何永林，黃曉琴，黎起秦，陸 溫，林 緯，袁高慶

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.玉林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 玉林 537000）

【研究意義】柑橘砂皮病又叫黑點(diǎn)病、樹脂病、褐色蒂腐病，因各發(fā)病部位、癥狀、時(shí)期不同而有多種名稱。過去柑橘砂皮病屬于次要病害，一般結(jié)合柑橘其他病害對其進(jìn)行兼治。近些年來，由于低溫凍害、濫用化學(xué)藥劑、管理粗放等原因，導(dǎo)致柑橘砂皮病發(fā)生面積逐漸增加，上升為主要病害，嚴(yán)重影響果實(shí)外觀和品質(zhì)，降低了果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，對我國柑橘生產(chǎn)造成嚴(yán)重制約[1-2]。另外，由于不同病原間以及同種病原不同來源的菌株間對藥劑的敏感性差異較大[3]。因此，篩選出適用于當(dāng)?shù)馗涕偕捌げ【母咝巹┯兄谔岣呋瘜W(xué)防治效果，同時(shí)增加防治藥劑輪換種類，減少病原菌產(chǎn)生抗藥性的機(jī)率?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】柑橘砂皮病的病原以間座殼屬真菌柑橘間座殼（Diaporthe citri）為主要代表種群，無性態(tài)為柑橘擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis citri），廣泛分布于世界各大相橘產(chǎn)區(qū)[4-5]。但柑橘砂皮病菌種群組成復(fù)雜，不同地區(qū)病原可能不一定相同。柴思睿對江西省柑橘黑點(diǎn)病菌種群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，除優(yōu)勢種D.citri之外，還有26個(gè)Diaporthe種可引起柑橘黑點(diǎn)病[6]。廣西是我國柑橘的最大產(chǎn)區(qū)，當(dāng)?shù)馗涕偕捌げ“l(fā)生普遍, 且呈暴發(fā)趨勢[7]。目前對該病的防治除了采用農(nóng)業(yè)措施增強(qiáng)果樹樹勢外，主要依賴化學(xué)防治。國內(nèi)防治柑橘砂皮病以代森錳鋅、咪鮮胺、苯并咪唑類、三唑類殺菌劑等為主[8-10]，多為傳統(tǒng)的單劑農(nóng)藥，防治對象較單一且易產(chǎn)生抗藥性。張?jiān)赖萚11]對26種殺菌劑對柑橘砂皮病菌的室內(nèi)毒力測定，在治療性殺菌劑中，毒力最高的是250 g/L吡唑醚菌酯，其EC50為0.2001 mg/L；在保護(hù)性殺菌劑中，毒力最高的是80%代森錳鋅，其EC50為3.3946 mg/L；周娜等[12]在測定33種殺菌劑對柑桔砂皮病菌的毒力時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙胍三辛烷基苯磺酸鹽、氟硅唑、多菌靈、咪鮮胺錳鹽、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、戊唑醇、甲基硫菌靈的抑菌效果較強(qiáng)，其EC50在0.0112～1.7296 mg/L之間?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以廣西柑橘園表現(xiàn)典型砂皮癥狀的病果為試驗(yàn)材料，對病原菌進(jìn)行分離和鑒定，通過菌絲生長抑制法測定了21種藥劑對柑橘砂皮病菌的抑制作用，從中篩選出抑菌效果好且能兼治柑橘其他病害的藥劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分離并鑒定廣西當(dāng)?shù)馗涕偕捌げ【?，篩選更適合當(dāng)?shù)氐母咝V譜藥劑，為田間防治柑橘砂皮病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年從廣西桂林富川縣柑橘果園采集表現(xiàn)典型砂皮癥狀的病果，從中分離獲得柑橘砂皮病菌菌株，作為藥劑篩選供試菌株。

供試藥劑：70%代森聯(lián)水分散粒劑（德國巴斯夫公司），10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（北京中發(fā)百農(nóng)生物化學(xué)技術(shù)有限公司），50%咪鮮胺懸浮劑（江蘇惠民農(nóng)業(yè)科技有限公司），30%吡唑醚菌酯懸浮劑，25%氟環(huán)唑·噻呋酰胺懸浮劑，250 g/L丙環(huán)唑乳油（陜西美邦農(nóng)藥有限公司），22.5%啶氧菌酯懸浮劑（安陽市銳普農(nóng)化有限責(zé)任公司），35%氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯懸浮劑（河南豫之星作物保護(hù)有限公司），20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司），80%代森錳鋅可濕性粉劑（美國陶氏益農(nóng)公司），1.8%辛菌胺醋酸鹽懸浮劑（西安嘉科農(nóng)化有限公司），46%氫氧化銅水分散粒劑（美國杜邦公司），12.5%戊唑醇乳油（四川省慧峰植?？萍加邢薰荆?0%氯溴異氰尿酸可濕性粉劑（河北上瑞化工有限公司），40%苯醚甲環(huán)唑·吡唑醚菌酯懸浮劑（天津萬源新綠生物科技股份有限公司），40%多菌靈懸浮劑（青島杜邦化工集團(tuán)有限公司），47%春雷霉素·王銅可濕性粉劑（青島金爾農(nóng)藥研制開發(fā)有限公司），30%氟環(huán)唑懸浮劑（江西千益化工股份有限公司），80%乙蒜素乳油（河南科邦化工有限公司），24%吡唑醚菌酯·壬菌銅微乳劑（陜西上格之路生物科技有限公司），40%喹啉銅·吡唑醚菌酯懸浮劑、40%喹啉銅懸浮劑（陜西康禾立豐生物科技藥業(yè)有限公司），30%吡唑醚菌酯懸浮劑（陜西美邦農(nóng)藥有限公司）。

1.2 柑橘砂皮病菌的分離與鑒定

采用常規(guī)分離法對果實(shí)病組織進(jìn)行分離，取2 mm×2 mm的砂皮病組織塊，放入75 %酒精消毒30～60 s，在1%升汞溶液中消毒1 min，用無菌水漂洗3次，將組織塊置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上，28℃恒溫培養(yǎng)。將分離菌株純化后置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）及燕麥瓊脂（OMA）中28℃下培養(yǎng)，觀察菌落培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子形狀及顏色，并測量大小。另外提取菌株的菌絲體DNA，用真菌通用引物ITS4與ITS5對菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94℃5 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，延伸 72 ℃ 45 s，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后測序并通過GenBank數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行BLAST比對分析。結(jié)合病原菌的形態(tài)特征，確定其種類。

1.3 21種藥劑對柑橘砂皮病菌的抑制作用測定

采用菌絲生長速率法初步測定藥劑對柑橘砂皮病菌的抑制作用。將供試的21種藥劑分別與PDA培養(yǎng)基混合制成含藥培養(yǎng)基平板，每種藥劑設(shè)置10、1、0.1μg/mL3個(gè)濃度梯度，每個(gè)藥劑濃度3次重復(fù)。將含相同量無菌水的PDA培養(yǎng)基作為對照。用5 mm直徑的打孔器選取供試菌株菌落邊緣打孔，將菌餅帶菌絲的一面向下接種到含藥平板中央，置于28 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，以十字交叉法測量菌落直徑（mm），取其平均值，計(jì)算各藥劑濃度對菌絲生長的抑制率：

1.4 5種藥劑對柑橘砂皮病菌的室內(nèi)毒力測定

在藥劑初篩選試驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選5種抑菌率高、抑菌譜廣的新型藥劑，測定其對柑橘砂皮病菌的室內(nèi)毒力。針對不同藥劑分別配置一系列濃度梯度，每個(gè)藥劑濃度3次重復(fù)，按照上述菌絲生長速率法測定各濃度梯度的藥劑對病菌的抑制率。用SPSS V20軟件統(tǒng)計(jì)分析，將藥劑濃度換算成濃度對數(shù)（x），菌絲生長抑制率換算成抑制機(jī)率值（y），計(jì)算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及抑制中濃度（EC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

從病果上分離獲得3株形態(tài)特征一致的菌株F-3-1、F-3-2和F-3-3。菌落初期白色、稀疏、羽毛狀，后期暗灰色至黑色、棉氈狀，呈同心輪紋狀擴(kuò)展。在PDA平板上培養(yǎng)60 d未觀察到產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。在OMA上培養(yǎng)30 d左右，菌落產(chǎn)生黑色小點(diǎn)即分生孢子器，分生孢子器近球形，具孔口，分生孢子梗無色近圓柱型。甲型（α）分生孢子橢圓至紡錘形，單孢無色，兩端各含1個(gè)油球，平均大小為8.83 μm×3.81 μm，未觀察到乙型（β）分生孢子。

任選其中1株具有致病力的菌株F-3-3進(jìn)行rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增，經(jīng)測序和同源性比對，發(fā)現(xiàn)F-3-3菌株的rDNA-ITS序列與GenBank中的Diaporthe citri的同源性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)特征（圖1），確定從柑橘砂皮病病果上分離得到的菌株F-3-3為D.citri，其無性階段為Phomopsis citri。

圖1 柑橘砂皮病菌F-3-3菌株在燕麥培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征Fig.1 Culture characteristics and morphological characteristics of F-3-3 strain on of D.citri OMA medium

2.2 21種藥劑對柑橘砂皮病的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，21種藥劑對柑橘砂皮病菌菌絲生長均有抑制效果，藥劑對病原菌的抑制率與藥劑濃度呈正相關(guān)，表現(xiàn)為供試藥劑濃度越高，菌落直徑越小，抑制率越高。當(dāng)藥劑濃度在最低測試濃度0.1 μg/mL時(shí)，咪鮮胺、吡唑醚菌酯、氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑·吡唑醚菌酯、多菌靈和喹啉銅·吡唑醚菌酯的抑菌率均達(dá)100%，氟環(huán)唑·噻呋酰胺、吡唑醚菌酯·壬菌銅、啶氧菌酯和丙環(huán)唑的抑菌率大于53%，后4種藥劑的濃度增加到1 μg/mL時(shí)，抑菌率均也達(dá)到100%。以上11種藥劑的離體抑菌效果較好；其余殺菌劑濃度為1 μg/mL時(shí)，抑菌率在6.6%～72.6%之間，抑菌效果一般或較差。

表1 21種藥劑對柑橘砂皮病菌的平均抑制率Table 1 Average inhibition rate of 21 fungicides to D.citri

2.3 5種藥劑的室內(nèi)毒力

從11種離體抑菌效果好的藥劑中選擇5種新型的復(fù)配劑和單劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測試。結(jié)果（表2）表明，5種藥劑對柑橘砂皮病菌都具有很強(qiáng)的抑制作用，其中氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯的毒力最高，EC50值為0.053 μg/mL；氟環(huán)唑·噻呋酰胺的毒力最低，EC50值為0.814 μg/mL。5種供試藥劑對柑橘砂皮病菌的抑制作用從高到低依次為：氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、喹啉銅·吡唑醚菌酯、吡唑醚菌酯·壬菌銅和氟環(huán)唑·噻呋酰胺。

3 討論

陽廷密等曾確認(rèn)廣西金柑新發(fā)現(xiàn)的黑點(diǎn)病病原亦為柑橘間座殼[13]。本研究和已知文獻(xiàn)表明，廣西柑橘砂皮病、黑點(diǎn)病、褐色蒂腐病和樹脂病病原的優(yōu)勢種為D.citri[4]，這與其他柑橘產(chǎn)區(qū)的研究結(jié)果一致。不過另據(jù)報(bào)道，除了D.citri外，廣西柑橘上間座殼菌相關(guān)致病菌還包括D.citrichinensis，但其并不能引起砂皮癥狀[4]。廣西柑橘種植面積大，分布范圍廣，種類多，本試驗(yàn)采集標(biāo)樣有限，當(dāng)?shù)馗涕偕捌げ∈欠駜H由D.citri引起尚待深入研究。

表2 5種藥劑對柑橘砂皮病菌的室內(nèi)毒力Table 2 Toxicity determination of 5 fungicides on D.citri in laboratory

本試驗(yàn)通過菌絲生長抑制法對21種藥劑進(jìn)行初篩選，發(fā)現(xiàn)這些藥劑普遍對柑橘砂皮病菌有抑制作用，其中三唑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抑菌效果總體上較好。目前國內(nèi)對柑橘砂皮病藥劑篩選的報(bào)道以咪鮮胺、代森錳鋅、苯并咪唑類和三唑類殺菌劑等單劑為主[8-10]，前人已驗(yàn)證上述殺菌劑大多對柑橘砂皮病菌菌絲生長有很強(qiáng)的抑制作用，EC50值范圍為1.089×10-3～0.954 μg/mL[8,10,14-15]。田間防治效果較好的藥劑有代森錳鋅、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑等[15-16]。苯并咪唑類、三唑類殺菌劑高效廣譜，具有保護(hù)和治療作用等優(yōu)點(diǎn)，但作用靶標(biāo)單一，大量單獨(dú)使用后病菌易產(chǎn)生抗藥性，且對其他殺菌劑也會產(chǎn)生交互抗性[17-18]。美國對柑橘黑點(diǎn)病的防治過去主要以銅制劑為主[19]，近年來也開始推廣使用甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，如吡唑醚菌酯和嘧菌酯等[20]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一類高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，與其他殺菌劑不存在交互抗性，能有效的控制已經(jīng)對其他殺菌劑產(chǎn)生抗性的植物病害。近年來國內(nèi)在防治柑橘砂皮病時(shí)也逐漸重視該類殺菌劑[11]，本試驗(yàn)的測試也進(jìn)一步證實(shí)啶氧菌酯、吡唑醚菌酯以及吡唑醚菌酯與氟環(huán)唑或苯醚甲環(huán)唑的復(fù)配劑對柑橘砂皮病菌均有較強(qiáng)的抑制作用。但甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對細(xì)菌性病害無效，而潰瘍病是嚴(yán)重制約柑橘生產(chǎn)的一種細(xì)菌性病害，防治該病的主要藥劑為銅制劑，分別施用藥劑會增加防治成本及農(nóng)藥殘留。本試驗(yàn)測定吡唑醚菌酯與喹啉銅和壬菌銅的復(fù)配劑對柑橘砂皮病菌的EC50值分別為0.064 μg/mL和0.106 μg/mL，抑菌效果十分明顯。另外，吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、氟環(huán)唑?qū)Ω涕俑涕偬烤也『童忦璨∫灿休^好的防治效果[21-23]，因此，本試驗(yàn)選用的復(fù)配劑能有效地增加藥劑抑菌譜，在防治柑橘砂皮病的同時(shí)，還可能兼治柑橘潰瘍病、炭疽病等其他多種病害。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，氟環(huán)唑濃度為1 μg/mL時(shí)對柑橘砂皮病菌的抑制率為67.7%，但其與噻呋酰胺的復(fù)配劑在同樣濃度下對病菌的抑制率達(dá)到100%。噻呋酰胺內(nèi)吸性強(qiáng)、持效期長，主要用于防治紋枯病和白絹病，目前尚未見有噻呋酰胺應(yīng)用于柑橘病害的研究報(bào)道，其單劑及復(fù)配劑對柑橘砂皮病的防治作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

結(jié)合形態(tài)特征觀察和rDNA-ITS序列分析，鑒定廣西柑橘砂皮病病原為柑橘間座殼（Diaporthe citri）；三唑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對柑橘砂皮病菌的抑菌效果總體上較好，吡唑醚菌酯·壬菌銅、氟環(huán)唑·噻呋酰胺、喹啉銅·吡唑醚菌酯、氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯和啶氧菌酯等5種殺菌劑的EC50范圍為0.053～0.814 μg/mL，為田間防治柑橘砂皮病時(shí)選擇更多輪換藥劑提供了參考。