龍靖嫻，潘毓敏，潘國律，黃容誠，彭 艷*

(1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.廣西師范大學 化學與藥學學院，廣西 桂林 541004)

慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)是一種全球性的健康問題。CKD的常見病理機制是纖維化，腎小管萎縮和間質炎癥[1-2]。腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)是腎小管間質慢性損傷的一個過程，它幾乎是所有的慢性腎臟疾病進展到轉化為腎功能衰竭過程中的共同表現(xiàn)和主要的病理基礎，RIF的主要特征為腎間質成纖維細胞過度增殖以及腎間質細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度沉積。其中，含有α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)標記的肌成纖維細胞被認為是活化的成纖維細胞表型[3]。而ECM的成分比較復雜，其主要成分有Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、纖維連接蛋白(fibronectin, FN)等，因而在研究中常常通過檢測這些蛋白的表達量來判斷某組織是否發(fā)生細胞外基質的過度沉積。此外，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)腎小管間質發(fā)生纖維化不僅僅是由于肌成纖維細胞的過度增殖以及ECM的過度沉積，很多細胞因子和細胞信號通路的異常表達和轉導在腎間質纖維化的發(fā)生機制都起到重要的作用[4]。其中，TGF-β/Smad信號通路的激活，特別是涉及Smad2和Smad3，是CKD的關鍵致病機制[5]。同時，腎臟炎癥在腎臟疾病的進展中起著至關重要的作用[6]。核因子-κB(NF-κB)是炎癥反應的中樞調節(jié)劑。NF-κB可刺激成纖維細胞的增殖和分化，并可誘導腎小管細胞的炎癥和基質合成。

甲潑尼龍 (methylprednisolone sodium succinate，MPSS)為人工合成的糖皮質激素，可進入細胞核內與DNA結合，啟動RNA的轉錄，繼而合成各種酶蛋白。甲潑尼龍具有抗炎[7]、治療腫瘤[8]、治療休克[9]等作用。有研究發(fā)現(xiàn)，甲潑尼龍顯著抑制TLR-4和NF-κB的激活，通過介導TLR-4/NF-κB途徑的激活來抑制炎癥反應[10]。同時，甲潑尼龍不僅具有抗炎的作用，還具有抗肺纖維化的作用[11-12]。然而，關于甲潑尼龍對于腎纖維化的治療還未見報道。

單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)會導致腎間質纖維化，具體表現(xiàn)為腎間質成纖維細胞增殖并轉化為肌成纖維細胞，間質中FN蛋白、Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等過度沉積。隨后UUO模型就逐步被廣泛應用于腎臟纖維化的研究中。本文研究使用雄性Balb/c小鼠建立UUO模型，將甲潑尼龍應用于UUO模型小鼠，通過檢測各組小鼠梗阻側腎臟病理變化情況和腎纖維化標志性蛋白的表達，探討甲潑尼龍對腎纖維化的改善作用。此外，我們檢查了TGF-β/Smad和NF-κB信號通路蛋白的表達，擬闡明其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑

SPF級雄性Balb/c小鼠25只，體質量為18～20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。實驗小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境，給予標準的飲食和飲水，于實驗前12 h開始禁食。

甲潑尼龍購自Pfizer Manufacturing Belgium NV，批號H20130301。HE染色試劑盒和Masson染色試劑盒購自Solarbio公司。IHC染色試劑盒和а-Tubulin抗體購自中杉金橋公司。Col-1、Col3A1、NF-κB、HDAC1抗體購自Gene-Tex公司。FN、α-SMA抗體購自Sigma公司，Smad2/3、JNK抗體購自Cell Signaling公司。

1.2 動物分組和模型制備

將25只雄性Balb/c小鼠隨機分為假手術組(Sham組)、模型組(UUO組)、低劑量組(給藥劑量為3.625 mg/(kg·d)，MPSS-L組)、中劑量組(給藥劑量為7.5 mg/(kg·d)，MPSS-M組)、高劑量組(給藥劑量為15 mg/(kg·d)，MPSS-H)。通過腹腔注射體積分數(shù)10%的水合氯醛麻醉小鼠后，常規(guī)左側腹部消毒準備。對模型組和給藥組進行左側輸尿管結扎，假手術組開腹后游離左側輸尿管不予結扎。UUO模型標準化的關鍵在于無菌操作和結扎于輸尿管上1/3處。對小鼠給藥14 d，其中假手術組及模型組以等量脂肪乳進行腹腔注射，14 d后取左側腎組織用于指標檢測。

1.3 病理染色

1.3.1 HE染色

取出小鼠腎臟并用體積分數(shù)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成3 μm厚度。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，進行HE染色，使細胞核中的染色質和細胞質中的核糖體著上藍紫色，而酸性的伊紅染料則將細胞質及其胞外基質著上紅色。拍照成像，觀察組織切片的病理情況。

1.3.2 Masson三色染色

取出小鼠腎臟并用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成3 μm厚度。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，進行Masson三色染色。Masson三色染色能夠染胞核且能選擇性地顯示膠原纖維和肌纖維，即染色后膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。拍照成像，觀察組織切片的病理情況。

1.3.3 IHC染色

將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，并浸入體積分數(shù)3%過氧化氫中以阻斷內源性過氧化物酶活性。5%山羊血清封閉后，將切片與一抗4 ℃孵育過夜，然后孵育二抗15 min。切片經(jīng)DAB顯色后蘇木素染核15 s，封片拍照成像，觀察組織切片的病理情況。

免疫組化分數(shù)的評定標準：以胞漿或胞膜棕黃色顆粒狀沉積為陽性。先按陽性細胞比例將無、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計為0～4分；再按染色強度將無、弱、中、強分別計為0～3分，其中不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分；最后綜合兩部分得分相乘，總分最高為12分，分數(shù)越高，陽性越強。

1.4 蛋白質免疫印跡(Western blotting)

使用體積分數(shù)10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(濃縮膠80 V、50 min，分離膠120 V、90 min)蛋白質樣品，并轉移到硝酸纖維素膜上。隨后，用快速封閉液(購自碧云天)封閉1 h，洗滌后轉至按適當比例配置(參考說明書進行)的一抗中，4 ℃孵育過夜。再次洗滌后孵育二抗2 h，使用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒進行信號檢測。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，各指標采用均數(shù)±標準差(X±S)方式表示。采用t檢驗，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甲潑尼龍改善UUO小鼠腎間質纖維化

HE染色后小鼠腎間質纖維化程度結果見圖1。由圖1可見，假手術組小鼠左腎組織無明顯變化，腎小球結構完整，未見腎小管萎縮或擴張，未出現(xiàn)腎間質膠原化的現(xiàn)象。如箭頭所示，UUO組小鼠腎小球萎縮，部分腎小球可見纖維化呈分葉狀，腎小管、腎小囊擴張明顯。甲潑尼龍治療組小鼠也可觀察到腎小管和腎小囊擴張現(xiàn)象，但與UUO組相比腎小管的擴張等情況明顯減輕。

Masson三色染色后藍染的膠原沉積結果見圖1。由圖1可見，在假手術組中未觀察到膠原沉積。然而，如箭頭所示，UUO組的腎纖維化極為顯著，藍染色的腎纖維化區(qū)域增加。通過甲潑尼龍治療的腎臟顯示出藍染區(qū)域減少，表明由UUO誘導的腎纖維化通過甲潑尼龍治療后減弱。

每組n=5。比例尺代表100 μm。圖1 甲潑尼龍對小鼠腎臟組織病理形態(tài)的影響Fig.1 Effect of MPSS on the pathological morphology of mouse kidney

2.2 甲潑尼龍降低UUO小鼠腎臟Col-1、Col3A1、α-SMA、FN的表達

RIF的主要特征為腎間質成纖維細胞過度增殖以及腎間質細胞外基質(ECM)的過度沉積。Western blotting檢測小鼠左腎腎間質細胞外基質Col-1、Col3A1、FN和肌成纖維細胞的標志物α-SMA的表達，結果如圖2所示。UUO小鼠腎臟Col-1、Col3A1、α-SMA和FN的表達量顯著增加。然而，甲潑尼龍治療后顯著下調了Col-1、Col3A1、α-SMA和FN的表達，即甲潑尼龍可以改善UUO誘導的腎纖維化。其中β-Tubulin為對照并使用光密度分析進行定量(圖2A)。

對于UUO組與Sham組，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。對于甲潑尼龍治療組與UUO組，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。(A)Col-1、Col3A1、α-SMA和FN的蛋白免疫印跡。(B)Col-1、(C)Col3A1、(D)α-SMA和(E)FN與β-Tubulin的相對比例。圖2 甲潑尼龍對UUO小鼠腎臟Col-1、Col3A1、α-SMA和FN表達的影響Fig.2 Effects of MPSS on the expression of Col-1, Col3A1, α-SMA and FN in kidney of UUO mice

IHC染色結果也證實了Col-1、Col3A1、FN和α-SMA在小鼠腎組織中的表達，如圖3。與Sham小鼠相比，UUO小鼠腎臟中Col-1、Col3A1、FN和α-SMA的表達量顯著增加。與UUO組相比，甲潑尼龍治療組中Col-1、Col3A1、FN和α-SMA的表達量均下調，可見甲潑尼龍治療后減輕上述的變化。

對于UUO組與Sham組，**表示P<0.01，***表示P<0.001。對于甲潑尼龍治療組與UUO組，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。每組n=5。比例尺代表100 μm。(A)Col-1，Col3A1，α-SMA和FN的免疫組織化學染色。(B)Col-1、(C)Col3A1、(D)FN和(E)α-SMA的評分結果。圖3 甲潑尼龍對UUO小鼠腎臟Col-1、Col3A1、α-SMA和FN表達的影響Fig.3 Effects of MPSS on the expression of Col-1, Col3A1, α-SMA and FN in kidney of UUO mice

2.3 甲潑尼龍抑制UUO中TGF-β/Smad的表達

TGF-β/Smad信號通路的激活，特別是涉及Smad2和Smad3，是CKD進展的關鍵致病機制。其中Smad構成TGF-β信號通路的核心。TGF-β的激活會誘導Smad2/3的表達上調，從而促進腎纖維化。因此，抑制TGF-β和Smad 2/3被認為是CKD治療中涉及的主要機制[13]。Western blotting檢測小鼠腎臟TGF-β/Smad信號傳導的影響結果如圖4。與Sham組相比，UUO顯著上調TGF-β和下游組分Smad2/3、JNK的表達。與UUO組相比，甲潑尼龍治療組中TGF-β、Smad2/3、JNK均下調。其中，β-Tubulin用作對照并使用光密度分析進行定量(圖4A、B)。

IHC染色后，檢測構成TGF-β信號通路的核心Smad2/3在小鼠腎組織中的表達結果如圖5。與Sham組相比，UUO組Smad2/3的表達量顯著增加。與UUO組相比，甲潑尼龍治療組中Smad2/3表達下調。

對于UUO組與Sham組，**表示P<0.01，***表示P<0.001。對于甲潑尼龍治療組與UUO組，##表示P<0.01，###表示P<0.001。(A)Smad2/3、JNK和(B)TGF-β的蛋白免疫印跡。(C)TGF-β、(D)Smad2/3和(E)JNK與β-Tubulin的相對比例。圖4 甲潑尼龍對UUO小鼠腎臟TGF-β/Smad信號傳導的影響Fig.4 Effect of MPSS on TGF-β/Smad signal transduction in kidney of UUO mice

對于UUO組與Sham組，*表示P<0.05。對于甲潑尼龍治療組與UUO組，#表示P<0.05，##表示P<0.01。每組n=5。比例尺代表100 μm。(A)～(E)Smad2/3的免疫組織化學染色。(F)Smad2/3的評分結果。圖5 甲潑尼龍對UUO小鼠腎臟Smad2/3表達的影響Fig.5 Effect of MPSS on the expression of Smad2/3 in kidney of UUO mice

2.4 甲潑尼龍下調UUO中的NF-κB信號傳導途徑

核因子-κB(NF-κB)是炎癥反應的中樞調節(jié)劑。NF-κB可以被許多因素刺激，NF-κB的賴氨酸殘基脫乙?；贜F-κB介導的基因表達的調節(jié)中起關鍵作用，所以組蛋白去乙?；?HADC)是影響NF-κB活性的一個重要機制[14]。Western blotting分析小鼠腎臟HADC1和NF-κB表達水平的結果如圖6。HADC1和NF-κB在UUO組中的表達水平顯著高于Sham組。與UUO組相比，甲潑尼龍治療組中HADC1和NF-κB表達下調。其中，β-Tubulin為對照并使用光密度分析進行定量(圖6A)。

對于UUO組與Sham組，*表示P<0.05，**表示P<0.01。對于甲潑尼龍治療組與UUO組，#表示P<0.05，###表示P<0.001。(A)HADC1和NF-κB的蛋白免疫印跡。(B)NF-κB和(C)HADC1與β-Tubulin的相對比例。圖6 甲潑尼龍對UUO小鼠腎臟NF-κB信號傳導的影響Fig.6 Effect of MPSS on NF-κB signal transduction in UUO mice

IHC染色后檢測HADC1、NF-κB在腎組織中的表達的結果如圖7。與Sham組相比，UUO組HADC1、NF-κB的表達顯著增加。與UUO組相比，甲潑尼龍治療組中HADC1、NF-κB表達下調。

https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/western-blot對于UUO組與Sham組，*表示P<0.05，***表示P<0.001。對于甲潑尼龍治療組與UUO組，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。每組n=5。比例尺代表100 μm。(A)HADC1和NF-κB的免疫組織化學染色。(B)HADC1和(C)NF-κB的評分結果。圖7 甲潑尼龍對UUO小鼠腎臟HADC1、NF-κB表達的影響Fig.7 Effect of MPSS on the expression of HADC1 and NF-yB in kidney of UUO mice

3 討論

甲潑尼龍是一種合成的糖皮質激素，具有很強的抗炎、免疫抑制及抗過敏活性，能通過抑制細胞因子和炎癥介質的釋放，減少平滑肌增生，減輕炎癥反應。本文研究的主要發(fā)現(xiàn)是，在UUO小鼠模型中，甲潑尼龍能夠改善腎纖維化，并且進一步實驗證明甲潑尼龍通過TGF-β/Smad和NF-κB信號傳導減弱了UUO誘導的腎纖維化。

腎間質纖維化是各種進行性腎病的形態(tài)學標志，并且被認為是導致終末期腎衰竭的最終共同途徑。腎纖維化的發(fā)病機制主要特征是腎小管萎縮，肌成纖維細胞積聚和過度ECM沉積[15]。腎組織中的肌成纖維細胞被認為是ECM的主要來源。本文的研究結果顯示，UUO小鼠腎臟間質纖維化標志物α-SMA的表達增加，用甲潑尼龍?zhí)幚砟茱@著降低α-SMA表達。在本文研究中，甲潑尼龍治療的小鼠與UUO模型小鼠相比，Col-1、Col3A1、FN表達顯著降低，表明甲潑尼龍對腎功能有一定的保護作用。因此，我們認為甲潑尼龍對腎間質纖維化的影響似乎與ECM成分合成的減少直接相關。

TGF-β/Smad信號傳導途徑是誘導腎纖維化的重要途徑，其下游Smad和非Smad信號傳導途徑顯著誘導腎瘢痕形成。最近關于TGF-β信號通路的功能作用的報道[16]改變了人們對腎間質纖維化和CKD炎癥的分子機制的理解。許多研究者已經(jīng)證明TGF-β是CKD最重要且最強烈的纖維化誘導因子[1，17-19]。TGF-β對腎臟的促纖維化作用可通過幾種可能的機制發(fā)生，例如肌成纖維細胞的激活、過度ECM沉積和抑制的ECM降解[20]。Smad構成了TGF-β信號通路的核心。TGF-β的激活會誘導Smad2/3的表達上調，從而促進腎纖維化。因此，抑制TGF-β和Smad2/3被認為是CKD治療中涉及的主要機制[13]。本文研究結果發(fā)現(xiàn)，UUO小鼠模型顯著上調TGF-β、Smad2/3和JNK的表達水平。與UUO模型小鼠相比，用甲潑尼龍治療的UUO小鼠腎臟中這些組分的表達量顯著降低了，這表明甲潑尼龍可以通過TGF-β/ Smad信號通路減輕UUO誘導的腎纖維化。

NF-κB是許多炎癥的重要調節(jié)因子。NF-κB通路在炎癥性腸病、類風濕性關節(jié)炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和哮喘等慢性炎癥疾病中發(fā)揮重要作用[21]。NF-κB可以被許多因素刺激，例如，組蛋白去乙酰化酶(HADC)。據(jù)報道，NF-κB的乙?；谡{節(jié)炎癥反應的強度、長度和特異性方面起著至關重要的作用[22]。NF-κB的賴氨酸殘基脫乙酰化在NF-κB介導的基因表達的調節(jié)中起關鍵作用[14]。因此，HDAC去除NF-κB的乙酰化，是影響NF-κB活性的一個重要機制。所以，HADC1通過影響NF-κB的表達，從而調控炎癥，影響腎纖維化機制。本文研究觀察到甲潑尼龍顯著降低了UUO小鼠模型中誘導的HADC1的蛋白質水平。同時，研究發(fā)現(xiàn)，與UUO模型小鼠相比，用甲潑尼龍治療的UUO小鼠腎臟中NF-κB的表達量明顯降低，這表明甲潑尼龍抑制HADC1的表達，其影響NF-κB的表達并最終改善腎臟炎癥，從而改善UUO誘導的腎纖維化。

綜上，本文研究結果表明甲潑尼龍可以通過TGF-β/Smad和NF-κB信號通路減輕UUO誘導的腎纖維化。