周 潔，曾志鵬，李金月，陳俏媛，林萬華*

(1. 廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541004；2. 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006)

在生物界短鏈脫氫/還原酶SDR(short chain dehydrogenase/reductase, SDR)基因家族成員眾多，目前僅在人類基因組中就發(fā)現(xiàn)了75個(gè)SDR蛋白[1]，它們?cè)谖镔|(zhì)代謝途徑和信號(hào)傳遞中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，已經(jīng)證實(shí)SDR酶的缺陷或功能喪失往往會(huì)導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生，其中一些SDR基因已被證實(shí)與疾病(如阿爾茨海默癥、癌癥)以及肥胖等的發(fā)生密切相關(guān)[2-4]。SDR9C7是短鏈脫氫/還原酶(SDR)蛋白超家族成員之一，目前人們還沒有找到SDR9C7作用底物，故又稱其為SDRO(short chain dehydrogenase/reductase orphan，SDRO)。Chen Weiguo等[5]首先從小鼠胚胎和人胚胎的RNA中克隆出SDR9C7基因，發(fā)現(xiàn)二者翻譯成蛋白質(zhì)后的氨基酸序列進(jìn)化上高度保守，有83%相似性。蛋白氨基酸序列分析結(jié)果表明SDR9C7含有SDR蛋白家族保守的特征性模序，如甘氨酸富含區(qū)TGxxxGxG和催化區(qū)YxxxK，N端也有Rossmann保守區(qū)[5]。mSDR9C7基因在小鼠胚胎期第7天就開始表達(dá)，但在成年鼠和成人體內(nèi)只有肝臟組織中特異性高表達(dá)。雖然在染色體位置上與具有維甲酸或羥基類固醇脫氫酶活性的CRAD1、CRAD2和RDH4基因串聯(lián)，基因序列上與大鼠RoDH1、小鼠RDH1高度保守(相似度高達(dá)69%～70%)，但SDR9C7并沒有表現(xiàn)出維甲酸脫氫酶、3α-和20α-羥基類固醇脫氫酶、17β-和11β-羥基類固醇脫氫酶的活性，其確切功能仍不清楚。Kowalik等[6]采用N端或C端分別標(biāo)記Flag或His標(biāo)簽蛋白，免疫熒光法檢測(cè)了SDR9C7蛋白在Hela細(xì)胞的分布情況，發(fā)現(xiàn)SDR9C7在細(xì)胞內(nèi)呈典型顆粒狀分布于細(xì)胞質(zhì)中，但并沒有亞細(xì)胞器如過氧化物酶體、早期內(nèi)涵體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞核共定位結(jié)合。

研究表明脂滴在脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的細(xì)胞處理中起著重要和多樣的作用，包括疏水性維生素和信號(hào)傳導(dǎo) 前體的儲(chǔ)存、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和氧化應(yīng)激的管理、細(xì)胞和病毒多肽的成熟，儲(chǔ)存和更新[7]。HepG2細(xì)胞的油酸誘導(dǎo)單純性肝脂肪變性細(xì)胞模型已是一種較為成熟的模型，常用于肝臟細(xì)胞脂肪變性機(jī)理及小分子化合物改善作用與分子機(jī)理的研究[8-10]。饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞自噬模型也常用于對(duì)自噬體與自噬機(jī)理的研究[11-12]。雖然有研究發(fā)現(xiàn)SDR9C7蛋白其在細(xì)胞內(nèi)呈顆粒狀分布，動(dòng)物出生后SDR9C7基因僅在肝臟組織中特異性高表達(dá)，但迄今為止其具體生物學(xué)功能和確切亞細(xì)胞定位仍未知。對(duì)基因表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，能對(duì)基因功能的研究帶來很好的提示作用，也有助于對(duì)其功能做出合理的解釋。為此本文采用細(xì)胞免疫組化、激光共聚焦顯微鏡觀察法，分別檢測(cè)SDR9C7蛋白與油酸誘導(dǎo)單純性肝脂肪變性HepG2細(xì)胞模型中的脂滴、饑餓誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞自噬模型中的自噬體和正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中的高爾基體的共定位情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2(本室保存)，HepG2細(xì)胞完全培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%雙抗(青/鏈霉素100 U/mL)；DMEM、胎牛血清、PBS均購(gòu)自于Hyclone公司；高爾基體標(biāo)志蛋白抗體Anti-GM130、自噬體標(biāo)志蛋白抗體Anti-LC3B、脂滴標(biāo)志蛋白抗體Anti-Perilipin A/B(SIGMA公司)；Anti-Mouse Ig-CFL555，Anti-Rabbit IgG-CFL488(SANTA CRUZ公司)。SDR9C7蛋白抗體Anti-SDR9C7(SIGMA公司)，激光共聚焦顯微鏡(LSM 710 on Inverted Stands)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、脂滴及自噬的形成

使用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞準(zhǔn)備傳代時(shí)，胰蛋白酶消化接種至24孔板，挑取8孔放入爬片，平均每孔接種2.5×105個(gè)細(xì)胞，分別使用濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L的油酸刺激細(xì)胞24 h，以形成脂滴。為促進(jìn)自噬體的形成，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無血清饑餓培養(yǎng)24 h。以正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞做高爾基體免疫共定位，設(shè)置空白對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光

吸取孔中的培養(yǎng)基，每孔加入1 mL PBS，洗滌細(xì)胞3次，洗滌時(shí)輕搖孔板，以確保細(xì)胞形態(tài)的完整性。吸去PBS，加入300 μL 4%多聚甲醛，室溫下固定30 min。吸取多聚甲醛，PBS洗滌3次，每次洗滌時(shí)間不少于5 min，加入300 μL滲透液(含有1%Trition-X100、5%山羊血清的PBS)，37 ℃放置30 min。吸去滲透液，PBS洗滌3次，每次洗滌時(shí)間不少于5 min，加入300 μL封閉液(含有5%山羊血清的PBS)。37 ℃放置1 h。吸去封閉液，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次洗滌不少于5 min。將按抗體說明書稀釋的SDR9C7抗體分別與同樣按抗體說明書稀釋的脂滴標(biāo)志蛋白抗體Anti-Perilipin A/B、自噬體標(biāo)志蛋白抗體Anti-LC3B、高爾基體標(biāo)志蛋白抗體Anti-GM130同比例(體積比)混勻；每孔加入300 μL，孵育細(xì)胞4 ℃過夜。吸去一抗，PBS洗滌3次，每孔中加入300 μL按一定比例稀釋的Goat Anti-Mouse Ig-GFL555、Goat Anti-Rabbit IgG-CFL488的二抗，37 ℃孵育1 h。吸取二抗，PBS洗滌3次，每次洗滌時(shí)間不少于5 min，加入300 μL DAPI溶液，染核15 min。吸去DAPI，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次洗滌時(shí)間不少于5 min，加入適量抗熒光猝滅封片液，在激光共聚焦下進(jìn)行觀察拍照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 SDR9C7蛋白與脂滴的共定位結(jié)果

使用0.1 mmol/L至0.4 mmol/L的不同濃度油酸刺激HepG2細(xì)胞24 h，細(xì)胞免疫熒光(Anti-SDR9C7+Anti-Perilipin A/B)結(jié)果如圖1所示。由圖可見，脂滴主要分布于細(xì)胞質(zhì)，并隨油酸刺激濃度增加而增加，結(jié)果顯示SDR9C7為全細(xì)胞分散分布，沒有呈顆粒狀與脂滴共定位。

圖1 SDR9C7蛋白與脂滴在HepG2細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析Fig.1 Subcellular localization of SDR9C7 protein and lipid droplets in HepG2 cells

2.2 SDR9C7蛋白與自噬體共定位結(jié)果

細(xì)胞免疫熒光(Anti-SDR9C7+Anti-LC3B)結(jié)果(圖2)表明，HepG2細(xì)胞在經(jīng)過無血清培養(yǎng)饑餓24 h后，與未經(jīng)過饑餓處理的細(xì)胞相比，自噬體增多，但SDR9C7為全細(xì)胞分散分布，沒有呈顆粒狀與自噬體共定位。

2.3 SDR9C7蛋白與高爾基體共定位結(jié)果

使用DMEM+10%FBS+1%雙抗(青鏈霉素)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光(Anti-SDR9C7+ Anti-GM130)結(jié)果(圖3)表明，高爾基體分布于細(xì)胞核周圍，SDR9C7為全細(xì)胞分散分布，沒有呈顆粒狀與高爾基體共定位。

圖2 SDR9C7蛋白與自噬體在HepG2細(xì)胞中亞細(xì)胞定位分析Fig.2 Subcellular localization of SDR9C7 protein and autophagosomes in HepG2 cells

圖3 SDR9C7蛋白與高爾基體在HepG2細(xì)胞中亞細(xì)胞定位分析Fig.3 Subcellular localization of SDR9C7 protein and Golgi apparatus in HepG2 cells

3 討論

Kowalik等對(duì)N端或C端分別加有標(biāo)簽蛋白Flag或His的SDR9C7融合蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究，免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SDR9C7在細(xì)胞內(nèi)呈典型顆粒狀分布于細(xì)胞質(zhì)中，但并不與亞細(xì)胞器如過氧化物酶體、早期內(nèi)涵體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞核結(jié)合[6]。由于在成年鼠和成人體內(nèi)肝臟組織特異性高表達(dá)SDR9C7蛋白，為此本文采用免疫熒光法對(duì)人肝細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中的SDR9C7蛋白與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)脂滴、自噬體和高爾基體的共定位情況進(jìn)行了檢測(cè)，但發(fā)現(xiàn)SDR9C7為全細(xì)胞分散分布，沒有呈顆粒狀，也沒有與脂滴、自噬體和高爾基體的共定位，說明SDR9C7并沒有直接參與脂滴形成、細(xì)胞的自噬再循環(huán)活動(dòng)等，與高爾基體也無直接聯(lián)系。目前有較多文獻(xiàn)報(bào)道SDR9C7基因突變與常染色體隱性遺傳先天性魚鱗病(ARCI)相關(guān)，如提出SDR9C7基因突變?cè)斐删S生素A代謝途徑異常導(dǎo)致ARCI[13]，或認(rèn)為SDR9C7缺乏引起的LI的病理機(jī)制可能涉及角質(zhì)細(xì)胞中脂質(zhì)的異常代謝和合成缺陷，導(dǎo)致角質(zhì)層細(xì)胞間脂質(zhì)層畸形[14-15]。肝臟是維生素A和脂肪酸代謝的重要場(chǎng)所，本文研究發(fā)現(xiàn)SDR9C7為全細(xì)胞分散分布，其具體功能有待進(jìn)一步研究。