廖小豆， 曹雅詩， 艾思欣， 楊 艷， 湯鑫慧， 劉 蕓，周夢潔， 鄒 振， 楊榮華

(長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南長沙 410114)

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的疾病之一，它嚴(yán)重威脅患者的健康并影響其生活質(zhì)量[1]。目前，癲癇最主要及最常用的治療手段仍然是藥物治療[2]。鹽酸噻加賓(TGB)是一種新型的抗癲癇藥物，其作用機(jī)制是阻滯神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對γ-氨基丁酸(GABA)的再攝取，增加突觸部位GABA的水平，從而達(dá)到抗癲癇的作用[3]。然而，研究表明TGB的過量使用會(huì)產(chǎn)生一系列的副作用，例如頭暈無力、腹部疼痛、體重變化、思想異常、認(rèn)知能力下降、精神運(yùn)動(dòng)遲緩和抑郁等[4 - 7]，甚至還可能導(dǎo)致患者產(chǎn)生自殺的想法或行為[8]。因此，TGB的檢測對指導(dǎo)臨床用藥具有重大的意義。

目前，TGB的檢測方法為高效液相色譜法(HPLC)[9 - 10]。該方法選擇性好，準(zhǔn)確度高，但是存在樣品預(yù)處理復(fù)雜，分析成本高，檢測時(shí)間長，對操作人員要求高等缺點(diǎn)[11]。熒光光譜法由于其靈敏度高、選擇性好、檢測成本低廉和操作簡便等特點(diǎn)，已經(jīng)在診斷學(xué)、藥理學(xué)、病理學(xué)、化學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，已成為一種必不可少的分析手段[12]。但單一發(fā)射的熒光探針容易受到周圍環(huán)境、自身濃度和檢測儀器等因素的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性降低[13]。而同時(shí)具有兩個(gè)或多個(gè)熒光發(fā)射峰的比率型熒光探針，可以通過自身信號峰進(jìn)行校正，提高檢測的準(zhǔn)確性[14]。

人血清白蛋白(HSA)是人血漿中含量最為豐富的蛋白質(zhì)，其含量約占血漿總蛋白的60%[15]。HSA有兩個(gè)主要的配體結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ)，能夠與多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)相結(jié)合[16]。因此，HSA也常常被用作蛋白載體，用于脂肪酸、類固醇激素、藥物等物質(zhì)的輸送[17]。同時(shí)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道有些熒光分子也可與HSA發(fā)生選擇性位點(diǎn)結(jié)合，改變熒光分子的光致發(fā)光性質(zhì)。然而，目前報(bào)道的HSA結(jié)合熒光探針皆為熒光增強(qiáng)型，只適用于HSA檢測或 “Turn-off” 模式下的位點(diǎn)篩選[18 - 20]。在本工作中，我們發(fā)現(xiàn)染料苝二酰亞胺衍生物(PDI)能與HSA的位點(diǎn)Ⅱ結(jié)合，并發(fā)生熒光猝滅。本文利用這一獨(dú)特的現(xiàn)象，并選擇位點(diǎn)Ⅰ結(jié)合探針茜素絡(luò)合指示劑(AC)為內(nèi)標(biāo)物，構(gòu)建了內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針(PDI-HSA-AC)。該熒光探針對尿液中TGB具有很好響應(yīng)，并呈現(xiàn)出明顯的比率熒光識別特點(diǎn)，有望用于臨床藥物分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

UV-2700紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；PTI熒光分光光度計(jì)(美國，PTI公司)。

人血清白蛋白(HSA)購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。布洛芬購于生工生物工程股份有限公司。丹酰胺(DNSA)購于梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。鹽酸噻加賓(TGB)以及其他生化試劑均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。染料苝二酰亞胺衍生物(PDI)由于聰教授課題組提供。本研究所用的化學(xué)試劑均為分析純，未經(jīng)任何處理。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 紫外-可見吸收光譜與熒光光譜的測定

將PDI和HSA分別溶于50%的乙醇和超純水中，均配成1 mmol/L的母液，使用時(shí)均用超純水稀釋至所需濃度。取一定體積PDI母液稀釋為10 μmol/L，通過紫外-可見分光光度計(jì)測量PDI的最大激發(fā)波長。在所得的最大激發(fā)波長處測定PDI中加入一系列呈梯度濃度的HSA之后的溶液熒光強(qiáng)度的變化。分別取一定體積的PDI和HSA，稀釋為一系列比例濃度為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1(PDI∶HSA)的溶液，通過熒光光譜儀測得一系列的熒光強(qiáng)度F，再將HSA換成超純水作為空白對照，測得的一系列熒光強(qiáng)度F0，分別取最大發(fā)射處的熒光強(qiáng)度值計(jì)算F/F0，以此探究PDI和HSA的最佳結(jié)合比。

為考察PDI與HSA結(jié)合位點(diǎn)，選取兩種HSA位點(diǎn)標(biāo)志物：位點(diǎn)Ⅰ的標(biāo)志物丹酰胺(DNSA)，位點(diǎn)Ⅱ的標(biāo)志物布洛芬(Ibuprofen)。將上述兩種位點(diǎn)標(biāo)志物分別加入到10 μmol/L PDI和10 μmol/L HSA的混合溶液體系中，分別改變位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ標(biāo)志物的濃度，測量溶液熒光強(qiáng)度的變化。

圖1 基于人血清白蛋白占位的內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針檢測抗癲癇藥物鹽酸噻加賓的原理圖Fig.1 Schematic illustration of human serum albumin-occupying-based internal standard ratio fluorescent probe for determination of anti-epileptic drug tiagabine hydrochloride

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針PDI-HSA-AC的構(gòu)建及檢測原理

圖1為基于HSA占位的內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針檢測抗癲癇藥物TGB的原理圖。染料苝二酰亞胺衍生物(PDI)具有強(qiáng)烈的熒光，當(dāng)PDI結(jié)合在HSA的位點(diǎn)Ⅱ時(shí)，PDI的熒光發(fā)生猝滅，茜素絡(luò)合指示劑(AC)作為內(nèi)標(biāo)物結(jié)合在HSA的位點(diǎn)Ⅰ。當(dāng)存在TGB時(shí)，TGB與HSA發(fā)生位點(diǎn)競爭性結(jié)合，置換出具有熒光性質(zhì)的PDI，并且TGB的存在基本不影響AC的熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)對TGB的比率熒光法的檢測。

2.2 PDI和HSA相互作用的光譜特性及選擇性分析

圖2A為10 μmol/L PDI溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜。可以看出PDI在波長為385 nm和500 nm處均有吸收。其中，在500 nm處顯示最強(qiáng)的吸收峰，故在后續(xù)考察PDI與HSA的相互作用實(shí)驗(yàn)中選擇的激發(fā)波長為500 nm。此外，以500 nm為激發(fā)波長，發(fā)現(xiàn)PDI在549 nm波長處有最強(qiáng)的發(fā)射。

通過熒光變化研究了PDI與HSA之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示，隨著HSA的濃度不斷升高，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸降低。表明HSA對PDI的熒光具有猝滅作用，推測該猝滅作用是來源于PDI和HSA的結(jié)合。

采用了等摩爾連續(xù)變化法考察了PDI與HSA之間相互作用的結(jié)合比。如圖2C所示，以熒光強(qiáng)度的比值F/F0(F和F0分別為存在和不存在HSA的體系的熒光強(qiáng)度)對兩者摩爾比作圖。從圖中可以看出PDI與HSA之間是單一的鍵合模式，最佳的猝滅比即結(jié)合比為1∶1。

為了考察PDI對不同的氨基酸和蛋白質(zhì)的選擇性，在10 μmol/L PDI溶液中分別加入L-谷氨酸，L-精氨酸、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、溶菌酶和HSA，結(jié)果如圖2D所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)除了HSA之外，其它的氨基酸和蛋白質(zhì)對溶液體系的熒光幾乎無影響，由此可見PDI對HSA具有很好的選擇性。

圖2 (A)10 μmol/L PDI溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜；(B)在10 μmol/L PDI溶液中加入不同濃度的HSA之后的熒光光譜(λex=500 nm)；(C)PDI與HSA的等摩爾變化曲線(λex=500 nm，λem=549 nm)；(D)不同氨基酸和蛋白質(zhì)對PDI熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 (A) Excitation and emission spectra of 10 μmol/L PDI solution;(B) Fluorescence spectra of PDI upon titrating with HSA(λex=500 nm);(C) Isomolar curve of PDI and HSA(λex=500 nm,λem=549 nm);(D) Effect of various amino acids and proteins on fluorescence intensity of PDI

2.3 PDI與HSA的結(jié)合位點(diǎn)研究

眾所周知，HSA有兩個(gè)主要的結(jié)合位點(diǎn)，分別是位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ。利用位點(diǎn)競爭實(shí)驗(yàn)，可以探究PDI與HSA的結(jié)合位點(diǎn)。如圖3A和3B所示，在10 μmol/L PDI和10 μmol/L HSA的混合溶液體系中，分別加入不同濃度的位點(diǎn)Ⅰ的標(biāo)志物丹酰胺(DNSA)和位點(diǎn)Ⅱ的標(biāo)志物布洛芬(Ibuprofen)，結(jié)果顯示加入不同濃度的丹酰氯之后，溶液的熒光強(qiáng)度基本沒有變化，而加入不同濃度的布洛芬之后，溶液的熒光強(qiáng)度隨著其濃度的增加而升高。表明布洛芬的加入，使得與HSA結(jié)合的PDI被置換下來，從而恢復(fù)PDI的熒光，因此可以說明PDI與HSA的結(jié)合位點(diǎn)是位點(diǎn)Ⅱ。

圖3 PDI與HSA結(jié)合位點(diǎn)的熒光光譜。(A)不同濃度DNSA存在下HSA和PDI體系的熒光光譜；(B)不同濃度Ibuprofen存在下HSA和PDI體系的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of the binding sites of PDI and HSA.(A) Fluorescence spectra of HSA and PDI systems in the presence of various concentration of DNSA;(B) Fluorescence spectra of HSA and PDI systems in the presence of various concentration of Ibuprofen

2.4 探針對TGB的檢測實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AC由于疏水性可與HSA的位點(diǎn)Ⅰ結(jié)合[21]。而TGB可以和HSA位點(diǎn)的Lys-414，Arg-410，Arg-485，Leu-453，Ser-489，Tyr-411等氨基酸殘基相互作用，占據(jù)HSA的結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ[8]，這為TGB的比率熒光檢測提供了理論依據(jù)。首先，考察了AC的光譜性質(zhì)以及AC、HSA、PDI和TGB的相互影響，結(jié)果如圖4A和圖4B所示。圖4A為20 μmol/L AC溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜，由圖可知AC的最大激發(fā)波長為385 nm，最大發(fā)射波長為443 nm，由于385 nm的激發(fā)光能同時(shí)激發(fā)PDI和AC，實(shí)驗(yàn)中選擇激發(fā)波長為385 nm。由圖4B的熒光光譜可以看出，TGB的加入恢復(fù)了PDI的熒光，且HSA、PDI和TGB對AC的熒光信號均無影響，表明AC可作為內(nèi)標(biāo)物，可實(shí)現(xiàn)比率熒光法檢測TGB。

圖4 (A)20 μmol/L AC溶液的激發(fā)和發(fā)射光譜；(B)AC、HSA、PDI和TGB相互作用的熒光光譜(λex=385 nm)；(C)溫度對檢測TGB實(shí)驗(yàn)的影響(λex=385 nm，λem=549 nm)；(D)PDI-HSA-AC探針對TGB響應(yīng)時(shí)間的考察(λex=385 nm，λem=549 nm)Fig.4 (A) Excitation and emission spectra of 20 μmol/L AC solution;(B) Fluorescence spectra of AC HSA,PDI and TGB interactions(λex=385 nm);(C) The influence of temperature on TGB detection experiment(λex=385 nm,λem=549 nm);(D) Response time of PDI-HSA-AC probe to TGB(λex=385 nm,λem=549 nm)

經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的濃度分別為10 μmol/L、10 μmol/L和70 μmol/L的PDI、HSA和AC三元復(fù)合物比率熒光探針(PDI-HSA-AC)對TGB進(jìn)行檢測。

2.4.1 溫度對檢測TGB的影響設(shè)置溫度分別為20、25、30、35、37、40 ℃，考察不同溫度下熒光探針PDI-HSA-AC(PDI、HSA和AC的濃度分別為10 μmol/L，10 μmol/L和70 μmol/L)的熒光強(qiáng)度(F0)，以及在探針中加入200 μmol/L TGB之后的熒光強(qiáng)度(F)，通過計(jì)算不同溫度下F/F0比值的大小，研究溫度對檢測TGB實(shí)驗(yàn)的影響，如圖4C所示。其中，F(xiàn)和F0分別為有和無TGB存在情況下體系的熒光強(qiáng)度。從圖中可以看出，熒光強(qiáng)度比值F/F0幾乎不隨溫度的變化而變化，表明溫度對TGB的檢測基本沒有影響。

2.4.2 探針的靈敏度和穩(wěn)定性通過熒光光譜時(shí)間掃描，考察內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針PDI-HSA-AC對檢測TGB的響應(yīng)速度以及穩(wěn)定性。首先對探針體系PDI-HSA-AC進(jìn)行1 min的時(shí)間掃描，然后分別加入100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L TGB，繼續(xù)時(shí)間掃描，觀察溶液熒光強(qiáng)度的變化情況。如圖4D所示，在探針體系中分別加入100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L TGB之后，溶液的熒光強(qiáng)度立即上升，并且在十幾秒鐘之內(nèi)達(dá)到平衡并保持穩(wěn)定。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針PDI-HSA-AC對TGB的檢測具有快速響應(yīng)性以及優(yōu)異的穩(wěn)定性。

2.4.3 方法的線性范圍和檢出限利用探針測定不同濃度TGB對應(yīng)的熒光強(qiáng)度。如圖5A～5C所示，隨著TGB的濃度增加，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。在TGB濃度為1～100 μmol/L的范圍內(nèi)，該探針對TGB的檢測具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.990，且通過檢出限的計(jì)算公式(LOD=3σ/S，σ為11次空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為所得到的線性關(guān)系的斜率[22])得到該探針的檢出限為0.527 μmol/L，由此可見該比率型熒光探針對TGB的檢測具有較低的檢出限。

圖5 (A)內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針PDI-HSA-AC檢測不同濃度TGB的熒光光譜；(B)比率熒光強(qiáng)度(F549/F443)和TGB(1～600 μmol/L)濃度的關(guān)系；(C)比率熒光強(qiáng)度(F549/F443)和TGB(1～100 μmol/L)濃度的線性關(guān)系；(D)內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針PDI-HSA-AC對TGB的選擇性Fig.5 (A) The fluorescence spectra of different concentrations of TGB were detected by the internal standard ratio fluorescent probe PDI-HSA-AC;(B) Relationship between ratio fluorescence intensity(F549/F443) and the concentration of TGB(1～600 μmol/L);(C) The linear relationship between ratio fluorescence intensity(F549/F443) and the concentration of TGB(1～100 μmol/L);(D) Selectivity of the internal standard ratio fluorescent probe PDI-HSA-AC for TGB

2.4.4 探針的選擇性實(shí)驗(yàn)為考察內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針PDI-HSA-AC對TGB的選擇性，選取Cl-、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、葡萄糖、半胱氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、加巴噴丁、卡馬西平、丙戊酸鈉、苯妥英鈉、尿素、尿酸等多種離子、氨基酸和藥物等。將上述物質(zhì)和TGB的濃度都固定為200 μmol/L，分別加入到熒光探針PDI-HSA-AC體系中，測量溶液熒光強(qiáng)度的變化。如圖5D所示，除了TGB可以使得探針的比率熒光強(qiáng)度(F549/F443)增強(qiáng)之外，其它的離子、氨基酸和藥物等對探針的比率熒光強(qiáng)度只有輕微的變化，這說明該探針對TGB具有較好的選擇性。

2.5 實(shí)際樣品尿液中TGB的檢測

尿液樣品取自健康的女性捐贈(zèng)者。將尿液用超純水稀釋10倍，加入探針PDI-HSA-AC和不同濃度的TGB，分別測其熒光強(qiáng)度值，重復(fù)3次，計(jì)算TGB在尿液中的回收率。如表1所示，尿液中添加TGB的回收率較好，證明了我們構(gòu)建的探針在復(fù)雜生物環(huán)境中檢測TGB的準(zhǔn)確性和選擇性。因此，該探針為實(shí)際樣品中TGB的檢測提供了一種靈敏、選擇性好的比率熒光檢測方法。

表1 人體尿樣中TGB含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本工作成功構(gòu)建了PDI-HSA-AC三元配合物體系的內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針，探究了它的熒光光譜特性以及對鹽酸噻加賓(TGB)的檢測。結(jié)果表明該探針對TGB的檢測具有很好的響應(yīng)性和選擇性，能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)際尿液中TGB的高靈敏分析。該內(nèi)標(biāo)型比率熒光探針具有構(gòu)造簡單、抗干擾能力強(qiáng)、易操作等優(yōu)勢，探針還可擴(kuò)展至其它HSA結(jié)合藥物的檢測，在臨床藥物分析中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。