露點(diǎn)，即泄露百分?jǐn)?shù)10%。考慮到水液保存時(shí)間較短，且試驗(yàn)缺乏自動(dòng)上樣設(shè)備，上樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響試驗(yàn)效果。因此，確定525 mL，即15 BV的柱體積為最佳上樣體積。

2.2.4 洗脫液乙醇的濃度對(duì)總黃酮在HP-20樹(shù)脂中解吸率的影響?由表4可知， 隨著洗脫劑濃度的增大洗脫率也逐漸增大， 洗脫劑濃度為70%、90%時(shí)洗脫率變化不大，為節(jié)省乙醇用量，確定70%乙醇濃度為最佳洗脫濃度。

2.2.5 洗脫流速的考察?表5展示不同洗脫流速下的總黃酮在HP-20樹(shù)脂中的解吸附效果。由表5可知，隨著洗脫流速的增大洗脫率先緩慢增大，隨后呈下降趨勢(shì)，當(dāng)洗脫流速為2.0 mL·min-1時(shí)洗脫率最大。因此，取2.0 mL·min-1為最佳洗脫流速。

2.2.6 洗脫液乙醇用量的考察?圖2展示洗脫液乙醇的用量（洗脫體積）對(duì)流出液總黃酮濃度的影響。由圖2可知，洗脫含量隨洗脫量增加呈先增大后下降的趨勢(shì)，在洗脫量達(dá)10 BV時(shí)洗脫含量開(kāi)始下降并趨于洗脫終點(diǎn)。因此，在盡可能節(jié)省洗脫劑的條件下，確定10 BV（350 mL）為最佳洗脫量。

2.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)?稱取濕體積35 mL的HP-20型大孔樹(shù)脂濕法上柱，加樣0.5 mg·mL-1的上樣液15 BV到色譜柱中，調(diào)節(jié)上樣流速為4 mL·min-1，上樣完成后用1 BV的蒸餾水洗滌，接著用70%乙醇10 BV進(jìn)行洗脫。平行3次試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮保留率分別為67.86%、64.29%、64.29%，平均值為65.48%，RSD值為3.15 %，表明重復(fù)性較好。

2.3 抗炎活性試驗(yàn)

擬草果總黃酮對(duì)炎癥因子IL-6表達(dá)的影響見(jiàn)表6。從表6可以看出，擬草果總黃酮提取物能顯著抑制炎癥因子IL-6表達(dá)，具有一定的抗炎活性。

3?討論

弱極性、非極性的吸附樹(shù)脂對(duì)黃酮類化合物具有較好的提取性能（Wu et al.， 2015）。因此，本研究中，我們選擇了三種不同型號(hào)和極性的大孔樹(shù)脂對(duì)擬草果中的總黃酮進(jìn)行了吸附和解吸試驗(yàn)， 其中非極性的HP-20樹(shù)脂在吸附率和解吸率上均優(yōu)于另外兩種樹(shù)脂。因此， 確定了HP-20型大孔樹(shù)脂是分離純化擬草果總黃酮的最優(yōu)樹(shù)脂。

通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定了擬草果總黃酮純化的最佳工藝條件：上樣濃度為0.5 mg·mL-1、上樣體積為15 BV、上樣體積流速為4 mL·min-1、乙醇洗脫濃度為70%，洗脫體積流速為2 mL·min-1、乙醇洗脫用量為10 BV。擬草果提取液經(jīng)HP-20型大孔樹(shù)脂純化后，總黃酮含量由9.735 mg·g-1提升至平均50.526 mg·g-1，提高了5.19倍，表明本研究中大孔樹(shù)脂純化工藝對(duì)擬草果總黃酮的純化效果較好。

體外抗炎試驗(yàn)結(jié)果表明，擬草果總黃酮提取物可顯著抑制炎癥因子IL-6表達(dá)，具有一定的抗炎活性。本研究結(jié)果可為擬草果藥材資源的開(kāi)發(fā)利用及提高其應(yīng)用價(jià)值提供數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯?蔣巧媛）