彭曉瀾，翁燁，黃立東，余波，陳秋雁，魏鼎泰

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是1993年P(guān)eter Agre發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞膜上可以快速輸送水分子的物質(zhì)[1]。研究表明[2]，AQPs的表達(dá)水平和分布情況與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是疾病過程中的關(guān)鍵分子靶點。多b值磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(MR diffusion weighted imaging，MR-DWI)水通道蛋白分子成像是近年來腦卒中研究領(lǐng)域中的新興技術(shù)。AQPs作為DWI-MR序列的報告基因已在Mukherjee等[3]的研究中得到證實，研究發(fā)現(xiàn)AQPs過表達(dá)可增加水的擴(kuò)散從而在MRI中產(chǎn)生信號對比而被檢測到，并觀察到AQP-MRI具有以下優(yōu)點：無創(chuàng)、實時、動態(tài)、高敏感性、安全。近年來研究[4]認(rèn)為b值越高，MR成像檢測的對象越接近AQPs內(nèi)轉(zhuǎn)運的水分子，這樣就可對AQPs的表達(dá)情況進(jìn)行定量評價。目前已有研究應(yīng)用AQP-MRI對離體組織[4]及肝臟纖維化動物模型進(jìn)行評估[5]，課題組前期應(yīng)用AQP-MRI對肢體遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理(limb remote preconditioning，LRP)動脈模型作了較深入的研究[6-7]，但AQP-MRI在腦卒中領(lǐng)域中的可視化研究尚未見報道。為此，本研究將AQP-MRI用于缺血性腦卒中的可視化成像評價，試圖將腦缺血病程中微觀信息通過AQP-MRI作直觀展示。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物由福建醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，健康成年雄性SD大鼠共25只，體重230～260 g，術(shù)前大鼠被安置在溫度、濕度可控的動物房里，允許自由攝食，不限制飲水。將25只大鼠隨機(jī)分為5組：1、3、6、24、48 h，每組各5只。本實驗通過動物倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2 大鼠短暫性腦缺血模型(middle cerebral artery occlusion，MCAo)的建立

線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型：用4%異氟烷吸入麻醉大鼠，麻醉成功后，用1.5%～2.5%異氟烷維持麻醉，分離出右側(cè)頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，夾閉頸內(nèi)動脈、頸總動脈，在頸外動脈遠(yuǎn)端分別結(jié)扎動脈，距離約1 cm，在兩處結(jié)扎中央剪斷頸外動脈，選擇直徑約0.26 mm的線栓自頸外動脈插入頸內(nèi)動脈約2 cm，60 min后退出線栓恢復(fù)再灌注。整個手術(shù)過程監(jiān)測直腸體溫，維持在36.2℃～37.2℃。應(yīng)用激光多普勒血流儀檢測大鼠腦血流灌注量，下降75%以上為建模有效。

假手術(shù)組：僅分離出右側(cè)頸部血管、剪斷頸外動脈，不做任何夾閉，暴露與上述手術(shù)所需相同時間后縫合切口。

1.3 MR掃描

采用3.0 T GE Discovery 750磁共振掃描儀，從退出線栓開始分別于1、3、6、24 h行MR掃描，使用4通道小動物頭部線圈(WK602，Magtron Tnc)，異氟烷麻醉成功后，將大鼠俯臥位固定于掃描支架上，頭置于線圈中央，整個掃描過程中保持1.5%～2.5%異氟烷持續(xù)吸入麻醉。掃描序列包括：①多b值DWI，共18個b值，分別為b=30、50、80、100、150、200、300、500、800、1000、1300、1700、2000、2500、3000、3500、4000、4500 s/mm2。掃描參數(shù)：FOV 10.0 cm×0.5 cm，層厚2.0 mm，TR 3300.0 ms，TE選最小單位，矩陣128×128，帶寬166.7，掃描時間6 min 43 s。②T2-FLAIR，采用快速自旋回波(fast spin echo，F(xiàn)SE)序列，掃描參數(shù)：FOV 10.0 cm×10.0 cm，層厚2.0 mm，TR 8450.0 ms，TE 145.0 ms，矩陣256×256，激勵次數(shù)1.00，帶寬62.50，翻轉(zhuǎn)角111°，掃描時間2 min 50 s。③常規(guī)DWI，掃描參數(shù)：FOV 6.0 cm×0.70 cm，層厚2.0 mm，TR 3300.0 ms，TE選最小單位，b=1000 s/mm2，矩陣128×128，帶寬125.0，掃描時間2 min 45 s。

1.4 MR數(shù)據(jù)分析

掃描完成后將原始圖像傳送至圖像存檔與傳輸系統(tǒng)(picture archiving and communication systems，PACS)及GE Aw Volume Share 5 后處理工作站，應(yīng)用Functool軟件進(jìn)行后處理，AQP-MR序列取b閾值為＞2000 s/mm2，即b=2000、2500、3000、3500、4000、4500 s/mm2，共6個b值擬合得到AQP-MR偽彩圖，測量各個序列每一層面病灶的相對面積，用病灶面積/同層面總面積百分比(%)表示，并且取連續(xù)5個層面，最后將所測得總面積除以5，用ra-T2-FLAIR、ra-DWI、ra-AQP表示。在T2-FLAIR及DWI序列高信號區(qū)畫感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，并采用鏡像法取對側(cè)相同區(qū)域ROI值，結(jié)果用rT2-FLAIR、rADC表示，為患側(cè)ROI值/對側(cè)鏡像ROI值(%)。分別測量24 h患側(cè)基底節(jié)區(qū)和同側(cè)遠(yuǎn)端皮層水通道蛋白表觀擴(kuò)散系數(shù)(AQP-apparent diffusivity coefficient，AQP-ADC)的ROI相對比值，用rAQP-ADC表示，為患側(cè)ROI值/對側(cè)鏡像ROI值(%)。以上測量均采取每個層面測量3次取平均值的方法。

1.5 梗死面積的測量

大鼠在恢復(fù)再灌注24 h行MRI檢查完畢后，麻醉，PBS (PH7.4)心臟灌注，斷頭，取腦，自額葉由前向后作冠狀切片(厚2 mm)，共計5片；切片隨后放入2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色染液室溫孵育20 min，4%多聚甲醛過夜；采用掃描儀采集圖像來測量梗死面積。應(yīng)用Image pro plus圖像分析軟件(Version 6.0，Media Cybernetics)對5張TTC染片掃描圖像描邊采集，分別測量梗死面積及該層面大腦總面積，取其平均值，結(jié)果以梗死面積/該層面總面積的百分比(%)來表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有計數(shù)資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x ±s)表示，使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用配對樣本t檢驗。TTC染色結(jié)果與MRI檢查結(jié)果相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點AQP-MRI對缺血病灶顯示情況

本研究展示再灌注后1、3、6、24 h，AQP-MRI、DWI及T2-FLAIR各序列缺血病灶情況(圖1)。與T2-FLAIR及DWI比較，AQP-MRI可更加敏感地顯示病灶，尤其在缺血早期，再灌注1 h，T2-FLAIR未見異常信號，DWI、AQP-MRI就可清晰顯示缺血灶；再灌注3 h，AQP-MRI顯示病灶面積較DWI大，且更多層次，AQP-ADC偽彩圖直觀顯示多層次色帶，不同色帶AQPADC值有差異，提示AQP-ADC可展示病灶內(nèi)部的微觀信息。

表1 不同時間點AQP-MRI與T2-FLAIR、DWI與T2-FLAIR不匹配面積比較Tab. 1 Comparison AQP-MRI/T2-FLAIR mismatch with DWI/T2-FLAIR mismatch areas in different time points after stroke

圖1 不同時間點AQP-MRI顯示缺血灶情況，與T2-FLAIR及DWI序列比較，AQP-MRI可更加敏感、多層次展示缺血灶，AQP-MRI偽彩圖還可顯示病灶內(nèi)微觀信息Fig. 1 AQP-MRI showed ischemic lesions in different time points. AQPMRI displayed ischemic stroke with multi-layer and more sensitively, compared with T2-FLAIR and DWI. AQP-MR pseudo-color images visualized microscopic information of the lesions.

2.2 24 h以內(nèi)，AQP-MRI與T2-FLAIR、DWI與T2-FLAIR不匹配面積比較

1、3、6、24 h時間點，ra-AQP與ra-T2-FLAIR面積差和ra-DWI與ra-T2-FLAIR面積差顯著不同(t=-5.969，P＜0.01)，并且6 h后，兩者面積差都迅速減小，至24 h相差無幾(表1、圖2、3)。本研究將AQPMRI與T2-FLAIR面積差定義為“水通道蛋白分子半暗帶”，與傳統(tǒng)定義的半暗帶，即DWI/T2-FLAIR不匹配面積作比較。結(jié)果表明，大鼠在MCAo后再灌注24 h內(nèi)都存在半暗帶，無論是AQP-MRI/T2-FLAIR不匹配還是DWI/T2-FLAIR不匹配都可顯示半暗帶。AQP-MRI/T2-FLAIR不匹配區(qū)域顯示的半暗帶比DWI/T2-FLAIR不匹配顯示的半暗帶范圍大。

2.3 1～6 h，AQP-MRI顯示病灶外周AQP-ADC值較對側(cè)相同區(qū)域增高

本研究觀察到大鼠取栓再灌注24 h，病灶幾乎累及大腦皮層。在1、3、6 h時間點， AQP-MRI顯示在病灶周圍正常腦實質(zhì)可檢測到AQP-ADC值較對側(cè)相同區(qū)域增高(圖4)。兩者間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.227，P=0.014)(圖5)。

2.4 24 h，AQP-MRI直觀顯示患側(cè)基底節(jié)區(qū)與同側(cè)遠(yuǎn)端皮層有差異

取栓后24 h，DWI及T2-FLAIR患側(cè)均呈大面積高信號，灰白質(zhì)缺乏對比，肉眼看不出信號的差別，但皮層及基底節(jié)區(qū)相對比值rADC與rT2-FLAIR卻存在差異(t=5.292，P=0.034；t=-50.909，P=0.000)。AQP-MR偽彩圖可清晰顯示皮層和基底節(jié)區(qū)存在差異，這一差異具有可視化特點(圖6)，計算AQP-ADC相對比值在皮層和基底節(jié)區(qū)分別為(67.67±1.53)%和(47±0)%，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.434，P=0.002)。

2.5 梗死面積與MRI檢查結(jié)果的相關(guān)性分析

取栓后24 h，TTC染色顯示梗死面積與MRI檢查結(jié)果一致(圖7)。TTC顯示梗死面積與AQP-MRI、DWI、T2-FLAIR測量梗死面積均無顯著性差異(t=1.208，P＞0.05；t=-0.413，P＞0.05；t=1.757，P＞0.05)。將TTC顯示的梗死面積分別與AQP-MRI、DWI、T2-FLAIR測量的梗死面積作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者間均有顯著相關(guān)性(r=0.903，P=0.004；r=0.935，P=0.02；r=0.872，P=0.054)(圖8)。

圖2 24 h內(nèi)AQP/T2-FLAIR不匹配區(qū)域面積變化圖 圖3 24 h內(nèi)DWI/T2-FLAIR不匹配區(qū)域面積變化圖 圖4 AQP-MRI顯示病灶周圍腦組織AQP-ADC值較對側(cè)相同區(qū)域增高(箭) 圖5 1～6 h，患側(cè)病灶周圍與對側(cè)相應(yīng)部位AQP-ADC值比較Fig. 2 Area change diagram of AQP/T2-FLAIR mismatch within 24 h after stroke. Fig. 3 Area change diagram of DWI/T2-FLAIR mismatch within 24 h after stroke. Fig. 4 The AQP-ADC values of peripheral to the lesion in the ipsilateral areas were much higher than that of in the contralateral areas (arrow). Fig. 5 Comparison AQP-ADC values of peripheral to the lesion in the ipsilateral areas with the contralateral side in 1—6 h after stroke.

圖6 取栓后24 h，T2-FLAIR及DWI顯示患側(cè)均呈大面積高信號，ADC圖顯示病灶擴(kuò)散受限、ADC值減低，但灰白質(zhì)缺乏對比。AQP-ADC可清晰顯示基底節(jié)區(qū)和同側(cè)遠(yuǎn)端皮層存在差異，具有可視化優(yōu)點Fig. 6 T2-FLAIR and DWI showed a large area of hyperintensity on affected side in 24 h after stroke. The ADC map showed restricted diffusion and the ADC value reduced. But the differences between white matter and gray matter lacked of contrast. The microscopic differences between the basal ganglia and ipsilateral distal cortex could be displayed visually in AQP-MR pseudo-color images.

圖7 取栓后24 h，TTC染色顯示的梗死面積與MRI結(jié)果對照Fig. 7 Comparison TTC staining with MR imagings of infarct size in 24 h after stroke.

3 討論

缺血性腦卒中致殘、致死率極高，嚴(yán)重危害人類健康。近年來，腦卒中死亡率有所下降，但發(fā)病率仍在上升[8]。對缺血性腦卒中成像以便臨床采取適合的治療措施，特別是早期識別缺血半暗帶對于篩選適合的患者行血管內(nèi)取栓治療是近年來關(guān)注的焦點[9]。多b值DWI-MR水通道蛋白分子成像技術(shù)是近年來新興的MR分子成像技術(shù)，是在DWI基礎(chǔ)上引入連續(xù)的、多個不同梯度b值獲得反映水分子在組織細(xì)胞中不同擴(kuò)散運動的分子譜[10]，b值越高，檢測的對象越接近AQPs內(nèi)轉(zhuǎn)運的水分子。本研究采用從30～4500 s/mm2共18個b值，后處理選用2000 s/mm2以上6個高b值擬合得到的AQP-ADC值，b值越高，MR檢測的對象越接近AQPs內(nèi)轉(zhuǎn)運的水分子微觀信息。

3.1 AQP-MRI對腦梗死病灶的可視化成像

本實驗再灌注24 h，DWI及T2-FLAIR患側(cè)均呈大面積高信號，肉眼看不出有信號的差別，因為灰白質(zhì)缺乏對比，但皮層與基底節(jié)區(qū)統(tǒng)計結(jié)果卻存在差異(P＜0.05和P＜0.001)。AQP-MRI可清晰顯示皮層和基底節(jié)區(qū)信號差異(P＜0.01)，這一差異具有可視化優(yōu)點。AQP-MRI后處理偽彩圖不僅可顯示病變范圍，還可以快速判斷組織的損傷程度和大致解剖部位，并可通過AQP-ADC值的測量來定量驗證，比T2-FLAIR、DWI更能反映缺血組織的實際生理情況而更具優(yōu)越性。以往對缺血性腦卒中，特別是缺血半暗帶的研究在很大程度上忽略了神經(jīng)解剖位置對預(yù)后的重要影響。常規(guī)的DWI序列對于腦灰白質(zhì)缺乏對比，而AQPMRI可以區(qū)分解剖部位，解剖定位可能在幫助進(jìn)一步細(xì)化缺血半暗帶和改善功能結(jié)局方面發(fā)揮作用[11]。在MCAo中梗死風(fēng)險最高的區(qū)域是紋狀體區(qū)[12]，由于側(cè)枝血液供應(yīng)不足，這一區(qū)域通常在MCAo中首先受到損害[13]。本研究觀察結(jié)果與以往文獻(xiàn)報道一致，即MCAo后首先出現(xiàn)的病灶都在基底節(jié)紋狀體區(qū)，隨時間的延長，范圍逐漸擴(kuò)大至皮層，并且紋狀體區(qū)AQP-ADC值降低幅度相對其他部位是最明顯的。

圖8 取栓后24 h，AQP-MRI、DWI及T2-FLAIR測量的梗死面積與TTC染色顯示的梗死面積相關(guān)性分析散點圖Fig. 8 Correlation analysis scatter plot of AQP-MRI, DWI, T2-FLAIR with TTC staining of infarct size in 24 h after stroke.

3.2 腦缺血早期，AQP-MRI對缺血半暗帶的顯示較DWI序列更具敏感性

缺血半暗帶最早由Astrup通過對狒狒的研究于1981年明確定義的，后來有學(xué)者將它定義為如果不能在有效時間窗內(nèi)改善腦血流灌注就可能發(fā)展為梗死的可逆性損傷區(qū)[14]。本研究把AQP-ADC值降低區(qū)域與T2-FLAIR高信號不匹配的區(qū)域近似地認(rèn)為是缺血半暗帶，并命名為“水通道蛋白分子半暗帶”。結(jié)果顯示在24 h內(nèi)，AQP/T2-FLAIR不匹配面積與DWI/T2-FLAIR不匹配面積之間差異顯著(P＜0.01)，面積圖顯示前者比后者顯示的面積大。AQP-MRI是在雙指數(shù)模型的基礎(chǔ)上成像的，比DWI單指數(shù)模型能更好地反映生物體內(nèi)復(fù)雜的信號衰減[15]，b值越高，MR檢測的對象越接近AQPs內(nèi)轉(zhuǎn)運的水分子微觀信息。AQP-MRI偽彩圖顯示病灶內(nèi)的色帶跨度大，較DWI序列有層次，測量不同色帶的AQP-ADC值，能體現(xiàn)出值的差異，而不論是DWI序列還是T2-FLAIR序列都無法實現(xiàn)這一可視化特點。AQP-MRI作為半暗帶外邊界，能可視化觀察腦梗死外帶區(qū)域的AQP-ADC值變化，而DWI則是綜合的表現(xiàn)。特別是在腦缺血早期，AQP-MRI對缺血半暗帶的顯示較DWI序列更具敏感性。

3.3 AQP-MRI可視化顯示半暗帶外周AQP-ADC值較對側(cè)相同區(qū)域增高

本研究觀察到再灌注24 h，病灶幾乎累及大腦皮層，24 h以內(nèi)存在缺血半暗帶，在1、3、6 h時間點，AQP-MRI顯示半暗帶周圍正常腦實質(zhì)可檢測到AQPADC值較對側(cè)相同區(qū)域增高(P＜0.05)。筆者推測這與再灌注后側(cè)枝血流的形成有一定關(guān)聯(lián)。半暗帶的演變?nèi)Q于半暗帶的位置、卒中發(fā)生的時間、側(cè)枝循環(huán)、再灌注及灰質(zhì)與白質(zhì)間梗死閾值的變化[16]。早在1953年，Vander Eecken 和Adams等解剖學(xué)家就強(qiáng)調(diào)了側(cè)枝循環(huán)在腦缺血病程中的重要性，指出動脈閉塞后，側(cè)枝血流將動態(tài)地補(bǔ)充血供到缺血半暗帶區(qū)以維持血流灌注。在腦卒中進(jìn)展過程中，梗死周圍區(qū)腦血流恢復(fù)和葡萄糖利用情況明顯優(yōu)于梗死核心區(qū)[11]。

3.4 AQP-MRI與TTC測量的腦梗死面積的相關(guān)性分析

本研究取栓后24 h，TTC染色顯示梗死面積與MRI檢查結(jié)果一致。TTC顯示梗死面積與AQP-MRI、DWI、T2-FLAIR測量梗死面積均無顯著性差異(P＞0.05)，且兩者間均有顯著相關(guān)性(r=0.903、0.935、0.872)。TTC染色被認(rèn)為是標(biāo)記腦梗死面積的可靠方法[17]。本實驗TTC用來表示腦組織存活力。在缺血性腦卒中早期，由于腦組織的脆性，TTC染色不能清晰地顯示腦梗死[18]。因此，本研究采用再灌注24 h后標(biāo)本行TTC染色，與MRI結(jié)果對照。T2-FLAIR、DWI顯示的腦梗死體積與組織學(xué)相關(guān)性已是毋庸置疑，T2-FLAIR高信號提示組織已發(fā)生壞死[19]，DWI異常信號區(qū)與動物腦卒中模型病理證實的腦梗死灶的部位和體積密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果與此前研究相一致，此外，本研究結(jié)果還顯示AQP-MRI與TTC染色結(jié)果也具有顯著相關(guān)性(r=0.903)，這說明AQP-MRI同DWI、T2-FLAIR序列一樣，可以反映腦梗死的組織存活能力。

本研究存在的不足：采用的動物模型為短暫性腦缺血模型，尚不能完全模擬人類腦卒中。雖然采用統(tǒng)一的建模標(biāo)準(zhǔn)，但由于存在個體差異，結(jié)果存在一定的偏倚。1 h以內(nèi)的超急性期AQP-MRI變化無法觀察到。AQP-MRI可視化成像展示的微觀信息，其病理生理機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究觀察到大鼠MCAo后，應(yīng)用AQPMRI技術(shù)可以直觀顯示梗死病灶的空間分布、病變范圍及嚴(yán)重程度，并可視化病變內(nèi)部微觀信息；特別在腦缺血早期，AQP-MRI對缺血半暗帶的顯示較DWI序列更具敏感性；半暗帶周圍的AQP-ADC值可能從側(cè)面反映側(cè)枝循環(huán)的情況。因此，AQP-MRI作為一種全新的可視化分子成像技術(shù)，可多層次、多角度實時動態(tài)評價缺血性腦卒中，為個體化診療提供了堅實保障，在腦卒中診斷領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

利益沖突：無。