冀夢(mèng)瑤，于秀劍，杜萬(wàn)年，史秋梅，吳同壘

(河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北 秦皇島，066600)

1 由多殺性巴氏桿菌引起的疾病及其毒力因子

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是許多脊椎動(dòng)物口咽部的常在菌，也是引發(fā)某些疾病的機(jī)會(huì)性致病菌，可引起有蹄動(dòng)物的出血性敗血癥、禽霍亂、豬萎縮性鼻炎和兔鼻炎[1]。此外，Pm還會(huì)與其他致病微生物混合感染，比如牛呼吸道綜合征和地方流行性肺炎。Pm也是人類軟組織創(chuàng)傷后繼發(fā)感染的常見(jiàn)病原，在犬貓咬傷的一半病例中會(huì)出現(xiàn)。

出血性敗血癥是一種有蹄類動(dòng)物的急性傳染病，給許多國(guó)家造成重大經(jīng)濟(jì)損失。Pm首先侵入扁桃體，逐步擴(kuò)散至全身，并迅速發(fā)展為致死性敗血癥，臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、水腫、呼吸困難、膿毒、廣泛出血。一旦發(fā)病，動(dòng)物迅速死亡，死亡率接近100%[2,3]。禽霍亂是一種急性傳染病，發(fā)病急，死亡率高，通過(guò)呼吸道感染禽類，繼而發(fā)展為全身性感染，急性和亞急性臨床表現(xiàn)主要為高熱、呼吸困難、口鼻分泌物增加、雞冠肉髯呈現(xiàn)青紫色，而慢性型主要是關(guān)節(jié)和鼻竇的炎癥。豬萎縮性鼻炎是導(dǎo)致豬鼻甲骨萎縮和鼻中隔彎曲的疾病。多殺性毒素(Pasteurellamultocidatoxin，PMT)是導(dǎo)致萎縮性鼻炎的主要致病因素，PMT是一種146 ku的蛋白質(zhì)，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，捕獲宿主細(xì)胞的唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂表面受體和帶正電荷的磷脂來(lái)發(fā)揮致病效應(yīng)。另外，PMT蛋白的羧基端部分通過(guò)激活G蛋白及其耦聯(lián)的宿主細(xì)胞信號(hào)通路，抑制成骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致病畜出現(xiàn)鼻甲骨萎縮[4]。

目前有關(guān)Pm毒力因子的報(bào)道較為少見(jiàn)，僅有少數(shù)幾個(gè)毒力因子被鑒定，例如脂多糖(LPS)是多殺性巴氏桿菌最為關(guān)鍵的毒力因子，在其致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。PMT是引起萎縮性鼻炎的菌株的關(guān)鍵毒力因子；莢膜是引起出血性敗血癥和禽霍亂的菌株的關(guān)鍵毒力因子[5]；絲狀凝集素樣黏附素是引發(fā)禽霍亂和牛肺炎的菌株的毒力因子。此外，LPS還可刺激宿主適應(yīng)性免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[6]。LPS也是對(duì)菌株進(jìn)行血清學(xué)鑒定時(shí)的重要依據(jù)，是多種Pm分型系統(tǒng)的主要鑒別抗原[7,8]。筆者在此重點(diǎn)綜述Pm的LPS的結(jié)構(gòu)及其在所致疾病、誘導(dǎo)宿主免疫和菌株分型中的作用，以期為完整的致病機(jī)制確認(rèn)、診斷試劑以及疫苗研發(fā)提供一定參考。

2 多殺性巴氏桿菌LPS的共同特性

Pm的細(xì)胞壁主要由LPS組成，LPS與細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境、毒力強(qiáng)弱和刺激宿主免疫反應(yīng)等方面密切相關(guān)。LPS主要由4個(gè)部分組成，即：脂質(zhì)A，多糖內(nèi)核，多糖外核和糖側(cè)鏈(O-抗原)。脂質(zhì)A是LPS的主要功能成分，是能被宿主細(xì)胞Toll樣受體(TLR4)識(shí)別的重要病原相關(guān)分子模式(PAMP)，可刺激產(chǎn)生先天性免疫應(yīng)答。當(dāng)機(jī)體受到感染時(shí)，脂質(zhì)A可與細(xì)胞質(zhì)中的脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合，形成LPS/LBP，后者為吞噬細(xì)胞表面的CD14受體識(shí)別，之后吞噬細(xì)胞將LPS/LBP遞呈給已經(jīng)耦聯(lián)了TLR4的髓樣分化因子2(MD2)，隨后TLR4寡聚化觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和NF-κB通路活化，導(dǎo)致促炎因子的表達(dá)和釋放，從而參與炎癥反應(yīng)[9]。當(dāng)細(xì)菌侵入黏膜時(shí)，炎癥部位附近未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞結(jié)合LPS/LBP，形成復(fù)合物(通過(guò)CD14/MD2受體)，激活TLR4，使樹(shù)突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的抗原呈遞細(xì)胞，然后遷移到局部淋巴結(jié)啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，進(jìn)而激活一系列抗原特異性T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)B細(xì)胞群的活化增殖，產(chǎn)生針對(duì)LPS的特異性抗體。由于內(nèi)源性和外源性抗原的交叉遞呈作用，細(xì)胞免疫應(yīng)答也可被激活，但這取決于入侵細(xì)菌的特性以及CD4+T輔助細(xì)胞是否被募集到感染部位[10]。

脂質(zhì)A決定了Pm血清型，結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)取決于其?；湐?shù)、長(zhǎng)度、磷酸化和糖基化的變化。20世紀(jì)70年代，科學(xué)家利用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和多克隆抗體將Pm菌株分為16種不同的血清型，人們把這種分型方式稱為Heddleston分型系統(tǒng)，它代表16種不同結(jié)構(gòu)的LPS分子[11]。由于未解析Pm菌株LPS的精確分子結(jié)構(gòu)，因此目前無(wú)法證實(shí)Heddleston血清型與LPS結(jié)構(gòu)和宿主免疫應(yīng)答之間的關(guān)系。對(duì)已知確定的16種Heddleston血清型菌株LPS的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，能夠幫助研究者更加清楚的了解特定的LPS結(jié)構(gòu)在毒力和宿主免疫刺激中的作用。

3 LPS多糖內(nèi)核的分類

LPS多糖內(nèi)核區(qū)域和多糖外核區(qū)域的結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定用于細(xì)菌鑒定，例如Heddleston血清型的分類。大多數(shù)革蘭陰性菌的內(nèi)核區(qū)域?yàn)樘墙Y(jié)構(gòu)，其組成為自3個(gè)與脂質(zhì)A連接的3-脫氧-D-甘露-辛-2-酮磺酸殘基(Kdo)開(kāi)始，到葡萄糖殘基止，再往外是多糖外核。根據(jù)Kdo的修飾基團(tuán)不同，Pm菌株可分為2種多糖內(nèi)核，稱為糖型A和糖型B[12]。糖型A和B主要是由Kdo轉(zhuǎn)移酶KdtA和Kdo磷酸化酶KdkA的相對(duì)活性決定，并可相互轉(zhuǎn)換。到目前為止檢測(cè)的菌株中，大部分菌株的LPS多糖內(nèi)核是糖型A類型的，很少一部分是糖型B類型。

4 LPS多糖外核的分類

Pm多變的多糖外核決定了Pm的血清型。15種不同的LPS多糖外核可分為16種Heddleston 血清型，這15種多糖外核由8種基因座編碼而成，它們分別是L1～L8。

含有L1基因座的菌株包括Heddleston 1和14血清型。對(duì)從感染的禽類中分離的48株P(guān)m菌株進(jìn)行的分析確定，有11株(23%)包含L1基因座。對(duì)這些菌株中的6個(gè)菌株進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示5株菌形成了全長(zhǎng)L1型LPS，一株菌產(chǎn)生截短的L1型LPS；有研究表明[13]，由于PCho基因的喪失，菌株表達(dá)截短的L1型LPS，并導(dǎo)致其對(duì)禽類體內(nèi)抗菌肽的敏感性增加，不利于細(xì)菌的存活。上述現(xiàn)象提示，攜帶全長(zhǎng)L1型LPS的菌株一旦進(jìn)入禽類體內(nèi)后有著一定的存活優(yōu)勢(shì)。為了進(jìn)一步的驗(yàn)證，利用LPS多糖外核截短表達(dá)的突變菌株對(duì)雞進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，只能在注射部位檢測(cè)到突變菌株，血液中沒(méi)有檢測(cè)到，這也說(shuō)明了突變菌株感染后不能進(jìn)入血液造成敗血癥[14]。

含有L2基因座的菌株為Heddleston 2和5血清型，其LPS多糖外核含有庚糖殘基，根據(jù)庚糖殘基上是否連接磷酸乙醇胺，可將L2 LPS菌株分為Heddleston 2血清型(不攜帶磷酸乙醇胺)和Heddleston 5血清型(攜帶磷酸乙醇胺)。導(dǎo)致有蹄類動(dòng)物的溶血性敗血癥的菌株，均為Heddleston 2血清型。

攜帶L3基因座的菌株為Heddleston 3和4血清型，兩種血清型之間存在一定的交叉反應(yīng)，是引起禽霍亂的主要菌株類型。L3基因座表達(dá)的LPS多糖外核長(zhǎng)度變化多端，可自然發(fā)生截短表達(dá)。盡管L3基因座編碼的LPS結(jié)構(gòu)上模擬宿主鞘糖脂，但禽類在免疫接種攜帶L3基因座的菌苗后，能夠產(chǎn)生保護(hù)性抗體。

含有L4 LPS基因型的菌株為Heddleston 6和7血清型，代表菌株為P2192和P1997。Heddleston 6血清型菌株P(guān)2192表達(dá)全長(zhǎng)L4多糖外核，Heddleston 7血清型菌株P(guān)1997表達(dá)高度截短的L4多糖外核。研究顯示，引起禽霍亂的Pm攜帶L4多糖外核的幾率不高。從火雞體內(nèi)分離的Heddleston 16型菌株P(guān)2723是已知攜帶L8基因座的唯一1株P(guān)m[15]。

含有L5基因座的菌株為Heddleston 9血清型菌株，代表菌株為P2095。菌株P(guān)2095多糖外核含有鼠李糖(Rha)和3-乙酰氨基-3,6-二脫氧-D-葡萄糖(Qui3NAc)殘基，這是迄今為止鑒定出的唯一含有鼠李糖或Qui3NAc的Pm[16]。

含有L6基因座的菌株為Heddleston10，11，12和15血清型，代表菌株分別為P2100，P908，P2237和P1573，該基因座含有7個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因。Heddleston 12血清型菌株P(guān)2237產(chǎn)生最長(zhǎng)的L6型LPS，其余血清型均為不同長(zhǎng)度截短表達(dá)多糖外核的菌株。

含有L7基因座的菌株為Heddleston 8和13血清型，代表菌株分別是P1581和P1591。P1581菌株產(chǎn)生更長(zhǎng)的LPS，外核包含1個(gè)葡糖糖殘基，2個(gè)半乳糖殘基，1個(gè)磷酸乙醇胺殘基和1個(gè)磷酸甘油殘基，而P1591菌株的多糖外核缺少磷酸甘油殘基[17]。

5 LPS在滅活疫苗和減毒活疫苗中的作用

目前已經(jīng)研發(fā)了一系列Pm疫苗來(lái)預(yù)防相關(guān)疾病，包括減毒活疫苗、滅活苗兩大類。滅活苗產(chǎn)生的免疫保護(hù)與LPS的多糖外核相關(guān)，具有明顯的血清型特異性(同源保護(hù))[18]。而減毒活疫苗可為宿主提供針對(duì)多種血清型菌株的免疫保護(hù)(異源保護(hù))[19]，減毒活疫苗產(chǎn)生的免疫保護(hù)不依賴LPS的多糖外核結(jié)構(gòu)。例如，用含有VP161(L1親本菌株)的滅活苗免疫雞可提供較高的保護(hù)效果，但對(duì)LPS多糖截短表達(dá)的菌株感染保護(hù)力大大降低；親本菌株P(guān)1059 制備的滅活苗可為具有相同LPS結(jié)構(gòu)的菌株P(guān)1059gatG突變株和菌株P(guān)M1422提供相同保護(hù)，但對(duì)于LPS多糖外核不同的菌株，保護(hù)力較低。這些數(shù)據(jù)有力地表明，使用滅活苗的重要前提是，疫苗菌株與疾病病原體產(chǎn)生的相同或幾乎相同的LPS結(jié)構(gòu)，如果LPS結(jié)構(gòu)不同，則不會(huì)提供保護(hù)性作用[20]。

與滅活苗不同，多殺性巴氏桿菌活疫苗可以針對(duì)多種血清型菌株產(chǎn)生免疫保護(hù)，不依賴于LPS結(jié)構(gòu)，可為宿主提供更為廣泛的免疫保護(hù)。進(jìn)一步的深入研究表明，多殺性巴氏桿菌活疫苗株可刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，Th17細(xì)胞幫助宿主募集嗜中性粒細(xì)胞，清除黏膜表面的細(xì)菌，但是這種作用不能用于區(qū)分不同類型的LPS[21,22]，這可能是活疫苗能夠?yàn)椴煌逍桶褪蠗U菌提供免疫保護(hù)的重要原因。

6 展 望

多殺性巴氏桿菌的脂多糖(LPS)是其主要的毒力因子，在感染宿主的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，不同血清型的菌株LPS的結(jié)構(gòu)差異較大，與其宿主嗜性和致病特征具有密切聯(lián)系。在多殺性巴氏桿菌感染宿主時(shí)，LPS還可模擬宿主分子結(jié)構(gòu)，以維持在宿主體內(nèi)的存活，另外，可刺激宿主產(chǎn)生以炎癥反應(yīng)為主要特征的免疫應(yīng)答，這可能是細(xì)菌發(fā)揮其致病性的原因之一。針對(duì)多殺性巴氏桿菌的滅活疫苗，需要有相同的或者相似的LPS結(jié)構(gòu)，才可以發(fā)揮保護(hù)作用，弱毒疫苗可以產(chǎn)生廣泛的保護(hù)。筆者對(duì)多殺性巴氏桿菌的LPS的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了簡(jiǎn)要總結(jié)，但是限于多殺性巴氏桿菌的研究較少，仍有很多問(wèn)題亟待進(jìn)一步研究。多殺性巴氏桿菌LPS的脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)到底是怎么樣的,是否其在酰基鏈長(zhǎng)度和修飾上不同于其他細(xì)菌的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)；脂質(zhì)A是否可通過(guò)TLR4/MD-2途徑激活宿主細(xì)胞的炎癥通路，誘導(dǎo)炎性因子表達(dá)和釋放；為什么環(huán)境中多殺性巴氏桿菌多糖內(nèi)核以A型為主，多糖內(nèi)核為B型的菌株較少見(jiàn)；多殺性巴氏桿菌是否同其他細(xì)菌一樣，也能利用自身的LPS多糖內(nèi)核抵御宿主補(bǔ)體的殺傷；是否可通過(guò)分子模擬等方式降低宿主的免疫識(shí)別和防御能力。這些問(wèn)題可為多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制、疫苗和診斷試劑研發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)，需進(jìn)一步揭示。