邢桂榮，牛廣明，曲琳，謝生輝，喬鵬飛*

原發(fā)性癲癇是常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有致殘率高、病程長及易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者的生命健康[1]。因此，研究癲癇患者腦微觀結(jié)構(gòu)的病理生理學(xué)信息及其發(fā)生機(jī)制，為其診斷、預(yù)防與治療提供必要的理論依據(jù)至關(guān)重要。近年來，影像學(xué)技術(shù)逐漸被應(yīng)用于癲癇疾病的檢查中，并取得一定臨床應(yīng)用效果。擴(kuò)散峰度成像(diffuse kurtosis imaging，DKI)是較新的MRI序列，在動(dòng)物腦組織及一些臨床病變影像學(xué)研究中取得一定成果[2]。三維磁化強(qiáng)度預(yù)備梯度回波(3D-magnetization preparatory gradient echo，3D-MPRAGE)是臨床診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用手段，具有較高的時(shí)間及空間分辨率[3]。目前，鮮見有關(guān)采用包含DKI及3D-MPRAGE序列在內(nèi)的多模態(tài)功能MRI應(yīng)用于癲癇的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究在建立大鼠癲癇模型后，對(duì)其進(jìn)行多模態(tài)功能MRI及組織病理學(xué)分析，探究癲癇的發(fā)病機(jī)制及大鼠癲癇模型的多模態(tài)功能MRI與其病理組織學(xué)間的關(guān)系，旨在為臨床診斷及治療癲癇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3周齡健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量180～230 g，平均(205.23±14.18) g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2015-1106。先將大鼠置于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中大鼠自由飲水和進(jìn)食。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 動(dòng)物模型制備

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將大鼠分為正常對(duì)照組(n=30)及癲癇模型組(n=30)。癲癇模型組大鼠用于制備大鼠癲癇模型，模型建造參照文獻(xiàn)[4]所述方式：對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射6 mg/kg的KA(kainic)(10 mg/支，Sigma公司提供)，腹腔注射KA后30 min起至12 h內(nèi)觀察并記錄大鼠行為，按Racine的癲癇大鼠發(fā)作時(shí)行為學(xué)變化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷癲癇模型是否成功[5]，本研究癲癇模型組30只大鼠均建模成功。對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 大鼠MRI

1.3.1 MR成像

分別于致病后3 d、1周、3周、5周和8周取雌雄各3只進(jìn)行MRI檢測，同時(shí)取相同數(shù)量的正常大鼠作為空白對(duì)照掃描。釆用Discovery 750 3.0 T超導(dǎo)型磁共振掃描儀(美國GE公司)，四通道相控陣?yán)鲜笊漕l線圈，線圈規(guī)格為24 cm×10.5 cm×13 cm。掃描序列包括：冠狀面3D-MPRAGE、T1WI快速自旋回波(fast spin echo，F(xiàn)SE)、T2WI FLAIR，矢狀面T2WI FSE，冠狀面擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging，DWI)、擴(kuò)散張量成像(difussion tensor imaging，DTI)、DKI，體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)成像(intravoxel incoherent motion，IVIM)序列，DKI序列采集6個(gè)b值：0、500、1000、1500、2000、2500 s/mm2，25個(gè)擴(kuò)散敏感梯度方向。

1.3.2 MRI圖像處理及參數(shù)計(jì)算

采用MRIcro軟件，手動(dòng)勾畫大鼠腦內(nèi)感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)并對(duì)ROI中腦灰質(zhì)(gray matter，GM)和腦白質(zhì)(white matter，WM)中參數(shù)值進(jìn)行測量，同時(shí)參考3D-MPRAGE及大鼠常規(guī)MRI以確定解剖部位。大鼠腦內(nèi)ROI設(shè)定：參照大鼠解剖圖譜及文獻(xiàn)中方法，設(shè)定大鼠腦內(nèi)9組ROI。每個(gè)ROI測3次，ROI控制在4個(gè)體素左右。將DKI圖像數(shù)據(jù)傳輸至工作站采用Functool軟件處理數(shù)據(jù)，分別得到不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦部ROI區(qū)域不同部位表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)圖及DKI相關(guān)參數(shù)，包含各向異性分?jǐn)?shù)(fractional anisotropy，F(xiàn)A)、平均擴(kuò)散系數(shù)(mean diffusivity，MD)、平均擴(kuò)散峰度(mean kurtosis，MK)。

1.4 癲癇KA模型大鼠腦組織學(xué)檢查

分別在各時(shí)間點(diǎn)的擴(kuò)散模型成像技術(shù)檢查結(jié)束后，立即收集大鼠腦組織，行蘇木素-伊紅(HE)染色分析，置于顯微鏡下觀察并拍照。并隨機(jī)取海馬CA1區(qū)域5個(gè)及CA3區(qū)1個(gè)不連續(xù)高倍鏡視野，計(jì)算殘存正常神經(jīng)元數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，對(duì)于連續(xù)型資料以± s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠不同時(shí)期腦部MRI相關(guān)參數(shù)比較

隨著致病時(shí)間延長，正常對(duì)照組大鼠腦部FA、MD、MK無明顯差異(F=0.165、0.309、0.399，P＞0.05)；癲癇模型組大鼠腦部FA及MD逐漸降低(F=34.913、56.272，P＜0.05)，MK逐漸升高(F=41.971，P＜0.05)。在相同致病時(shí)間點(diǎn)，癲癇模型組大鼠腦部FA及MD均低于正常對(duì)照組，而MK高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 致病3 d后MRI觀察組大鼠腦組織

致病3 d后，癲癇模型組大鼠在MRI影像學(xué)檢查冠狀面、矢狀面T2WI序列，冠狀面T2WI-FLAIR及3D-MPRAGE圖像上均未出現(xiàn)明顯異常信號(hào)。見圖1。

2.3 兩組大鼠不同時(shí)期腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較

隨著致病時(shí)間的延長，正常對(duì)照大鼠腦部GM及WM區(qū)域內(nèi)FA、MD及MK均無明顯變化(P＞0.05)；癲癇模型組大鼠腦部GM及WM區(qū)域內(nèi)FA、MD均逐漸降低，而MK逐漸升高(P＜0.05)。見表2～6。

2.4 癲癇模型組大鼠腦部MRI相關(guān)參數(shù)與致病時(shí)間間的相關(guān)性分析

癲癇模型組大鼠腦部FA、MD與致病時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，MK與致病時(shí)間呈正相關(guān)(P＜0.05)。見表7。

表1 兩組大鼠不同時(shí)期腦部MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 1 Comparison on brain MRI related parameters in rats at different stages between the two groups (±s, n=6)

表1 兩組大鼠不同時(shí)期腦部MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 1 Comparison on brain MRI related parameters in rats at different stages between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，F(xiàn)A、MK無單位。

組別 3 d 1周FA MD MK FA MD MK正常對(duì)照組 0.35±0.05 0.76±0.07 0.78±0.06 0.36±0.04 0.78±0.08 0.75±0.06癲癇模型組 0.32±0.06 0.67±0.06 0.88±0.07 0.29±0.04 0.59±0.07 1.01±0.08 t值 0.941 2.391 2.657 3.00.3431 4.378 6.908 P值 0.369 0.038 0.024 0.013 0.001 0.000

續(xù)表1 兩組大鼠不同時(shí)期腦部MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 1(Cont) Comparison on brain MRI related parameters in rats at different stages between the two groups (±s, n=6)

續(xù)表1 兩組大鼠不同時(shí)期腦部MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 1(Cont) Comparison on brain MRI related parameters in rats at different stages between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，F(xiàn)A、MK無單位。

組別 3周 5周 8周FA MD MK FA MD MK FA MD MK正常對(duì)照組 0.34±0.05 0.76±0.07 0.76±0.05 0.35±0.05 0.79±0.08 0.79±0.09 0.36±0.06 0.75±0.06 0.78±0.05癲癇模型組 0.20±0.03 0.45±0.08 1.13±0.09 0.15±0.02 0.37±0.04 1.28±0.08 0.11±0.02 0.22±0.02 1.40±0.07 t值 5.881 7.143 8.803 9.097 11.502 9.968 9.682 20.527 17.654 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 兩組大鼠致病3 d腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 2 Comparison on MRI related parameters in pathogenic 3 days of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表2 兩組大鼠致病3 d腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 2 Comparison on MRI related parameters in pathogenic 3 days of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，F(xiàn)A、MK無單位。

組別 FA MD MK GM區(qū)域 WM區(qū)域 GM區(qū)域 WM區(qū)域 GM區(qū)域 WM區(qū)域正常對(duì)照組 0.34±0.06 0.36±0.05 0.75±0.06 0.77±0.06 0.77±0.07 0.77±0.06癲癇模型組 0.30±0.05 0.33±0.06 0.66±0.07 0.68±0.06 0.87±0.06 0.89±0.08 t值 1.255 0.941 2.391 2.598 2.657 2.939 P值 0.238 0.369 0.038 0.027 0.024 0.015

圖1 致病3 d后大鼠MRI成像圖片。A：冠狀面3D-MPRAGE；B：冠狀面FSE；C：冠狀面FLAIR T2WI；D：矢狀面FSE T2WIFig. 1 Pictures of routine MRI imaging of rats. A: 3D-MPRAGE of coronal plane; B: FSE of coronal plane; C: FLAIR T2WI of coronal plane; D: FSE T2WI of sagittal plane.

表3 兩組大鼠致病1周腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 3 Comparison on MRI related parameters in pathogenic 1 week of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表3 兩組大鼠致病1周腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 3 Comparison on MRI related parameters in pathogenic 1 week of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，F(xiàn)A、MK無單位。

組別 FA MD MK GM區(qū)域 WM區(qū)域 GM區(qū)域 WM區(qū)域 GM區(qū)域 WM區(qū)域正常對(duì)照組 0.36±0.06 0.35±0.05 0.77±0.06 0.79±0.07 0.77±0.08 0.77±0.06癲癇模型組 0.28±0.04 0.30±0.07 0.57±0.05 0.59±0.06 0.98±0.05 1.02±0.07 t值 2.717 1.424 6.273 5.314 5.453 6.642 P值 0.022 0.185 0.000 0.000 0.000 0.000

表4 兩組大鼠致病3周腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 4 Comparison on MRI related parameters in 3 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表4 兩組大鼠致病3周腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 4 Comparison on MRI related parameters in 3 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，F(xiàn)A、MK無單位。

組別 FA MD MK GM區(qū)域 WM區(qū)域 GM區(qū)域 WM區(qū)域 GM區(qū)域 WM區(qū)域正常對(duì)照組 0.34±0.06 0.34±0.05 0.75±0.08 0.77±0.07 0.79±0.05 0.78±0.06癲癇模型組 0.18±0.05 0.22±0.06 0.43±0.08 0.46±0.06 1.11±0.06 1.15±0.07 t值 5.018 3.764 6.928 8.236 10.036 9.830 P值 0.001 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 兩組大鼠致病5周腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 5 Comparison on MRI related parameters in 5 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表5 兩組大鼠致病5周腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 5 Comparison on MRI related parameters in 5 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

MD單位為×10-4 mm2/s，F(xiàn)A、MK無單位。

?

表6 兩組大鼠致病8周腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 6 Comparison on MRI related parameters in 8 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

表6 兩組大鼠致病8周腦部ROI區(qū)域不同部位MRI相關(guān)參數(shù)比較(±s，n=6)Tab. 6 Comparison on MRI related parameters in 8 weeks of rats brain ROI areas during different periods between the two groups (±s, n=6)

注：MD單位為×10-4 mm2/s，F(xiàn)A、MK無單位。

FA MD MK 組別 GM區(qū)域 WM區(qū)域 GM區(qū)域 WM區(qū)域 GM區(qū)域 WM區(qū)域

表7 癲癇模型組大鼠腦部MRI相關(guān)參數(shù)與致病時(shí)間間的相關(guān)性分析Tab. 7 Correlation analysis between brain MRI related parameters and pathogenic time in epilepsy model group

2.5 致病不同時(shí)間后各組大鼠殘存正常神經(jīng)元數(shù)量比較

致病8周后，正常對(duì)照組大鼠腦部組織可見大量正常神經(jīng)元，呈現(xiàn)淡粉色膠質(zhì)背景(圖2A)。癲癇模型組大鼠腦部組織出現(xiàn)變性壞死，神經(jīng)元腫脹，空泡變性，輪廓及核仁模糊，且可見淋巴細(xì)胞浸潤(圖2B～2D)。隨著致病時(shí)間延長，正常對(duì)照組大鼠殘存正常神經(jīng)元數(shù)量無明顯變化(P＞0.05)，癲癇模型組大鼠殘存正常神經(jīng)元數(shù)量逐漸降低(P＜0.05)。在致病相同時(shí)間點(diǎn)，癲癇模型組大鼠殘存正常神經(jīng)元數(shù)量明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)。見表8。

2.6 癲癇模型組大鼠腦部MRI相關(guān)參數(shù)與殘存正常神經(jīng)元數(shù)量相關(guān)性分析

圖2 致病8周后正常對(duì)照組(A)及癲癇模型組(B～D)大鼠腦部組織HE染色圖片F(xiàn)ig. 2 HE staining images of brain tissue in normal control group (A) and epilepsy model group (B—D) after 8 weeks of disease onset.

表8 致病不同時(shí)間后各組大鼠殘存正常神經(jīng)元數(shù)量比較(±s，n=6)Tab. 8 Comparison on number of remaining normal neurons after different pathogenic time points between the two groups (±s, n=6)

表8 致病不同時(shí)間后各組大鼠殘存正常神經(jīng)元數(shù)量比較(±s，n=6)Tab. 8 Comparison on number of remaining normal neurons after different pathogenic time points between the two groups (±s, n=6)

組別 3 d 1周 3周 5周 8周 F值 P值正常對(duì)照組 116.32±6.45 112.32±6.87 115.33±7.31 118.32±6.97 120.54±6.54 1.236 0.321癲癇模型組 89.36±6.21 62.33±5.96 41.25±4.75 26.33±3.48 12.32±2.65 239.033 0.000 t值 7.376 13.463 20.815 28.924 37.566 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表9 癲癇模型組大鼠腦部MRI相關(guān)參數(shù)與殘存正常神經(jīng)元數(shù)量相關(guān)性分析Tab. 9 Correlation between rat brain MRI related parameters and number of residual normal neurons in epilepsy model group

致病后不同時(shí)間點(diǎn)，癲癇模型組大鼠殘存正常神經(jīng)元數(shù)量與其腦部FA及MD均呈正相關(guān)(P＜0.05)，與MK呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。見表9。

3 討論

DKI作為一項(xiàng)新技術(shù)，是在DTI的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，能夠更加真實(shí)客觀地反映組織的微觀結(jié)構(gòu)[6]。癲癇的異常信號(hào)可擴(kuò)散到腦內(nèi)許多細(xì)微結(jié)構(gòu)中并誘導(dǎo)損傷，DKI可顯示這種細(xì)微結(jié)構(gòu)的改變[7]。在顯示病灶的微結(jié)構(gòu)信息中，其參數(shù)值對(duì)評(píng)價(jià)腦白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的變化更為敏感也更具有特異性，且不依賴組織結(jié)構(gòu)的空間方位、可避免圖像中混雜效應(yīng)的干擾，因而在評(píng)估癲癇進(jìn)程和治療中發(fā)揮著非常重要的作用[8]。3D-MPRAGE屬于T1加權(quán)快速容積MRI掃描技術(shù)，具有較高的空間分辨率和時(shí)間分辨率，偽影小，能三維顯示人腦內(nèi)部精細(xì)解剖結(jié)構(gòu)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括原發(fā)性癲癇)的診斷具有重要價(jià)值[9]。相比較于單一模式的MRI，包含DKI及3D-MPRAGE序列在內(nèi)的多模態(tài)功能MRI不僅能包含DTI模型所有的影像學(xué)信息，包含F(xiàn)A、MD等，同時(shí)還能檢測MK。相比較于FA、MD，MK的優(yōu)勢在于不依賴于組織結(jié)構(gòu)的空間方位，腦部GM及WM區(qū)域均可采用MK加以判定。此外，DKI及3D-MPRAGE序列的聯(lián)合檢測可顯著提升對(duì)微小病灶及病灶細(xì)節(jié)處的成像質(zhì)量，利于獲得更多的影像學(xué)信息。Chen等[10]研究也認(rèn)為，相比較于單一模型MRI，多模態(tài)功能MRI在癲癇的診斷中具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

在本研究中，癲癇模型組大鼠在MRI影像學(xué)檢查冠狀面、矢狀面T2WI序列，冠狀面T2WI-FLAIR圖像上均未出現(xiàn)明顯異常信號(hào)。但是病理組織學(xué)檢測結(jié)果顯示，癲癇模型組腦部組織出現(xiàn)變性壞死，神經(jīng)元腫脹，空泡變性，輪廓及核仁模糊，且可見淋巴細(xì)胞浸潤。而上述結(jié)果在多模態(tài)功能MRI的測量結(jié)果上可體現(xiàn)出來，癲癇模型組大鼠腦部GM及WM區(qū)域FA、MD均低于正常對(duì)照組，而MK明顯高于正常對(duì)照組，提示相比較于常規(guī)單一模式的MRI檢測，多模態(tài)功能MRI診斷癲癇準(zhǔn)確性更高，與Dupont等[11]研究結(jié)果相符。大量學(xué)者認(rèn)為采用KA誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型主要是引起類似于人類顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)的病理學(xué)改變及行為特征，但本研究多模態(tài)功能MRI結(jié)果顯示，信號(hào)異常并不局限于腦部組織海馬區(qū)，在基底節(jié)等GM區(qū)域及前聯(lián)合、胼胝體等WM區(qū)也出現(xiàn)明顯的參數(shù)異常[12]。而其原因可能在于海馬及杏仁核是異常神經(jīng)沖動(dòng)的起源，當(dāng)海馬及杏仁核出現(xiàn)異常后會(huì)向周圍發(fā)出異常神經(jīng)沖動(dòng)，而這種異常信號(hào)擴(kuò)散于周圍結(jié)構(gòu)及皮質(zhì)將導(dǎo)致癲癇的發(fā)作，形成“點(diǎn)燃”效應(yīng)。也就是說由于缺氧等原因造成的腦部組織損傷將導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的丟失及膠質(zhì)增生，從而誘發(fā)癲癇，引起腦部組織海馬及周圍區(qū)域影像學(xué)參數(shù)的變化，而這可能是癲癇發(fā)生的機(jī)制之一[13]。

組織病理學(xué)結(jié)果顯示，相比較于正常對(duì)照組，大鼠神經(jīng)腦部組織損傷程度隨著致病時(shí)間的延長而逐漸加重，與Wang等[14]研究結(jié)果相符。而本研究相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，癲癇模型組大鼠殘存正常神經(jīng)元數(shù)量與其腦部FA及MD均呈正相關(guān)，與MK呈負(fù)相關(guān)，提示多模態(tài)功能MRI檢測結(jié)果與癲癇大鼠組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯著相關(guān)，而多模態(tài)功能MRI可作為臨床診斷癲癇及評(píng)估其疾病嚴(yán)重程度的影像學(xué)方法之一。Rong等[15]研究顯示，顳葉癲癇患者存在一定程度的認(rèn)知功能障礙，MRI和DTI不僅能有效檢出患者腦組織的損傷部位，而且能用于評(píng)估患者腦損傷程度，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，癲癇的發(fā)病可能與腦部海馬及杏仁核異常神經(jīng)沖動(dòng)有關(guān)，采用多模態(tài)功能MRI所檢測的癲癇模型大鼠的FA、MD及MK與其腦組織病理學(xué)檢測結(jié)果顯著相關(guān)，多模態(tài)功能MRI可作為臨床診斷癲癇及評(píng)估其疾病嚴(yán)重程度的影像學(xué)方法之一。

利益沖突：無。