周 靜,李 智，周 玉，丁文文，楊雪琴

（1. 荊楚理工學院醫(yī)學院，湖北荊門 448000；2. 湖北省荊門市東寶區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)務部，湖北荊門 448000；3. 湖北省荊門市第一人民醫(yī)院醫(yī)務部，湖北荊門 448000）

根據2018年《全球癌癥公報》，宮頸癌依然是嚴重威脅女性健康的一類疾病，其發(fā)病率和死亡率在全球女性位居第四位[1],我國宮頸癌的發(fā)病率目前占亞洲國家的22%，因此對宮頸癌基礎和臨床研究仍是緊迫的任務[2]。目前國內外關于上皮細胞黏附分子（epithelial cellular adhesion molecule，Ep-CAM）在宮頸癌的研究尚不多見，本研究通過對宮頸組織分類和分層進行Ep-CAM聯合細胞增殖核抗原67（Ki67）檢測，以期在分子水平探索對宮頸癌有價值的標志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年2月～2018年12月在荊門市第一人民醫(yī)院和荊門市東寶區(qū)人民醫(yī)院進行宮頸組織活檢的患者234例，均符合倫理委員會要求。年齡25～73歲，平均年齡46.3±8.6歲，其中宮頸癌94例（浸潤性鱗癌50例，腺癌44例），鱗狀上皮內病變（squamous intraeithelral lesion,SiL）90例（其中LSiL 45例，HSiL 45例），正常宮頸組織50例。宮頸癌患者IA～ⅡA期49例，ⅡB～Ⅳ期45例。所有病例均經病理科高級職稱醫(yī)師確診。

納入標準：所有研究對象均為初診，已婚女性，年齡25～75歲。宮頸原發(fā)性癌，LSiL和HSiL，正常宮頸組織（除外慢性宮頸炎）。研究對象均知情同意。

排除標準：年齡＜25歲或＞75歲，宮頸轉移性癌，病理診斷不夠明確者。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要儀器：SHANDON PATHCENTRE全自動密封式脫水機，MICROM石蠟包埋機（EC300），MICROM HM340E切 片 機，MICROM HMS760X染色機，奧林巴斯BX43顯微鏡。

1.2.2 實驗試劑：由AB公司提供的Ep-CAM試劑盒（批號2018091301）；DAKO公司提供的 Ki67試劑盒（批號20058907）；二抗選自德國Leica novocastra NovoLink聚合物檢測系統(tǒng)RE7280-K檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 操作步驟：每個病例切4張石蠟切片，其中1張進行常規(guī)HE染色，核實診斷。另外3張進行免疫組織化學染色，具體操作：（1）福爾馬林固定組織；（2）脫水、包埋、切片3～4μm；（3）染色：脫蠟，抗原修復，滴加抗體，顯色、襯染、封片。

1.3.2 Ep-CAM陽性判斷[3]：觀察每高倍鏡視野下陽性細胞平均數的百分比，計分標準為：0%～5%計0分，6%～25%計1分，25%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；染色強度依據多數陽性細胞的顯色特征為標準計分：無顯色計0分，顯淡黃色計1分，顯棕黃色計2分，顯棕褐色計3分。上述兩項分值相加得出結果，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。其中(-)和(+)記為低表達組，(++)和(+++)記為高表達組。

1.3.3 Ki67陽性判斷[4]：細胞胞核顯示棕黃色顆粒視為陽性細胞。每張切片選取一個高倍鏡視野，計算3張切片的平均陽性率。宮頸癌選取癌細胞浸潤區(qū)域。若陽性細胞數＜6%為（-），陽性細胞數6%～28%為（+），陽性細胞數29%～78%為（++），陽性細胞數＞78%為（+++），(++)和(+++)記為高表達組。

1.3.4 宮頸癌的臨床分期：參照Figo2018宮頸癌分期。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0進行統(tǒng)計學分析。計數資料用百分數表示，采用卡方檢驗，計算χ2值和P值，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 不同狀態(tài)宮頸組織Ep-CAM，Ki67的陽性表達 見表1，圖1。Ep-CAM，Ki67在宮頸癌組織的陽性率與LSiL組織比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=139.000，121.473，P=0.000）,與 正 常 宮頸組織比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=144.000，133.164，P=0.000）；Ep-CAM在HSiL組 織 中的陽性率與宮頸癌組織比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.326，P=0.124），而Ki67組 織 與 宮 頸癌組織陽性率差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13.099，P=0.000）。

表1 不同狀態(tài)宮頸組織Ep-CAM,Ki67的陽性表達[n（%）]

2.2 宮頸癌組織不同病理類型Ep-CAM，Ki67高表達率的比較 結果見表2，圖2。分別對宮頸癌組織中浸潤性鱗癌和腺癌兩種病理類型進行Ep-CAM，Ki67高表達率的比較Ep-CAM差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Ki67無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表2 宮頸浸潤性鱗癌和腺癌Ep-CAM，Ki67高表達率的比較[n（%）]

2.3 宮頸癌不同臨床分期Ep-CAM，Ki67高表達率的比較 見表3。94例宮頸癌患者IA～ⅡA期49例，ⅡB～Ⅳ期45例。比較不同臨床分期宮頸組織Ep-CAM，Ki67表達率，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

圖1 宮頸鱗癌Ep-CAM，Ki67陽性表達

圖2 宮頸腺癌Ep-CAM，Ki67陽性表達

表3 宮頸癌不同臨床分期Ep-CAM，Ki67高表達率的比較[（n（%）]

3 討論

近年來學者不斷致力于腫瘤分子的研究，希望給腫瘤患者的診療帶來更多的益處。Ep-CAM，亦被稱為CD326，是一種I型跨膜糖蛋白分子，表達于部分正常組織和上皮組織源性的惡性腫瘤，通過對腫瘤干細胞、實質與間質黏附力、腫瘤信號傳導、腫瘤微環(huán)境等方面的影響促進腫瘤細胞的增殖與擴散[5-6]。目前國內學者對于Ep-CAM在宮頸癌方面的研究非常少，國外學者報道Ep-CAM對宮頸癌的進展及嚴重程度有預測作用[7]。Ki67是一種與細胞增殖有關的核內蛋白，通過對細胞周期的影響促進細胞的增殖，能夠協(xié)助判斷腫瘤細胞的增殖狀態(tài)，從而判斷預后[8]。本研究對比其他宮頸組織，對宮頸癌組織進行Ep-CAM和Ki67聯合檢測，一方面研究Ep-CAM在宮頸組織不同狀態(tài)的表達情況，另一方面在Ki67的陽性表達基礎上，通過Ep-CAM的表達分析腫瘤細胞的生物學行為，并進一步對不同病理類型、不同臨床分期進行研究分析。

首先對Ep-CAM和Ki67在宮頸癌中的表達進行研究。結果顯示，Ep-CAM和Ki67在宮頸癌組織中的陽性率均為100%，在LSiL的陽性率分別為 0%和 9%，在HSiL的陽性率分別為91%和 87%，在正常宮頸組織的陽性率分別為 0%和6 %。對上述結果進行分析，相比較Ep-CAM，Ki67在LSiL和正常宮頸組織低表達，而在宮頸癌組織中高表達，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。宮頸癌Ep-CAM的陽性率雖然高于HSiL，但差異無統(tǒng)計學意義，兩者Ki67的陽性率有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。尤其是Ep-CAM值得一提，在正常宮頸組織和LSiL幾乎不表達，但在HSiL與宮頸癌中明顯表達，表明Ep-CAM能夠很好提示宮頸異型性細胞的存在，并與異型性程度呈正比，是宮頸癌敏感性很強的腫瘤分子。Ki67則能夠很好提示惡性腫瘤細胞的增殖。因此Ep-CAM和Ki67能反映宮頸癌細胞的分化程度，對臨床腫瘤診斷可起到輔助作用。

本研究還進一步對宮頸癌浸潤性鱗癌和腺癌兩種病理類型進行研究，分析比較Ep-CAM，Ki67的高表達率，結果表明宮頸浸潤性鱗癌Ep-CAM的高表達高于腺癌，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ki67的高表達率兩者差異無統(tǒng)計學意義。說明Ep-CAM在鱗狀上皮中的表達強于腺上皮，可能不同腫瘤干細胞來源的細胞腫瘤分子的表達有差異。

本研究還對宮頸癌患者不同的臨床分期進行研究，比較早期宮頸癌與中晚期宮頸癌組織Ep-CAM，Ki67的高表達率。有研究表明，Ki67病變部位與陽性表達部位基本一致，并且病變部位級別越高陽性程度越高[9]。本研究結果表明，中晚期宮頸癌Ep-CAM和Ki67高表達率顯著高于早期，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明Ep-CAM和Ki67兩個標志物通過各自不同的機制關聯宮頸癌細胞的浸潤與轉移。這一點不僅能夠幫助臨床從分子學角度進行預后評價，還可以為宮頸癌的分子治療提供理論依據。國外有學者[10]體外以Ep-CAM抗體為基礎進行免疫治療，為多種侵襲性腫瘤的治療帶來曙光。Ep-CAM抗體對宮頸癌的作用也仍然值得期待。

綜上所述， Ep-CAM和Ki67可作為宮頸癌的有效腫瘤標志物，既能提供協(xié)助診斷依據，還能評估癌細胞增殖狀態(tài)，預測浸潤及轉移。希望研究結果還能進一步為宮頸癌的抗體治療提供依據。本課題組還將繼續(xù)結合HPV的感染以及晚期患者的生存期進行研究，以期進一步明確Ep-CAM和Ki67在宮頸癌中的作用機制及臨床應用價值。