賈 聰，蘆 鑫，高錦鴻，孫 強(qiáng)，黃紀(jì)念，張麗霞

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，鄭州450000)

花生屬于豆科植物，是一種重要的油料蛋白資源?；ㄉ械鞍踪|(zhì)含量為24%～36%，花生蛋白營養(yǎng)價(jià)值較高，包括人體必需的8種氨基酸，具有易消化、不含營養(yǎng)抑制物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的市場發(fā)展前景[1]?；ㄉ鞍赘鶕?jù)其溶解性可分為水溶性蛋白(約10%)和鹽溶性蛋白(約90%)[2]。水溶性蛋白主要是清蛋白，在提取花生蛋白的過程中大部分易丟失。鹽溶性蛋白包括伴花生球蛋白Ⅰ、伴花生球蛋白Ⅱ和花生球蛋白[3]。伴花生球蛋白Ⅰ主要由3個(gè)亞基組成，相對分子質(zhì)量在15.0～19.0 kDa之間；伴花生球蛋白Ⅱ含1個(gè)亞基，相對分子質(zhì)量基本處于60～66 kDa之間；花生球蛋白主要有4個(gè)亞基，相對分子量處于20～45 kDa之間。有研究發(fā)現(xiàn)不同品種花生蛋白的亞基含量具有差異性，主要差異在于花生球蛋白亞基組成的不同[4-5]。榨油副產(chǎn)物花生粕的蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%，我國每年產(chǎn)生900多萬t花生粕，但大部分被用作飼料或肥料[6]，未資源化利用，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。

目前，花生蛋白研究主要聚焦在對花生蛋白的提取工藝優(yōu)化和加工利用[7-9]，而關(guān)于花生蛋白組成(亞基)影響蛋白提取的研究鮮見報(bào)道。同時(shí)，為指導(dǎo)花生蛋白應(yīng)用，研究了花生蛋白的功能性質(zhì)(主要包括溶解性、乳化性、起泡性、持水性及持油性等)，雖然獲得一些進(jìn)展，然而關(guān)于花生蛋白亞基如何影響其功能性質(zhì)尚不明確。因此，開展花生蛋白亞基對花生蛋白提取與功能性質(zhì)的影響研究，對預(yù)測花生品種在食品工業(yè)中的應(yīng)用以及專用品種的選育具有重要意義。

本文采用堿溶酸沉法提取21個(gè)品種花生的蛋白質(zhì)，利用SDS-PAGE分析花生蛋白亞基組成，并對花生蛋白提取率、溶解性、乳化性、起泡性、持水性及持油性進(jìn)行測定，通過相關(guān)性分析明確花生蛋白亞基與蛋白提取率及功能性質(zhì)的交互作用，為蛋白加工業(yè)中選擇適宜花生品種以及花生育種指導(dǎo)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

花生，河南綠色油料作物研究中心提供；花生油，山東魯花集團(tuán)有限公司。β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250、過硫酸銨、溴酚藍(lán)，美國Sigma公司；電泳Marker (相對分子質(zhì)量10～250 kDa)，上海雅酶生物科技有限公司；丙烯酰胺、N,N′-亞甲雙丙烯酰胺、甘氨酸、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺等，美國Amersco公司；2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、冰醋酸、五水硫酸銅、硫酸鉀、鹽酸、氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DYY-12型電泳儀，北京市六一儀器廠；ULTRA-TURRAX型高速剪切乳化機(jī)，德國IKA公司；UV-6300型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)公司；RRHP-350型粉碎機(jī)，上海頂帥電器有限公司；FD5-3型凍干機(jī)，德國SRK公司；DL-5-B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DELTA 320型pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Gel-Doc XR+凝膠成像儀，美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；K-05型自動(dòng)定氮儀，上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花生蛋白提取

將花生(花生品種如表1所示)去除紅衣后，粉碎過60目網(wǎng)篩，取200 g篩下物采用索氏抽提法去除油脂，花生粕與去離子水以1∶10混合，將分散液調(diào)節(jié)pH為11.0，40℃下攪拌1 h，5 000 r/min 離心30 min，取上清調(diào)pH為4.5，靜置20 min，5 000 r/min 離心30 min，取沉淀，凍干，得到粗提的花生蛋白。

表1 花生品種

1.2.2 花生蛋白提取率的測定

采用凱氏定氮法分別測定1.2.1中花生粕和堿溶酸沉法得到粗提物的花生蛋白含量。花生蛋白提取率的計(jì)算如式(1)所示。

花生蛋白提取率=粗提物質(zhì)量×粗提物蛋白含量/(花生粕質(zhì)量×花生粕蛋白含量)×100%

(1)

1.2.3 花生蛋白SDS-PAGE分析

將花生粕和粗提花生蛋白(均含4 mg蛋白)分別分散到1 mL樣品處理液(含0.05 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，50 g/Lβ-巰基乙醇，20 g/L SDS，1 g/L溴酚藍(lán)，100 g/L甘油)中，沸水浴加熱10 min，10 000 r/min離心10 min后棄沉淀。電泳條件：分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，上樣量為5 μL，電流為15 mA。結(jié)束后取出凝膠采用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色1 h，然后用體積分?jǐn)?shù)均為10%的甲醇和冰醋酸脫色。凝膠掃描利用Gel-Doc XR+凝膠成像儀。亞基含量計(jì)算采用Image Lab 軟件，并采用標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比值計(jì)算變異系數(shù)，量化比較不同品種的花生蛋白亞基含量間的差異性。

1.2.4 花生蛋白溶解性的測定

稱取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)，將其分散到50 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L、pH 7.0)中，攪拌2 h后，在5 000 r/min下離心30 min取上清。采用Lowry法測定上清液中花生蛋白含量，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[10]。花生蛋白溶解性計(jì)算如式(2)所示。

花生蛋白溶解性=上清液質(zhì)量×上清液中蛋白含量/樣品中蛋白質(zhì)量×100%

(2)

1.2.5 花生蛋白乳化性的測定

將粗提花生蛋白分散于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，分散液中花生蛋白質(zhì)量濃度為1 g/L，取40 mL分散液并向其中加入10 mL花生油，10 000 r/min高速剪切1 min后迅速從底部吸取20 μL乳液，用1 g/L SDS稀釋至5 mL，在500 nm處測定吸光度。10 min后采用同樣操作測定吸光度。空白參照為1 g/L SDS溶液。花生蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性[11]計(jì)算如式(3)和式(4)所示。

(3)

(4)

式中：EAI為乳化活性，m2/g；ESI為乳化穩(wěn)定性，min；N為乳液稀釋倍數(shù)；A0為0 min時(shí)的吸光度；At為10 min時(shí)的吸光度；φ為油相比例；C為初始蛋白質(zhì)量濃度，g/mL。

1.2.6 花生蛋白起泡性的測定

參照Huang等[12]的方法并略有改動(dòng)。將粗提花生蛋白分散于0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中，分散液中花生蛋白質(zhì)量濃度為1 g/L，取40 mL分散液于10 000 r/min高速剪切2 min，立即轉(zhuǎn)入100 mL量筒中，記錄樣品體積及靜置30 min后樣品體積。起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的計(jì)算如式(5)和式(6)所示。

(5)

(6)

式中：FC為起泡能力；FS為泡沫穩(wěn)定性;V1為0 min量筒中樣品體積,mL；V2為30 min后量筒中樣品體積,mL。

1.2.7 花生蛋白持水性的測定

參照張曉蘭等[13]的方法。稱取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)于離心管中，向其中加入10 g去離子水，混勻后靜置30 min，然后在3 000 r/min下離心10 min，去除上層未吸附澄清水?；ㄉ鞍壮炙杂?jì)算如式(7)所示。

持水性=樣品吸水量/樣品中花生蛋白質(zhì)量×100%

(7)

1.2.8 花生蛋白持油性的測定

參照張曉蘭等[13]的方法。稱取粗提花生蛋白(含0.5 g蛋白)于離心管中，向其中加入4 g花生油，混勻后靜置30 min，然后在3 000 r/min下離心10 min，去除上層未吸附油?；ㄉ鞍壮钟托杂?jì)算如式(8)所示。

持油性=樣品吸油量/樣品中花生蛋白質(zhì)量×100%

(8)

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表達(dá)取平均值，并使用SPSS Statistics 20 軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，在p<0.05水平上顯著相關(guān)，在p<0.01水平上極顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與討論

2.1 花生蛋白亞基分析

21個(gè)品種的花生蛋白和花生粕的SDS-PAGE圖譜如圖1所示。由圖1可知，花生蛋白主要由伴花生球蛋白Ⅱ(65.4 kDa)、花生球蛋白(42.1、40.5、36.8 kDa和18.8 kDa)和伴花生球蛋白Ⅰ(18.0、16.1 kDa和15.1 kDa)3個(gè)組分組成，且亞基出現(xiàn)位置與封小龍等[14]研究報(bào)道的較接近。除了上述亞基外，圖1中還有其他花生蛋白亞基(33.2、25.6、24.4 kDa)，條帶顏色較淺，與Zheng等[15]的研究結(jié)果一致。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1～21分別對應(yīng)表1中的花生品種編號。

由圖1(A)計(jì)算得到的花生蛋白亞基含量如表2所示，花生蛋白亞基含量變異系數(shù)見表3。由表2可知：構(gòu)成花生蛋白的3個(gè)組分亞基含量較高；其他亞基(33.2、25.6 kDa和24.4 kDa)含量則較低，分別為(1.70±0.59)%、(1.61±0.43)%和(4.12±1.01)%。另外，花生蛋白亞基組成存在品種差異性。由表3可知，不同亞基的變異系數(shù)均在10%以上，其中15.1 kDa亞基含量差異性最大(變異系數(shù)為45.53%)，18.8 kDa亞基含量差異性最小(變異系數(shù)為11.87%)。研究表明植物蛋白的亞基組成及性質(zhì)與功能性質(zhì)有密切關(guān)系[16]。王麗[17]研究發(fā)現(xiàn)花生球蛋白23.5 kDa亞基(與本研究中的18.8 kDa亞基條帶出現(xiàn)位置接近)與花生蛋白溶解性有顯著相關(guān)性。

表2 21個(gè)品種的花生蛋白亞基含量

表3 21個(gè)品種的花生蛋白亞基含量的變異系數(shù)

由圖1(B)計(jì)算得到的花生粕亞基含量如表4所示。由表4可知，與花生粕亞基含量相比，提取的花生蛋白65.4、42.1 kDa和40.5 kDa亞基含量(見表2)下降， 16.1 kDa亞基含量明顯升高。Sheikh等[18]研究花生蛋白雙向電泳發(fā)現(xiàn)68 kDa亞基和43 kDa亞基等電點(diǎn)分別為6.3～7.3和5.5～6.3，15.5 kDa亞基的等電點(diǎn)為4.7～5.5。因此，65.4、42.1 kDa和40.5 kDa亞基很大程度受等電點(diǎn)偏離酸沉pH的影響(堿溶pH為11，強(qiáng)堿性環(huán)境能夠很好地溶解蛋白質(zhì))，在提取花生蛋白(堿溶酸沉)的過程中易損失。

表4 21個(gè)品種的花生粕亞基含量

2.2 花生蛋白提取率及功能性質(zhì)分析

21個(gè)品種的花生蛋白提取率及功能性質(zhì)見表5、變異系數(shù)見表6。由表5可知，花生蛋白提取率超過80%的有17個(gè)品種，其中大白沙的蛋白提取率最高，為93.89%，四粒紅的蛋白提取率最低，為71.96%。由表6可知，蛋白提取率的變異系數(shù)是7.41%，表明花生蛋白的提取率存在品種差異，這可能與不同花生品種的粗蛋白質(zhì)含量有關(guān)。

從表5可以看出，花生蛋白溶解性為45.32%～78.92%，低于食品加工中常用的大豆蛋白的溶解性(>80%[19])。溶解性變異系數(shù)大于10%(見表6)，表明花生品種間的溶解性差異明顯。從表5、表6可看出：花生蛋白乳化活性變異系數(shù)為14.68%，變幅為34.31～58.50 m2/g，超過50 m2/g的有7個(gè)品種，其中冀花4號乳化活性最高(58.50 m2/g)；乳化穩(wěn)定性變異系數(shù)為14.35%，變幅為13.54～23.76 min，超過20 min的僅有2個(gè)品種，其中魯花11的乳化穩(wěn)定性最高(23.76 min)；起泡能力變異系數(shù)為16.62%，變幅為7.00%～14.00%，起泡能力超過10%的品種有7個(gè)，其中花育24的起泡能力最強(qiáng)，為14%；泡沫穩(wěn)定性變異系數(shù)為7.60%，變幅為62.50%～85.71%，泡沫穩(wěn)定性超過80%的品種有11個(gè)，其中花育24的泡沫穩(wěn)定性最強(qiáng)(85.71%)；持水性變異系數(shù)為9.85%，變幅為1.89%～2.94%，其中花育24的持水性最好(2.94%)，其次是花育25(2.64%)和冀花2號(2.59%)；持油性變異系數(shù)為10.69%，變幅為1.10%～1.67%，其中四粒紅、國育2016和白沙的持水性最好(均為1.67%)，其次是拔二罐和天府3號(均為1.64%)。

表5 21個(gè)品種的花生蛋白提取率及功能性質(zhì)

表6 21個(gè)品種的花生蛋白提取率及功能性質(zhì)的變異系數(shù) %

2.3 花生蛋白亞基與蛋白提取率及功能性質(zhì)相關(guān)性分析

采用SPSS軟件對花生蛋白亞基與蛋白提取率及功能性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表7所示。由表7可知，花生蛋白亞基與蛋白提取率、功能性質(zhì)均存在相關(guān)性，其中16.1 kDa亞基與花生蛋白提取率呈極顯著正相關(guān)(p<0.01，r=0.559)，而65.4、42.1 kDa亞基和40.5 kDa亞基與花生蛋白提取率呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01，r=-0.706；r=-0.581，r=-0.621)。從2.1的研究結(jié)果可知，這可能與蛋白亞基等電點(diǎn)有關(guān)，蛋白中含有較多等電點(diǎn)接近酸沉pH(pH 4.5)的亞基時(shí)，則蛋白提取率較高，反之則蛋白提取率較低。33.2 kDa亞基與花生蛋白溶解性呈極顯著正相關(guān)(p<0.01，r=0.559)，而18.8 kDa亞基與花生蛋白溶解性呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05，r=-0.541)，原因可能與蛋白亞基結(jié)構(gòu)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)疏松的亞基結(jié)構(gòu)促進(jìn)分子的伸展，有利于親水基團(tuán)的暴露[20]，從而提高水溶性。24.4 kDa亞基與花生蛋白起泡能力呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01，r=-0.565)；42.1 kDa亞基與花生蛋白的持油性呈極顯著正相關(guān)(p<0.01，r=0.627)，這可能與亞基的疏水基團(tuán)較多有關(guān)[21]。綜上可知，根據(jù)花生蛋白的亞基組成及含量可預(yù)示花生蛋白提取率及功能性質(zhì)，從而為花生蛋白用于具體的食品體系時(shí)提供一定的理論基礎(chǔ)。

表7 花生蛋白亞基與蛋白提取率及功能性質(zhì)的相關(guān)性分析

3 結(jié) 論

以21個(gè)品種花生為原料，測定花生蛋白亞基組成及蛋白提取率、功能性質(zhì)，利用相關(guān)性分析指標(biāo)間關(guān)系。結(jié)果表明：花生蛋白亞基含量對蛋白提取率及功能性質(zhì)有明顯影響，65.4、42.1、40.5 kDa亞基和16.1 kDa亞基均與花生蛋白提取率呈極顯著相關(guān)(r=-0.706，r=-0.581，r=-0.621和r=0.559)；33.2 kDa亞基與花生蛋白溶解性呈極顯著正相關(guān)(r=0.559)，而18.8 kDa亞基與花生蛋白溶解性呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.541)；24.4 kDa亞基與花生蛋白起泡能力呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.565)；42.1 kDa亞基與花生蛋白的持油性呈極顯著正相關(guān)(r=0.627)。