涂鄂文，劉秋庭，譚莉，曾艷香，陳瓊

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）引起的神經(jīng)功能缺損除了血腫本身引起占位效應(yīng)外，血腫周圍局部血流量降低和結(jié)構(gòu)性缺血性損害進一步加重神經(jīng)功能損傷[1-2]。依據(jù)神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）治療新觀點，血管新生有望成為卒中治療的新靶點。通過刺激血腫周圍局部缺血部位的血管新生，重建微血管系統(tǒng)，改善腦組織血氧供應(yīng)，穩(wěn)定血腦屏障，可發(fā)揮神經(jīng)保護作用從而減輕神經(jīng)功能缺損[3]。本研究通過觀察大鼠ICH后腦組織中血管內(nèi)皮生長因子（vaseular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）蛋白在不同時間點的動態(tài)表達及其在不同劑量丁基苯酞干預(yù)后的變化，探討丁基苯酞對ICH大鼠可能的神經(jīng)保護作用及機制。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與實驗試劑 健康雄性成年清潔級SD大鼠，體重210±20 g，8～12周齡，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)東塘動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002。兔抗VEGF多克隆抗體、兔抗Ang-2多克隆抗體、兔抗鼠CD34單克隆抗體均由武漢博士德生物制劑公司提供。丁基苯酞原液由石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司提供。

1.2 動物造模與實驗分組 參照Gary A.Rosenberg等[4]的方法制備ICH大鼠模型，大鼠經(jīng)10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位，沿頭皮正中線切口，充分暴露前囟，然后定位于前囟前0.2 mm，正中線向右旁開3 mm處鉆一小孔，直徑為0.5 mm，進針約5.5 mm，用微量進樣器以10 μL/min的速度注入自體血100 μL。麻醉蘇醒后，根據(jù)Longa評分法[5]進行神經(jīng)功能缺損評分，1～3分造模成功大鼠。造模成功后，將大鼠隨機分為腦出血模型組、丁基苯酞低劑量組及丁基苯酞中劑量組。假手術(shù)組于相同部位注入等量無菌0.9%氯化鈉注射液。

假手術(shù)組、腦出血模型組、丁基苯酞低劑量組及丁基苯酞中劑量組各40只大鼠，每組分為1 d、3 d、7 d、15 d 4個亞組，每個亞組10只。

1.3 分組處理 于造模成功6 h后，分別給予丁基苯酞低劑量組和中劑量組大鼠丁基苯酞10 mg/kg、25 mg/kg，溶于大豆油中，每日2次灌胃，假手術(shù)組及腦出血模型組大鼠則在相同時間用同等體積大豆油代替灌胃。分別在術(shù)后1 d、3 d、7 d、15 d通過Longa評分法評估神經(jīng)功能缺損。然后處死大鼠，取腦組織，其中每亞組取5只進行VEGF和Ang-2蛋白表達、新生血管計數(shù)和血管場面積測定；另外5只7 d、15 d進行血腫體積測定（1 d、3 d做腦水含量測定觀察腦水腫）。

1.4 血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素-2蛋白測定 分別在術(shù)后1 d、3 d、7 d、15 d，取以大鼠右側(cè)蒼白球（血腫）為中心的基底節(jié)部分腦白質(zhì)，在機械勻漿器中加入5倍體積量的裂解液，裂解完全，4 ℃離心收集上清液，采用BCA蛋白定量法測定裂解蛋白濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳（時間4～6 h，電壓100 V）。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至經(jīng)甲醇活化的PVDF膜上，加入封閉緩沖液室溫振蕩1 h，依次孵育一抗、二抗，化學(xué)發(fā)光法曝光顯色。膠片用掃描儀將圖像輸入電腦，ImagePro-plus 6.0圖像分析軟件，β-actin蛋白作為內(nèi)參照，計算VEGF和Ang-2蛋白吸光度值/內(nèi)參照蛋白吸光度值的比值。

1.5 微血管計數(shù)及血管場面積測定 分別在術(shù)后1 d、3 d、7 d、15 d，取大鼠右側(cè)血腫周圍腦組織進行梯度酒精脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片。采用免疫組化法（SP法染色，DAB顯色）觀察CD34的表達。

先在低倍鏡下尋找條索狀或圓形空洞的褐色新生血管，尋找陽性血管表達最密集處，隨機選取5個區(qū)域進行高倍鏡（×200）統(tǒng)計視野血管數(shù)，以條索狀或中心空洞算一條進行計數(shù)，進行微血管計數(shù)（單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇均算為一個血管計數(shù)，管腔＞8個紅細胞直徑或帶有較厚基層的血管不計數(shù)），取平均值，采用圖像處理系統(tǒng)進行圖像分析，血管場面積為所測得有效血管截面面積與統(tǒng)計場面積的千分比。

1.6 測量血腫體積 分別在術(shù)后7 d、15 d，將大鼠腦組織從額部至枕部均勻切成厚度約1 mm的冠狀腦片，按順序排列后拍照，將圖片掃描輸入奧申影像采集系統(tǒng)測量腦血腫面積，根據(jù)公式：V=T1×A1+T2×A2 ……+Tn×An（V為血腫體積，A為單個層面血腫面積，T為對應(yīng)冠狀腦片的切片厚度）計算血腫體積（mm3）。

2 結(jié)果

2.1 丁基苯酞對神經(jīng)功能缺損的影響 ICH模型制作成功后，除假手術(shù)組外，其他各組神經(jīng)功能缺損評分均呈先升高后降低的趨勢，腦出血模型組神經(jīng)功能缺損評分的高峰是在術(shù)后3 d，而丁基苯酞低劑量、中劑量組神經(jīng)功能缺損的高峰在術(shù)后1 d。在術(shù)后3 d、7 d、15 d，丁基苯酞中劑量組神經(jīng)功能缺損評分均低于腦出血模型組（P=0.044，P=0.010，P=0.006），丁基苯酞低劑量組術(shù)后3 d神經(jīng)功能缺損評分低于腦出血模型組（P=0.047），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2 丁基苯酞對VEGF蛋白表達的影響 假手術(shù)組不同時間點VEGF蛋白均極少表達，腦出血模型組及丁基苯酞組術(shù)后1 d開始VEGF蛋白表達上升，并隨出血時間延長表達逐漸增加，術(shù)后15 d達高峰；丁基苯酞低劑量組在術(shù)后7 d、15 d VEGF蛋白表達與腦出血模型組比較增加（P=0.042，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而丁基苯酞中劑量組則在1 d、3 d、7 d和15 d各時間點VEGF蛋白表達與腦出血模型組比較均增加（P＜0.001，P=0.008，P=0.016，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表1 不同時間點各組大鼠Longa神經(jīng)功能缺損評分（單位：分）

2.3 丁基苯酞對Ang-2蛋白表達的影響 假手術(shù)組少量表達Ang-2蛋白，腦出血模型組和丁基苯酞組從術(shù)后1 d開始Ang-2蛋白表達上調(diào)，術(shù)后15 d達高峰；與腦出血模型組相比，丁基苯酞低、中劑量組在各時間點的Ang-2蛋白表達明顯增加（均P＜0.001）；1 d、3 d、7 d和15 d丁基苯酞中劑量組Ang-2蛋白表達均明顯高于低劑量組（P=0.031，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

2.4 丁基苯酞對新生血管的影響 假手術(shù)組不同時間點新生血管計數(shù)極少，腦出血模型組和丁基苯酞組新生血管計數(shù)均明顯增加，并隨出血時間延長表達逐漸增加，于15 d達高峰；與腦出血模型組相比，丁基苯酞低（P=0.038，P＜0.001，P＜0.001，P=0.016）、中劑量組（均為P＜0.001）新生血管計數(shù)在1 d、3 d、7 d和15 d均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；1 d、3 d、7 d和15 d丁基苯酞中劑量組新生血管計數(shù)均高于低劑量組（P=0.033，P=0.008，P＜0.01，P=0.019），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表4，圖1）。

2.5 丁基苯酞對血管場面積的影響 術(shù)后3 d、7 d、15 d腦出血模型組較假手術(shù)組相比血管場面積均增加（均為P＜0.001），并隨出血時間延長逐漸增大，于15 d達高峰；術(shù)后3 d、7 d、15 d丁基苯酞中劑量組與腦出血模型組比較血管場面積均增加（均為P＜0.001）；術(shù)后7 d、15 d丁基苯酞中劑量組與丁基苯酞低劑量組比較血管場面積均增加（P=0.044，P=0.031），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表5）。

2.6 丁基苯酞對血腫體積的影響 丁基苯酞低、中劑量組與腦出血模型組在術(shù)后7 d、15 d血腫體積均無明顯差異（表6）。

表2 不同時間點各組大鼠VEGF蛋白與β-actin光密度比值

表3 不同時間點各組大鼠Ang-2蛋白與β-actin蛋白光密度比值

表4 不同時間點各組大鼠新生血管計數(shù)（單位：個）

3 討論

近年來，NVU已成為卒中研究的熱點。NVU是由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、微血管內(nèi)皮細胞、周細胞及細胞外基質(zhì)等細胞組分構(gòu)成的一種結(jié)構(gòu)和功能相對獨立的多細胞復(fù)合體[7]。NVU這一概念的提出引導(dǎo)了治療策略從對單一神經(jīng)元的保護向?qū)ι窠?jīng)元、微血管及支持細胞復(fù)合體的保護。血管新生是指從原有的血管上以出芽的方式形成新的血管的過程[8-10]，治療性血管新生又稱為促血管新生，是人為的誘導(dǎo)缺血組織周圍的血管新生和側(cè)支血管形成，在ICH中可改善NVU中的微血管系統(tǒng)，為損傷的神經(jīng)元修復(fù)及突觸重建創(chuàng)造良好的微環(huán)境。因此，促進血管新生有望成為出血性卒中治療的新靶點。

圖1 不同時間點各組大鼠新生血管計數(shù)（SP法染色，×200）

VEGF是序列高度保守的二聚體糖蛋白，是血管內(nèi)皮細胞特異性的有絲分裂原，是目前發(fā)現(xiàn)的機體內(nèi)最重要的促血管生長因子。VEGF與受體VEGFR-1、VEGFR-2等結(jié)合后，激活絡(luò)氨酸激酶，導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流從而引發(fā)級聯(lián)放大反應(yīng)過程，引起血管內(nèi)皮細胞通透性增加及形成臨時基質(zhì)、介導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、分化等一系列生物效應(yīng)，促進血管生成[11]。Ang-2是血管生成素家族成員之一。當VEGF等促血管生成因子存在時，Ang-2通過抑制Ang-1促血管穩(wěn)態(tài)的作用，使細胞外基底膜及管周細胞松解，并使血管內(nèi)皮細胞處于對VEGF的高反應(yīng)狀態(tài)，有利于血管出芽、生長，與VEGF協(xié)同作用促進內(nèi)皮細胞的遷移、血管的新生，增加缺血區(qū)血管密度，重建微血管系統(tǒng)[12-15]。Jeremy Ben-Shoshan等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)導(dǎo)管主動脈瓣置換術(shù)（Transcatheter aortic valve replacement，TAVR）患者潛在血管生成轉(zhuǎn)變與VEGF和Ang-2蛋白的表達增加具有明顯相關(guān)性。Siobhan Conroy等[17]研究表明，Ang-2和VEGFA蛋白的高表達與膠質(zhì)母細胞瘤（Glioblastoma，GBM）的血管生成具有很強的正相關(guān)性。

表5 不同時間點各組大鼠血管場面積（單位：‰）

表6 不同時間點各組大鼠血腫體積（單位：mm3）

研究發(fā)現(xiàn)CD34抗原在新生血管內(nèi)皮中表達遠遠大于非新生血管內(nèi)皮，是最敏感的新生血管內(nèi)皮標志物，CD34陽性表達是檢測早期新生血管的良好方法[18]，可作為缺血組織周圍微循環(huán)改善的依據(jù)。本研究利用CD34標記新生血管，發(fā)現(xiàn)腦出血模型組新生血管計數(shù)隨出血時間延長表達逐漸增加，與VEGF、Ang-2蛋白表達呈現(xiàn)并行關(guān)系，均在ICH后7～15 d達到高峰，與Peng Zhengrong等[19]和Rebecca Senn等[20]的研究結(jié)果相一致。進一步證明ICH后新生血管與VEGF、Ang-2蛋白表達的持續(xù)升高密切相關(guān)。其原因可能與ICH時血腫的壓迫導(dǎo)致局部微循環(huán)破壞，血腫及血腫周圍區(qū)缺血缺氧進而啟動了腦組織抵抗缺血和缺氧的防御性反應(yīng)，使腦組織VEGF及其受體表達上調(diào)有關(guān)。

丁基苯酞（dl-3-n-butylphthalide）是由芹菜籽中提取出的有效成分左旋丁基苯酞與其合成的異構(gòu)體右旋丁基苯酞兩者的混合物。目前對于丁基苯酞的研究也主要集中在缺血性腦血管病的治療方面。研究發(fā)現(xiàn)丁基苯酞具有重構(gòu)缺血區(qū)微循環(huán)、增加缺血區(qū)腦灌注[21]、保護線粒體、抑制神經(jīng)細胞凋亡[22]、清除自由基[23]、減少炎癥反應(yīng)及氧化反應(yīng)[24]、減輕腦水腫[25]等作用。Zhao Yujun等[26]采用Longa改良縫線閉塞法制備永久性大腦中動脈閉塞模型，發(fā)現(xiàn)丁基苯酞可增加VEGF的表達，緩解腦梗死小鼠的腦水腫，降低血腦屏障的通透性，改善小鼠神經(jīng)功能缺損，與Tang S.C.等[27]研究結(jié)果相一致。Li Wenxin等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腦低灌注大鼠模型中，經(jīng)丁基苯酞治療后Ang-2、VEGF蛋白表達量在相應(yīng)的時間均明顯增加。目前，丁基苯酞用于ICH的研究較少，本研究結(jié)果提示丁基苯酞干預(yù)后可以上調(diào)VEGF、Ang-2蛋白表達，增加ICH血腫周圍新生血管密度，減輕神經(jīng)功能缺損。同時，通過對血腫體積的測量，初步證明丁基苯酞并未增加顱內(nèi)出血的風(fēng)險。

【點睛】本研究顯示丁基苯酞可以上調(diào)VEGF和Ang-2蛋白的表達，促進血腫周圍血管新生并改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損。