李萬(wàn)奎

目前我國(guó)心腦血管疾病的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康，影響了人們的生活質(zhì)量。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，其本質(zhì)是一種炎性改變［1］，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化早期的病理變化［2］，氧化低密度脂蛋白是早期內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵性因子［3］。在動(dòng)脈粥樣硬化的治療中，阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣被公認(rèn)為是有效的治療方案，不僅能抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血脂，還對(duì)炎癥因子有調(diào)節(jié)作用［4］。但在細(xì)胞水平上，阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道?；谝陨涎芯勘尘?，該研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）為研究對(duì)象，用氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)其損傷，建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，采用四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT 法）檢測(cè) HUVEC 增殖活力，并計(jì)算細(xì)胞存活率，檢測(cè)上清液中白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β） 含 量 、 白 介 素 -6（interleukin-6，IL-6）含量、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量，來(lái)分析各組炎癥指標(biāo)變化，為阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1藥物試劑與動(dòng)物阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100113-201706）；阿托伐他汀鈣標(biāo)準(zhǔn)品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100590-201804）。DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO 公司，批號(hào)1279435）；胰蛋白酶（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)0458-25g）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)201804031250）；氧化低密度脂蛋白 （上海魯汶生物科技有限公司，批號(hào)20180104）；IL-1β試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號(hào)20180107）；IL-6試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20180113）；TNF-α試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20180105）。清潔級(jí)健康成年 Sprague-Dawley（SD）大鼠 12只，雌雄不限，體質(zhì)量 290～310 g，許可證號(hào)：SCXK（豫）2017-0001，由信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；產(chǎn)后1 h以內(nèi)新鮮臍帶數(shù)根，來(lái)自河南圣德醫(yī)院婦產(chǎn)科。

1.2方法

1.2.1 HUVEC的培養(yǎng)、鑒定及傳代 依據(jù)文獻(xiàn)方法及本人前期研究［5］，從健康足月產(chǎn)婦臍靜脈內(nèi)提取HUVEC，并進(jìn)行傳代。經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.2 含藥血清制備 模擬人類用藥方法及相關(guān)文獻(xiàn)［6］，將12只SD大鼠分為4組，每組3只，分別以不同劑量藥物灌胃：空白對(duì)照組及模型組（蒸餾水 2 ml），阿司匹林組（1 mg/ml阿司匹林溶液 2 ml），阿司匹林+阿托伐他汀鈣組 （1 mg/ml阿司匹林+0.05 mg/ml阿托伐他汀鈣溶液2 ml）。均灌胃3 d，于最后一次灌胃后2 h無(wú)菌條件下收集腹主動(dòng)脈血，同組血液混合，離心分離血清，經(jīng)56℃滅活30 min，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 取生長(zhǎng)良好的3～4代傳代培養(yǎng)的HUVEC，接種于96孔板進(jìn)行培養(yǎng)及干預(yù)，每組重復(fù)10個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)同步化后，將細(xì)胞分為4組，分別為空白對(duì)照組、模型組、阿司匹林組、阿司匹林+阿托伐他汀鈣組?？瞻讓?duì)照組給予灌胃蒸餾水2 ml共3 d的大鼠血清DMEM培養(yǎng)液，模型組給予灌胃蒸餾水2 ml共3 d的大鼠血清DMEM培養(yǎng)液，阿司匹林組給予灌胃藥物（1 mg/ml阿司匹林溶液2 ml）共3 d的大鼠血清DMEM培養(yǎng)液，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組給予灌胃藥物（1 mg/ml阿司匹林+0.05 mg/ml阿托伐他汀鈣溶液2 ml）共3 d的大鼠血清DMEM培養(yǎng)液。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，除空白對(duì)照組外（給予DMEM培養(yǎng)液），各組再給予含100 mg/L氧化低密度脂蛋白培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 觀察指標(biāo) （1）MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活力及存活率。處理完各組HUVEC后，加入MTT（5 g/L）20 μl，繼續(xù)孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，低速震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm測(cè)量各孔吸光值，結(jié)果以吸光度（OD）值表示。根據(jù)細(xì)胞增殖活力，計(jì)算存活率。（2）炎癥因子指標(biāo)的檢測(cè)。處理完各組 HUVEC后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞，吸取各組培養(yǎng)液，分別按IL-1β、IL-6、TNF-α 試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)定 IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以（）表示，所有資料采用Student-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1對(duì)增殖活力及存活率的影響各組HUVEC增殖活力及存活率測(cè)定結(jié)果見表1：與空白對(duì)照組比較，模型組OD值明顯降低（P＜0.01），存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組OD值明顯升高（P＜0.01），存活率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組OD值明顯升高（P＜0.01），存活率明顯升高（P＜0.01）；與阿司匹林組比較，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組OD值明顯升高（P＜0.01），存活率明顯升高（P＜0.01）。

2.2對(duì)炎癥因子的影響各組HUVEC炎癥因子指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表2：與空白對(duì)照組比較，模型組IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明顯增高 （P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α 含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明顯降低 （P＜0.01）；與阿司匹林組比較，阿司匹林+阿托伐他汀鈣組IL-6含量降低（P＜0.05），IL-1β 含量、TNF-α 含量明顯降低（P＜0.01）。

表1 阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)損傷的HUVEC增殖活力及存活率的影響（，n=10）

表1 阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)損傷的HUVEC增殖活力及存活率的影響（，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.01；與模型組相比較，＊P＜0.01；與阿司匹林組比較，△P＜0.01。

組別 OD值 存活率（%）空白對(duì)照組 0.377±0.024 -模型組 0.199±0.013# 52.79#阿司匹林組 0.250±0.014＊ 66.31＊阿司匹林+阿托伐他汀鈣組 0.269±0.012＊△ 71.35＊△

表2 阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)損傷的 HUVEC IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的影響（pg/ml，，n=10）

表2 阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)損傷的 HUVEC IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的影響（pg/ml，，n=10）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01；與阿司匹林組比較，△P＜0.05，★P＜0.01。

組別 IL-1β IL-6 TNF-α空白對(duì)照組 3.145±0，611 0.155±0.038 0.815±0.173模型組 12.701±1.691＊ 0.679±0.103＊ 1.867±0.318＊阿司匹林組 10.703±0.809# 0.552±0.085# 1.584±0.172#阿司匹林+阿托伐他汀鈣組 8.661±1.335▲★ 0.454±0.084▲△ 1.091±0.231▲★

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化專家Ross［7］明確提出“動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”，指出動(dòng)脈粥樣硬化是具有慢性炎癥反應(yīng)特征（變質(zhì)、滲出、增生）的病理過(guò)程，其發(fā)展始終伴隨炎癥反應(yīng)，這一學(xué)說(shuō)最終得到確立。隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明動(dòng)脈粥樣硬化與炎性反應(yīng)密切相關(guān)。陳彩霞等［8］對(duì)健康對(duì)照者30例及Ⅰ～Ⅲ級(jí)頸動(dòng)脈斑塊各30例患者血清C-反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-6水平進(jìn)行對(duì)照比較，發(fā)現(xiàn)血清C-反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-6水平與頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊嚴(yán)重程度具有密切相關(guān)性。阿司匹林是治療心腦血管疾病的一線藥物，除了抑制血小板聚集外，還具有抗炎作用。阿托伐他汀鈣為他汀類調(diào)脂藥物，同樣也具有抗炎作用。大量研究發(fā)現(xiàn)［9-11］，阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣能夠有效地降低腦梗死、冠心病、頸動(dòng)脈粥樣硬化患者血清炎癥因子水平，抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)預(yù)防腦梗死、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化有積極作用。

眾所周知，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是多種血管疾病發(fā)病和治療的靶細(xì)胞［12］。 研究表明［13，14］，氧化低密度脂蛋白是最重要的損傷啟動(dòng)因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，使其分泌的炎癥因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等升高，從而造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。MTT法是檢測(cè)細(xì)胞損傷程度的常用方法，通過(guò)在490 nm測(cè)定其吸光度，從而反映細(xì)胞的增殖活力，并可計(jì)算細(xì)胞成活率［15］。IL-1β 主要由巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌，當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)刺激時(shí)，IL-1β分泌量明顯增加，除了損傷內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能外，還可促進(jìn)IL-6等炎性介質(zhì)的分泌［16］。IL-6主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等分泌，可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷，致使血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能受損［17］。TNF-α是一種重要的促炎反應(yīng)的細(xì)胞因子，除了直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞外，還可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性物質(zhì)的平衡失調(diào)［18］。氧化低密度脂蛋白可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子分泌，在其共同作用下，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能紊亂，最終誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展［19］。

該研究發(fā)現(xiàn)，模型組HUVEC的OD值明顯降低，存活率明顯降低，IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明顯增高，說(shuō)明氧化低密度脂蛋白明顯抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活力，降低存活率，激活了細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)，這與肖琛等［20］研究一致。阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣組細(xì)胞OD值及存活率明顯升高，IL-1β含量、IL-6含量、TNF-α含量明顯降低，且較阿司匹林組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明阿司匹林聯(lián)合阿托伐他汀鈣可明顯改善氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活力，增加存活率，抑制了炎癥反應(yīng)，從而有效地保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。