呂文毅， 李 雪， 郭青娟， 鄒鴻雁， 黃承志*

(1.發(fā)光與實(shí)時(shí)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715; 2.生化醫(yī)學(xué)分析重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715)

細(xì)菌是所有生物中數(shù)量最多的一類，它是最為常見的一種病原體，可引起許多嚴(yán)重疾病的爆發(fā)[1 - 2]，如肺結(jié)核、淋病、梅毒、鼠疫等?？咕牧鲜侵竿ㄟ^(guò)一定工藝，將抗菌劑添加到基體材料中制備成的具有殺滅和抑制微生物生長(zhǎng)的一類新型功能材料[3]，該材料在醫(yī)療衛(wèi)生、家庭用品、家用電器、食品包裝等領(lǐng)域有極其廣闊的應(yīng)用前景。在人們對(duì)環(huán)境衛(wèi)生要求日益提高的今天，抗菌材料的應(yīng)用受到更加廣泛的關(guān)注。

圖1 Cu2-xSe NCs抗菌活性示意圖Fig.1 Schematic representation of the antibacterial activity of Cu2-xSe NCs

對(duì)病原微生物有殺死或抑制生長(zhǎng)作用的抗菌劑是抗菌材料的核心部分，它可分為無(wú)機(jī)抗菌劑、有機(jī)抗菌劑和天然抗菌劑[4]。其中，無(wú)機(jī)抗菌劑一般利用銀、銅、鋅等金屬自身的抗菌能力而制成抗菌劑[5]，其耐熱性較好且抗菌廣譜；有機(jī)抗菌劑主要為香草醛或乙基香草醛類化合物[6]，但耐熱性較差，容易水解，且有效期短；天然抗菌劑主要來(lái)源于天然植物的提取，這也導(dǎo)致其數(shù)量較少且不能廣譜抗菌。納米技術(shù)的快速發(fā)展提供了用納米材料控制病原微生物的可能和機(jī)會(huì)，由于其具有獨(dú)特的化學(xué)和物理性質(zhì)，現(xiàn)今已成為新型抗菌劑[7 - 8]。與銀相比，銅的價(jià)格更低廉，且對(duì)各種細(xì)菌菌株具有優(yōu)異的抗菌活性，因此銅基納米材料越來(lái)越受歡迎。革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌對(duì)銅基納米顆粒特別敏感，因此可用于治療燒傷、手術(shù)傷口和糖尿病足潰瘍感染[9]。作為抗菌劑，硫?qū)巽~化物擁有耐熱性好、毒性低的優(yōu)點(diǎn)，且可廣譜持續(xù)抗菌[10]?；诹?qū)巽~化物的這些特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)利用硫?qū)巽~化物的重要代表之一的硒化銅納米晶體(Cu2-xSe NCs)進(jìn)行廣譜抗菌。我們以常見的E.coli(革蘭氏陰性菌)和S.aurues(革蘭氏陽(yáng)性菌)為模型菌株(圖1)，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌存活率、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和殺菌曲線，納米材料的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，以及殺菌動(dòng)力學(xué)來(lái)評(píng)價(jià)Cu2-xSe NCs的抗菌性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cu2-xSe NCs對(duì)大腸桿菌及其耐藥菌株的MIC均為32 μg/mL，而對(duì)金黃色葡萄球菌及其耐藥菌株的MIC則為4 μg/mL，這是由于大腸桿菌具有雙層膜而金黃色葡萄球菌僅有單層膜。此外，僅需32 μg/mL Cu2-xSe NCs就可在1 h內(nèi)殺死所有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，證明了Cu2-xSe NCs擁有良好的抗菌性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)菌實(shí)驗(yàn)使用的所有玻璃器皿、試劑和材料均用LDZX-40SBI蒸汽壓力滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)進(jìn)行高溫滅菌；所有細(xì)菌實(shí)驗(yàn)均在SW-CJ-IF(蘇凈集團(tuán)安泰公司)潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行；細(xì)菌培養(yǎng)均在型號(hào)為QYC211 INCUBATOR SHAKER的全溫空氣搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)中進(jìn)行；Biotek多功能酶標(biāo)儀Synergy H1(美國(guó))用于測(cè)定細(xì)菌的OD600；實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌菌種均在-80 ℃的冰箱中保存，接種和純化后的細(xì)菌均在0 ℃的冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料

合成Cu2-xSe NCs所用的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和CuSO4·5H2O(99%)從國(guó)藥化學(xué)試劑(上海)有限公司購(gòu)買。SeO2(99.9%)購(gòu)自阿拉丁化學(xué)(上海)有限公司。維生素C(VC)購(gòu)自Alfa Aesar Co.Ltd(美國(guó))。配制細(xì)菌Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基所用酵母提取物來(lái)自拜爾迪生物(OXOID)公司，蛋白胨來(lái)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，NaCl(分析純)來(lái)自成都市科龍化工試劑廠，瓊脂粉來(lái)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)中其他溶劑均為分析純，水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

實(shí)驗(yàn)菌種大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli,ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus,ATCC 25923)、大腸桿菌耐藥菌(L339)、金黃色葡萄球菌耐藥株(L393)均由西南醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.3 硒化銅納米晶體的制備

本文采用溫和的室溫水相法合成Cu2-xSe NCs。具體方法參照Lie等的合成原理[11]并略有改進(jìn)。將800 μL 30 mmol/L CTAB和2.4 mL H2O加入圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下，依次加入50 μL 0.2 mol/L SeO2和300 μL 0.2 mol/L VC。反應(yīng)10 min后，加入50 μL 0.4 mol/L CuSO4·5H2O和400 μL 0.2 mol/L VC。劇烈攪拌混合溶液，在30 ℃下反應(yīng)1.5 h，并將混合溶液用10 kDa透析袋透析純化24 h以去除小分子，然后再離心去除大分子。將合成的等離子體Cu2-xSe NCs儲(chǔ)存在4 ℃冰箱，待用。

1.4 培養(yǎng)基的配制

按照每1 L培養(yǎng)液中含5 g酵母提取液、10 g蛋白胨、10 g NaCl、15 g瓊脂的比例配制LB固體培養(yǎng)基，并按照每200 mL培養(yǎng)液中含1 g酵母提取液、2 g蛋白胨、2 g NaCl的比例配制LB液體培養(yǎng)基。將制備的培養(yǎng)基放入錐形瓶中，搖晃均勻，并配制50 mL含0.9%NaCl溶液備用。將抑菌實(shí)驗(yàn)使用的培養(yǎng)皿、試管(試管上端用棉花堵住)、移液槍槍頭、EP管(微量離心管)，以及加入培養(yǎng)液的錐形瓶、加入NaCl溶液的廣口瓶、接純水的廣口瓶用報(bào)紙包好，在高溫滅菌鍋中于120 ℃滅菌30 min。待滅菌鍋降溫至60 ℃ 左右時(shí)取出所有物品，并輕輕搖晃錐形瓶中的培養(yǎng)液使其混合均勻，待沒有氣泡后將其倒入培養(yǎng)皿中使其自然冷卻凝固，用保鮮膜包裹后放入4 ℃的冰箱中待用。上述過(guò)程均在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行，且無(wú)菌操作臺(tái)必須提前打開紫外燈殺菌30 min，傾倒培養(yǎng)液和自然冷卻的過(guò)程需一直通風(fēng)確保沒有雜菌。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)菌株細(xì)菌懸液的配制

于-80 ℃冰箱中取出標(biāo)準(zhǔn)菌株，將接菌環(huán)置于酒精燈上直至燒紅，冷卻后用接菌環(huán)沾取菌液在培養(yǎng)基上輕輕平行地畫線，梯度稀釋三次。將畫好線的培養(yǎng)基置于全溫空氣搖床中進(jìn)行細(xì)菌的一代活化，時(shí)間為12 h。取出一代活化的細(xì)菌，重復(fù)接菌的步驟，挑取單菌落，將其放入全溫空氣搖床，在37 ℃下孵育12 h進(jìn)行細(xì)菌的二代活化。測(cè)其OD值，當(dāng)OD在0.6～0.8，表明細(xì)菌處于旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

向試管中加入1 mL 0.9% NaCl溶液，將接菌環(huán)置于酒精燈上直至燒紅，冷卻后用接菌環(huán)挑取單菌落，并將其放入試管中，讓細(xì)菌分散于NaCl溶液中，此時(shí)溶液將變得渾濁。采用BaSO4比濁法，制得濃度為1.0×108CFU/mL(CFU：菌落形成單位)的細(xì)菌懸液。以下抑菌實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌懸液均在此基礎(chǔ)上稀釋了100倍，即細(xì)菌懸液的濃度均為1.0×106CFU/mL。以上步驟均在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行。

1.6 細(xì)菌存活率的測(cè)定

取100 μL濃度為1.0×106CFU/mL的細(xì)菌懸液，100 μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液和800 μL LB液體培養(yǎng)基加入已滅菌的試管，混合均勻后放入恒溫?fù)u床，在37 ℃、120 r/min下孵育24 h。用酶標(biāo)儀測(cè)其OD600值并計(jì)算細(xì)菌的存活率。

1.7 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定

最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)是描述藥物抗菌活性的主要定量參數(shù)，也是衡量抗菌試劑抑菌能力的重要指標(biāo)。在本文中，我們使用液體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定MIC和MBC。取一系列EP管并寫上編號(hào)，采用二倍稀釋法，依次加入100 μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液，再加入100 μL 1.0×106CFU/mL細(xì)菌懸液和800 μL LB液體培養(yǎng)基，混勻后置于37 ℃全溫?fù)u床孵育24 h。取出試管，觀察各EP管的渾濁程度，第一個(gè)澄清透明的EP管所對(duì)應(yīng)的濃度即為MIC。

將所有未生長(zhǎng)細(xì)菌試管及MIC的前一個(gè)試管中的培養(yǎng)液取200 μL轉(zhuǎn)移到干凈的固體LB培養(yǎng)基上，涂板并在37 ℃全溫?fù)u床中孵育12 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。如果培養(yǎng)基上有菌落出現(xiàn)，則說(shuō)明該濃度只能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)而不能殺死細(xì)菌，若無(wú)菌落或只有少量菌落(小于5)出現(xiàn)則表明該濃度有殺菌效果。第一個(gè)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的板所對(duì)應(yīng)的濃度即為MBC。

1.8 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取一塊96孔板進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，向每孔中加入100 μL溶液，該溶液為1.0×106CFU/mL細(xì)菌懸液和Cu2-xSe NCs的混合溶液。其中，對(duì)于E.coli，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、2、4、8、16、32 μg/mL；對(duì)于S.aureus，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5、1、2、4、8 μg/mL。每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣，第4個(gè)孔為調(diào)零孔，該孔溶液為只含有相應(yīng)濃度Cu2-xSe NCs的LB液體培養(yǎng)基，即為菌液存在。加好樣后將其置于37 ℃恒溫箱中孵育，并分別于0、1、2、4、6、8、12、16 h取出，搖勻后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600。去除底物吸光度后，以孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

1.9 時(shí)間-殺菌曲線的測(cè)定

取100 μL濃度為1.0×106CFU/mL的細(xì)菌懸液，100 μL不同濃度的Cu2-xSe NCs溶液和800 μL LB液體培養(yǎng)基加入已滅菌的試管。其中，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC，即對(duì)于E.coli，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、16、32、64、128、256 μg/mL；而對(duì)于S.aureus，Cu2-xSe NCs的濃度依次為0、2、4、8、16、32 μg/mL。每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣。加好樣后將其置于37 ℃恒溫箱中孵育，并分別于0、1、2、4、8、12 h取出，涂板后繼續(xù)置于37 ℃恒溫箱中孵育12 h，計(jì)算菌落數(shù)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌落數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制時(shí)間-殺菌曲線。

1.10 硒化銅納米晶體中銅離子的釋放

取一定量的Cu2-xSe NCs裝入10 kDa透析袋中，并將其放入500 mL超純水中，在室溫下攪拌透析。分別于1、2、4、6、8、12、24 h用原子吸收光譜儀測(cè)定透析袋外液中Cu2+的濃度并繪制Cu2+釋放曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 硒化銅納米晶體的表征

用水熱法合成的Cu2-xSe NCs分散均勻且粒徑均一，約為12.8 nm，因其獨(dú)特的銅缺陷結(jié)構(gòu)而在近紅外區(qū)具有強(qiáng)烈的局域表面等離子體共振吸收。此外，由于所用包被劑為CTAB，所以該Cu2-xSe NCs表面帶正電。Cu2-xSe NCs的表征結(jié)果見圖2。

圖2 Cu2-xSe NCs的表征。(A)Cu2-xSe NCs的透射電鏡(TEM)圖像;(B)Cu2-xSe NCs的粒度分布，其通過(guò)在視野中隨意計(jì)數(shù)100個(gè)顆粒而獲得;(C)Cu2-xSe NCs的UV-Vis吸收光譜；(D)Cu2-xSe NCs和H2O的Zeta電位Fig.2 Characterization of Cu2-xSe NCs.(A) TEM image of Cu2-xSe NCs;(B) Particle size distribution map of Cu2-xSe NCs obtained by randomly counting 100 particles in the field of view;(C) UV-Vis absorption spectrum of Cu2-xSe NCs;(D) Zeta potential of Cu2-xSe NCs and H2O

2.2 硒化銅納米晶體對(duì)常見致病菌的抗菌活性

本實(shí)驗(yàn)從Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli和S.aureus的細(xì)菌存活率、MIC和MBC三個(gè)方面考察其抗菌活性。如圖3所示，隨著Cu2-xSe NCs濃度的增加，無(wú)論是E.coli還是S.aureus，其細(xì)菌存活率都逐漸下降。此外，Cu2-xSe NCs對(duì)S.aureus的影響明顯強(qiáng)于對(duì)E.coli的影響。對(duì)于E.coli，當(dāng)Cu2-xSe NCs的濃度為32 μg/mL時(shí)，細(xì)菌存活率為0，即無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，而對(duì)于S.aureus，只需4 μg/mL的Cu2-xSe NCs已可以抑制其生長(zhǎng)。Cu2-xSe NCs對(duì)常見致病菌的MIC測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。因MIC是指引起細(xì)菌肉眼觀察下未見生長(zhǎng)的藥物最低濃度，故我們選擇肉眼可見細(xì)菌培養(yǎng)液澄清透明的EP管對(duì)應(yīng)的Cu2-xSe NCs濃度為該材料的MIC。如圖4所示，Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli的MIC為32 μg/mL，對(duì)S.aureus的MIC為4 μg/mL。這一現(xiàn)象也和其細(xì)菌存活率結(jié)果一致。

圖3 Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli(A)和S.aureus(B)細(xì)菌存活率的影響Fig.3 Effect of Cu2-xSe NCs on bacterial viability of E.coli(A) and S.aureus(B)

圖4 Cu2-xSe NCs對(duì)常見致病菌的MIC(Cu2-xSe NCs濃度單位為μg/mL)Fig.4 MIC of Cu2-xSe NCs against common pathogens(Cu2-xSe NCs concentration unit is μg/mL)

以MIC為界，將MIC及其后未長(zhǎng)菌試管和MIC的前一個(gè)試管中的培養(yǎng)液取200 μL轉(zhuǎn)移到干凈的固體LB培養(yǎng)基上，涂板并在37 ℃全溫?fù)u床中孵育12 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，結(jié)果見圖5。對(duì)于E.coli，Cu2-xSe NCs的最小殺菌濃度MBC為32 μg/mL，而對(duì)于S.aureus，Cu2-xSe NCs的最小殺菌濃度MBC則為4 μg/mL。

圖5 Cu2-xSe NCs對(duì)常見致病菌的MBCFig.5 MBC of Cu2-xSe NCs against common pathogens

2.3 硒化銅納米晶體對(duì)耐藥菌株的抗菌活性

圖6 Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli耐藥菌株(A)和S.aureus耐藥菌株(B)細(xì)菌存活率的影響Fig.6 Effect of Cu2-xSe NCs on bacterial viability of E.coli resistant strains (A) and S.aureus resistant strains (B)

考察了Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的抗菌活性，其內(nèi)容為Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli耐藥菌株和S.aureus耐藥菌株的細(xì)菌存活率、MIC和MBC三個(gè)方面。如圖6所示，Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株細(xì)菌存活率的影響和對(duì)其普通菌株的影響相似，對(duì)于E.coli耐藥菌株，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為32 μg/mL時(shí)，細(xì)菌存活率為0，而對(duì)于S.aureus耐藥菌株，只需4 μg/mL Cu2-xSe NCs。

Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的MIC也和對(duì)其普通菌株的MIC一致，對(duì)于E.coli耐藥菌株和S.aureus耐藥菌株，MIC分別為32 μg/mL和4 μg/mL(圖7)。而Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的最小殺菌濃度MBC則不太相同(圖8)。對(duì)于E.coli耐藥菌株，Cu2-xSe NCs的MBC為32 μg/mL，對(duì)于S.aureus耐藥菌株，Cu2-xSe NCs 的MBC為8 μg/mL，和Cu2-xSe NCs對(duì)S.aureus普通菌株的MBC 4 μg/mL相比，略高。

圖7 Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的MIC(Cu2-xSe NCs濃度單位為μg/mL)Fig.7 MIC of Cu2-xSe NCs against resistant strains(Cu2-xSe NCs concentration unit is μg/mL)

圖8 Cu2-xSe NCs對(duì)耐藥菌株的MBCFig.8 MBC of Cu2-xSe NCs against resistant strains

2.4 硒化銅納米晶體的抑菌動(dòng)力學(xué)

為了探究Cu2-xSe NCs對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的的抑菌動(dòng)力學(xué)，我們測(cè)定了細(xì)菌生長(zhǎng)曲線和時(shí)間-殺菌曲線。如圖9所示，對(duì)于E.coli，細(xì)菌在孵育2 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，直至12 h后進(jìn)入平臺(tái)期。隨著Cu2-xSe NCs濃度的逐漸增加，雖然細(xì)菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)并未改變，但是增長(zhǎng)速度逐漸減小，當(dāng)其濃度為16 μg/mL時(shí)，細(xì)菌在孵育8 h后才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并于12 h后進(jìn)入平臺(tái)期；而當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度增加到32 μg/mL時(shí)，即達(dá)到MIC時(shí)，細(xì)菌不再生長(zhǎng)。對(duì)于S.aureus，細(xì)菌在孵育1 h后就開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入平臺(tái)期。并且S.aureus受Cu2-xSe NCs濃度影響更大，隨著其濃度的逐漸增加，細(xì)菌的增長(zhǎng)速度大幅降低。當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度到達(dá)MIC時(shí)，細(xì)菌基本不生長(zhǎng)。再一次證明了S.aureus對(duì)Cu2-xSe NCs更敏感。

圖9 Cu2-xSe NCs抑制常見致病菌的生長(zhǎng)曲線Fig.9 The growth curve of common pathogens inhibited by Cu2-xSe NCs

時(shí)間-殺菌曲線可以評(píng)估一種抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的殺菌速率。我們?nèi)u2-xSe NCs的濃度依次為0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖10)。對(duì)于E.coli，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為0或者0.5倍MIC時(shí)，細(xì)菌數(shù)目持續(xù)增長(zhǎng)，但當(dāng)其濃度到達(dá)32 μg/mL，即Cu2-xSe NCs對(duì)E.coli最小殺菌濃度MBC時(shí)，細(xì)菌在1 h內(nèi)全部死亡。對(duì)于S.aureus，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為0時(shí)，細(xì)菌不斷生長(zhǎng)，但隨著其濃度的增加，細(xì)菌逐漸減少，當(dāng)其到達(dá)Cu2-xSe NCs對(duì)S.aureus最小殺菌濃度的MBC(4 μg/mL)時(shí)，細(xì)菌在8 h 內(nèi)全部死亡。伴隨著Cu2-xSe NCs濃度的不斷增大，細(xì)菌死亡時(shí)間愈來(lái)愈短，當(dāng)其為32 μg/mL時(shí)，細(xì)菌在1 h內(nèi)全部死亡。即，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為32 μg/mL時(shí)，不管是革蘭氏陽(yáng)性菌還是革蘭氏陰性菌，都會(huì)在1 h內(nèi)全部死亡，證明了Cu2-xSe NCs擁有較強(qiáng)的殺菌性能。

圖10 Cu2-xSe NCs抑制常見致病菌的時(shí)間-殺菌曲線Fig.10 The times-killing curve of common pathogens inhibited by Cu2-xSe NCs

2.5 硒化銅納米晶體的抗菌機(jī)制

圖11 Cu2-xSe NCs中Cu2+的釋放曲線Fig.11 Cu2+ release curve in Cu2-xSe NCs

在抗菌劑抗菌機(jī)制研究中，較為公認(rèn)的有四種途徑：其一，金屬離子接觸反應(yīng)，這也是無(wú)機(jī)抗菌劑最普遍的抗菌作用機(jī)理；其二，催化激活機(jī)理，即通過(guò)催化產(chǎn)生活性氧物質(zhì)從而殺死細(xì)菌；其三，陽(yáng)離子固定機(jī)理，即抗菌劑攜帶陽(yáng)離子基團(tuán)，以此固定負(fù)電荷的細(xì)菌，從而使其接觸性死亡并破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜；其四，細(xì)胞內(nèi)容物、酶、蛋白質(zhì)、核酸損壞機(jī)理，這是許多有機(jī)抗菌劑的抗菌機(jī)理。為考察Cu2-xSe NCs的抗菌機(jī)制，我們首先測(cè)定Cu2-xSe NCs中Cu2+的釋放曲線(圖11)，不斷增加的Cu2+濃度證明了Cu2-xSe NCs可以持續(xù)釋放Cu2+，從而實(shí)現(xiàn)持久抗菌的作用。其次，我們使用了活性氧(ROS)熒光探針DCFH-DA，并通過(guò)熒光共聚焦分析Cu2-xSe NCs與細(xì)菌作用是否有活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)Cu2-xSe NCs并不會(huì)產(chǎn)生ROS，即不是通過(guò)催化激活機(jī)理殺死細(xì)菌。Zeta電位(圖2D)證實(shí)Cu2-xSe NCs因其包被劑為CTAB，一種帶季胺鹽基團(tuán)的陽(yáng)離子表面活性劑而帶正電，證明Cu2-xSe NCs可通過(guò)陽(yáng)離子固定機(jī)理實(shí)現(xiàn)殺菌。最后我們考察了細(xì)胞內(nèi)容物、酶、蛋白質(zhì)、核酸損壞機(jī)理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Cu2-xSe NCs并不能通過(guò)該途徑滅菌。

綜上所述，Cu2-xSe NCs的殺菌性能主要依靠金屬離子接觸反應(yīng)和陽(yáng)離子固定機(jī)理實(shí)現(xiàn)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Cu2-xSe NCs擁有較強(qiáng)的殺菌性能，對(duì)常見的E.coli(革蘭氏陰性菌)和S.aureus(革蘭氏陽(yáng)性菌)表現(xiàn)出殺菌活性，并且對(duì)其耐藥菌株具有良好抑菌能力，而S.aureus對(duì)Cu2-xSe NCs更為敏感，這是由于E.coli具有雙層膜而S.aureus僅擁有單層膜。此外，當(dāng)Cu2-xSe NCs濃度為32 μg/mL時(shí)，不管是革蘭氏陽(yáng)性菌還是革蘭氏陰性菌，都會(huì)在1 h內(nèi)全部死亡，證明了Cu2-xSe NCs擁有較強(qiáng)的殺菌性能。因此，在新型抗菌藥的研究中，納米材料Cu2-xSe NCs具有成為新型抗菌劑的潛力。